一种快速建立小鼠心肌梗死模型的改进方法

技术领域

本发明涉及模型建立技术领域，具体涉及一种快速建立小鼠心肌梗死模型的改进方法。

背景技术

随着社会经济的发展,心血管疾病发病率越来越高，心肌梗死是心血管疾病中危急重症，因此研究心肌梗死的病因及发病机制，建立动物心肌梗死模型必不可少。

为了更贴近临床国内外多采用结扎冠状动脉来建立心肌梗死模型，直视下的冠状动脉结扎最初适用于兔、猪和大鼠等中大型动物来完成，但实验动物费用较高，后采用小鼠进行心肌梗死模型时降低了实验成本但是死亡率又比较高。

在此基础上为了降低死亡率又加入了实验过程中进行气管插管或者气管切开的改进，有效的降低了死亡率。小鼠气管插管的难度高，操作时间久，有学者提出无需气管插管或者气管切开，用异氟烷和氧气面罩机械通气同时达麻醉和呼吸的效果，大大降低了操作时间和术后苏醒时间太长而引起的并发症。又有学者提出了不使用机械通气的方法，将小鼠心脏挤出胸腔进行直视下快速结扎左冠状动脉来降低胸腔内结扎穿破心房的发生。不使用机械通气将心脏挤出，进行快捷实验的方法，操作难度大，对操作者要求高。

发明内容

本发明意在提供一种快速建立小鼠心肌梗死模型的改进方法，以在无显微镜、呼吸机支持的情况下简单快速的建立小鼠心肌梗死模型的实验方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种快速建立小鼠心肌梗死模型的改进方法，包括如下步骤：

S1：准备实验动物，准备SPF级昆明小鼠n只，雌雄各半，6-10周龄，体重25-35克；

S2：呼吸麻醉装置制作，连接氧气袋和雾化吸入药瓶制作成为呼吸麻醉装置，将清洁棉球放置到雾化药物瓶的瓶底；

S3：取下面罩，将小鼠的脑袋塞进药物瓶吸嘴里，通过调节氧气袋的阀门控制进入药瓶的氧气速度和氧气量，再使用5ml注射器吸取0.5ml异氟烷由药瓶盖上的空隙添加到棉球上，直至浸有异氟烷的的棉球在药瓶底部挥发进入吸嘴，同时通过氧气袋给氧，直至小鼠达到稳定的麻醉状态。

优选的，作为一种改进，S3中，将氧气袋阀门开到最大，再将刚注射了异氟烷的药瓶吸嘴套在小鼠脑袋上，1-2min后小鼠便出现瘫软无力，此时固定小鼠四肢和尾巴呈仰卧位，再将阀门开到中间，维持小鼠呼吸平稳，直至小鼠进入稳定麻醉状态。

优选的，作为一种改进，还包括S4:(1)备皮：将已经固定好的小鼠左胸壁上的毛用剃毛刀剃干净，再用碘伏消毒；(2)皮肤切口：在3-4肋间隙位置，垂直于胸骨与腋前线做一横行切口，切口约1.5cm；(3)荷包缝合：沿着切口用3-0缝合线打一个荷包缝合松结备用；(4)暴露3-4肋间隙：沿切口处逐层剪开肌肉，显露出3-4肋间隙，此时即可见到胸腔内跳动的心脏与肺之间的红白交界处；(5)开胸：用眼科镊提起第4肋骨，沿着肋骨上缘剪开肋间肌，开口约0.5cm，显露心脏，撕开心包膜，暴露左心耳及左心室的交界处；(6)结扎冠状动脉：用左手中指抬起右胸廓，示指和拇指将心脏推挤到切口处，此时右胸廓夹在操作者的中指和示指之间，示指在右胸壁上，拇指在左胸壁，切口在示指和拇指之间；此时由于开胸大幅度跳动的心脏被固定在胸壁切口处，用6-0的带针缝合线结扎冠状动脉左前降支，深度约0.6mm；(7)关胸：剪断结扎冠脉的缝合线，迅速顺势挤出胸腔内的气体，拉紧荷包缝合，打结关胸，碘伏消毒，撤离面罩，停止麻醉；(8)苏醒：将固定小鼠的胶布撕下，使小鼠处于俯卧位或者右侧卧位于温暖的笼子里；(9)饲养与观察：将苏醒的小鼠饲养于恒温25摄氏度的动物房14天，给予充足的食物和水，以及清洁的垫料。

