一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法。

背景技术

大气细颗粒物(particulatematter2.5，PM2.5)是指大气中广泛存在的、动力学当量直径在2.5微米以下的颗粒物。随着经济及工业的快速发展，PM2.5已成为受到广泛关注的一类大气污染物。由于PM2.5具有成分复杂、体积小、比表面积大等特点，可吸附大量有毒有害物质并随气流到达呼吸道深部、沉积在肺泡，甚至透过气血屏障进入血管，对人体健康造成危害。大量流行病学数据表明，PM2.5浓度的升高与肺炎、哮喘、COPD等呼吸系统疾病的发病率、死亡率密切相关。研究发现，PM2.5导致细胞死亡的机制包括：①诱导自由基生成，引起细胞氧化应激反应；②破坏细胞内Ca

“如何抵御PM2.5的健康危害”是当前PM2.5健康效应研究中迫切需要解决的关键科学问题，但目前对于这一科学问题的研究尚不充分。作为人体的必需元素，硒是一种人类生长发育的必备微量元素，具有调控生物体内生殖、发育、代谢、免疫等过程的生物学机能。在生物活性成分中，硒大多以硒代蛋氨酸、硒多肽及硒蛋白的形式存在，其参与构成的硒酶、硒蛋白与生物的生长发育、免疫激活关系密切。尽管硒能否拮抗PM2.5导致的细胞死亡至今尚无定论，但是，有机物和重金属作为PM2.5的重要组成部分，已经被证明具有显著的细胞和遗传毒性，并且两者是PM2.5毒性的主要来源；同时，一些研究表明硒能够拮抗多种有机物和重金属导致的细胞死亡。中国发明专利ZL201910728019.0公开了用L-硒代蛋氨酸与T-2毒素(一种有机毒物，常见于田间作物或者库存谷物)共同处理猪肾(PK15)细胞后对细胞活性的影响，结果显示L-硒代蛋氨酸极大地提升了细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的表达水平，有效地降低了T-2毒素导致的细胞高死亡率；中国发明专利ZL201410003832.9涉及一种缓解铅毒性的富硒米肽酶解制备方法。通过将制备得到的富硒米肽和铅对小鼠巨噬细胞RAW264.7进行混合处理，极大地降低了铅导致的细胞死亡。此外，硒还能通过降低细胞内ROS含量、抑制细胞内炎症反应等多种方式，拮抗镉、铜等重金属导致的细胞死亡。

近年研究表明，硒与抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫力、预防心脑血管及退行性疾病、减弱重金属毒性等生物学功能相关。含硒化合物能够对抗多种毒物对人体造成的健康危害。与此同时，富硒植物的培育与种植技术已经相对成熟，因其工艺成本低、条件简单而得到广泛应用。综上，了解含硒化合物降低PM2.5对生物体的毒性作用，为寻找能够拮抗PM2.5毒性作用的富硒功能食品提供实验基础，在生物医学与营养保健领域具有重要的研究价值。

发明内容

本发明的目的在于解决硒的暴露方式是否与有效拮抗PM2.5导致的细胞死亡相关的问题，了解含硒化合物缓解PM2.5对生物体的毒性作用，提供一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法。

为了实现上述目的，本发明公开了一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，包括以下步骤：

S1：制备PM2.5储备液；

S2：将A549细胞在DMEM完全培养基中进行传代培养；

S3：对步骤S2中的细胞进行常规处理后，将细胞分为三组，分别标记为：处理组1，即不加入硒代蛋氨酸处理组；处理组2，即加入硒代蛋氨酸预处理组，预处理时间为9-12h；处理组3，即硒代蛋氨酸与PM2.5工作液混合处理组；

S4：待步骤S3中的三组细胞生长至对数生长期后，弃去所述步骤S3中处理组2各孔的培养基，加入含有硒代蛋氨酸的DMEM培养基；弃去所述步骤S3中处理组1和处理组3各孔培养基，加入DMEM完全培养基；