优选的，作为一种改进，用EDTA管收集眼球血，将血液样本在离心机中，转速4000r，时间10min离心，并将上层血清置于-80摄氏度的冰箱中保存。

优选的，作为一种改进，使用Elisa检测试剂盒，按照试剂盒上的说明书进行操作检测TNF-α、TGF-β和IL-10。

优选的，作为一种改进，使用心电图机，记录术前、术后1d肢体导联和胸导导联，以及M型超声心动图测量左心功能及室壁运动情况。

本方案的原理及优点是：1.通过自制麻醉呼吸装置，控制氧气和麻醉剂速度和剂量，有效的达到了小鼠稳定麻醉的效果，同时节约成本。

2.无需使用生物采集系统，而是使用人类的心电图机，调高敏感度，用针灸用针刺入小鼠与人相同的对应体表部位皮下，测得肢体导联和V1-V3导联心电图，结果可靠，使用简单可行。

3.实验方法的改进，在无需麻醉呼吸机，直视情况下进行小鼠心肌梗死模型的建立。一方面拥有了传统建模方法的操作难度小，适合所有需要建立小鼠心肌梗死模型的研究者的优点，同时解决了耗时长，实验室要求高，操作复杂的缺点。另一方面拥有了挤出心脏的新方法省时，无需气管插管，建模成功率高的优点，同时解决了操作难度大，技术要求高，需要大量练习的缺点。综上所述，本创新方法十分适用于大样本模型的研究和几乎所有的研究者和实验室进行。

附图说明

图1为本发明实施例中麻醉呼吸装置示意图；

图2为本发明实施例中小鼠进入稳定麻醉状态示意图；

图3为本发明实施例中备皮示意图；

图4为本发明实施例中皮肤切口示意图；

图5为本发明实施例中荷包缝合示意图；

图6为本发明实施例中开胸示意图；

图7为本发明实施例中结扎冠状动脉示意图；

图8为本发明实施例中关胸示意图；

图9为本发明实施例中心电图检测结果示意图；

图10为本发明实施例中心脏超声检测结果示意图；

图11为本发明实施例中心肌组织病理形态学检测结果示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

下面将结合发明实施例中的附图，对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

在发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对发明的限制。

实施例一

一种快速建立小鼠心肌梗死模型的改进方法，包括如下步骤：包括如下步骤：

S1：准备实验动物，准备SPF级昆明小鼠n只，雌雄各半，6-10周龄，体重25-35克,由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证：NO.SCXK(辽)2020---0001；

S2：呼吸麻醉装置制作，连接氧气袋和雾化吸入药瓶制作成为呼吸麻醉装置，将清洁棉球放置到雾化药物瓶的瓶底；

S3：如附图1，所示取下面罩，将小鼠的脑袋塞进药物瓶吸嘴里，通过调节氧气袋的阀门控制进入药瓶的氧气速度和氧气量，将氧气袋阀门开到最大，再将刚注射了异氟烷的药瓶吸嘴套在小鼠脑袋上，1-2min后小鼠便出现瘫软无力，此时固定小鼠四肢和尾巴呈仰卧位，再使用5ml注射器吸取0.5ml异氟烷由药瓶盖上的空隙添加到棉球上，直至浸有异氟烷的的棉球在药瓶底部挥发进入吸嘴，再将阀门开到中间，同时通过氧气袋给氧，直至小鼠达到稳定的麻醉状态。

具体操作如下：将氧气袋阀门开到最大，再将刚注射了异氟烷的药瓶吸嘴套在小鼠脑袋上，1-2min后小鼠便出现瘫软无力，此时固定小鼠四肢和尾巴呈仰卧位，再将阀门开到中间，维持小鼠呼吸平稳，直至小鼠进入稳定麻醉状态，如附图2所示。

S4：还包括S4:(1)备皮：将已经固定好的小鼠左胸壁上的毛用剃毛刀剃干净，再用碘伏消毒，如附图3所示；

(2)皮肤切口：在3-4肋间隙位置，垂直于胸骨与腋前线做一横行切口，切口约1.5cm，如附图4所示；

(3)荷包缝合：沿着切口用3-0缝合线打一个荷包缝合松结备用，如附图5所示；

(4)暴露3-4肋间隙：沿切口处逐层剪开肌肉，显露出3-4肋间隙，此时即可见到胸腔内跳动的心脏与肺之间的红白交界处；

(5)开胸：用眼科镊提起第4肋骨，如附图6所示，沿着肋骨上缘剪开肋间肌，开口约0.5cm，显露心脏，撕开心包膜，暴露左心耳及左心室的交界处；

(6)结扎冠状动脉：用左手中指抬起右胸廓，示指和拇指将心脏推挤到切口处，此时右胸廓夹在操作者的中指和示指之间，示指在右胸壁上，拇指在左胸壁，切口在示指和拇指之间，如附图7所示；此时由于开胸大幅度跳动的心脏被固定在胸壁切口处，用6-0的带针缝合线结扎冠状动脉左前降支，深度约0.6mm；

(7)关胸：剪断结扎冠脉的缝合线，迅速顺势挤出胸腔内的气体，拉紧荷包缝合，打结关胸，如附图8所示，碘伏消毒，撤离面罩，停止麻醉；

(8)苏醒：将固定小鼠的胶布撕下，使小鼠处于俯卧位或者右侧卧位于温暖的笼子里；

(9)饲养与观察：将苏醒的小鼠饲养于恒温25摄氏度的动物房14天，给予充足的食物和水，以及清洁的垫料。

S5：用EDTA管收集眼球血。将血液样本在离心机中，转速4000r，时间10min离心。将上层血清置于-80摄氏度的冰箱中保存；Elisa检测试剂盒(江苏酶免实业有限公司提供)，按照试剂盒上的说明书进行操作检测TNF-α、TGF-β和IL-10。

S6：将心电图机+针灸用针刺入相应肢体皮下，记录术前、术后1d肢体导联(I、II和III)+胸导(V1～V3)导联。M型超声心动图测量左心功能及室壁运动情况。

S7：Masson三色染色及计算AMI纤维化面积AMI纤维化面积统计方法Image-J，软件计算每个层面AMI后纤维化面积所占百分比，各层面百分比均值表示该样本AMI后纤维化面积的大小。

得出结果如下：

1.小鼠术后存活率及肌钙蛋白情况

术中死亡6只，术后死亡2只；其余22只存活，建模成功率为80％，术后1周小鼠成活率为73％。

与术前相比*P<0.05

2.心电图检测结果，如附图9所示，

术后1天ST段抬高值(U/MV,

与术前相比*P<0.05

3.心脏超声检测结果(±S)，如附图10所示

冠脉前降支结扎前后超声检查心功能改变(

与术前相比*P<0.05

4.心肌组织病理形态学检测结果，如附图11所示。

5.TNF-α和IL-10检测结果

心肌梗死后血清中细胞因子浓度(

与术前相比*P<0.05

结论如下：

术中死亡6只，术后死亡2只；其余22只存活，建模成功率为80％，术后1周小鼠成活率为73％。术后1天V1-V3导联心电图ST段明显抬高，肌钙蛋白明显升高，1周后超声检测显示EF＝42％，FS＝17％，(P﹤0.05),左室前壁运动幅度明显减低。肉眼可见梗死区颜色苍白，失去正常光泽，Masson色显示平均梗死后纤维化面积为(50±10)％(P﹤0.05)。7天后小鼠血清中TNF-α和IL-10浓度分别是88.7±10.5ng/L和20.3±1.9ng/L,与术前比较均明显提高,差异有统计学意义(P<0.05)。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。