S5：待步骤S4进行9-12h后，弃去步骤S4中处理组1、处理组2和处理组3各孔的培养基后，分别向处理组1和处理组2加入含有不同浓度PM2.5工作液的DMEM完全培养基，向处理组3加入含有硒代蛋氨酸和不同浓度PM2.5工作液的DMEM培养基；

S6：待步骤S5中各组染毒结束后，检测细胞增殖活性，计算细胞存活率。。

所述步骤S1中PM2.5悬液的制备过程如下，利用PM2.5采样器将PM2.5收集到聚丙烯纤维滤膜上，将载有细颗粒物的滤膜剪成1cm

所述步骤S2、S4、S5中的DMEM培养基含10％胎牛血清、1×10

所述步骤S2中传代培养的条件为37℃，5％CO

所述步骤S3中的细胞进行常规处理的方法为：待步骤S2中细胞生长达到90％满度，弃去步骤S2中培养基，加入胰酶消化液收集细胞并计数，在收集好的细胞内加入DMEM完全培养基，将细胞稀释至适当浓度。

所述步骤S4、S5中硒代蛋氨酸浓度均采用20μM。

所述步骤S5中PM2.5工作液均采用0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL三种浓度。

所述步骤S6中染毒时间为24-48h。

所述步骤S6中通过MTT比色法进行实验后计算细胞存活率，具体过程如下：待各组染毒结束后，弃去步骤S5各孔的培养基，每孔依次加入含有1mg/mL MTT的培养基200μL，置于37℃培养箱中静置4h，弃去每孔培养基，依次加入DMSO200μL，置于摇床上缓慢震荡，显色30min，然后每孔用枪头取100μL上清液，转移至新孔板对应位置孔中，用酶标仪于490nm处测定吸光度，计算细胞存活率。

所述枪头包括依次联通的吸嘴区、容纳吸入液体的置液区、防止液体吸入移液枪的第一缓冲区、第二缓冲区、移液枪联通区，所述吸嘴区、置液区、第一缓冲区、第二缓冲区、移液枪联通区一体成型，所述吸嘴区前端设置有与针头过滤器连接的滤头接入端。

所述步骤S6中细胞存活率计算公式为：

细胞存活率(％)＝(As-Ab)/(Ac-Ab)×100％

As：实验孔(含处理细胞与DMSO)

Ac：对照孔(含未处理细胞与DMSO)

Ab：空白孔(仅含DMSO)

本发明使用MTT比色法进行细胞代谢活性的测定。该方法灵敏度高、经济。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，通过检测甲臜溶液的吸光度可间接反映活细胞数量。由于PM2.5通常是不透明的黑色颗粒物，在本发明实验中，传统MTT比色法的检测阶段会因为甲臜溶液中混入PM2.5颗粒导致吸光度发生改变，对结果产生影响。因此，本发明对传统MTT比色法进行了改良。

与现有技术比较，本发明的有益效果在于：

本发明选用聚丙烯纤维滤膜代替石英滤膜收集PM2.5，相比于石英滤膜，聚丙烯纤维滤膜成本更低，且满足本实验中所有条件要求；选用DMSO制备PM2.5储备液，相比于超纯水，DMSO可以在常温条件下保证无菌保存，避免反复冻融使PM2.5成分发生改变；特制枪头前端连接针头过滤器，可以过滤MTT比色法检测时孔板中混入的PM2.5颗粒物，避免因为PM2.5混入对实验结果造成影响。

本发明建立了硒代蛋氨酸拮抗PM2.5导致人II型肺泡上皮细胞系A549细胞毒性效应的暴露方法，在短期低剂量PM2.5暴露条件下，相比于其他预处理时间以及硒代蛋氨酸与PM2.5进行混合处理的方式，硒代蛋氨酸预处理9-12h的方式能够有效降低PM2.5对A549细胞存活率的影响。本发明较为全面地对比了多种处理方式对A549细胞存活率的影响，获得硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的最佳暴露方式和暴露时间；本发明提供的方法简单、易于操作、成本低、结果可靠，可对各种地区收集的PM2.5材料开展硒代蛋氨酸拮抗其导致细胞毒性效应的研究，适合大规模推广。

附图说明

图1为本发明特制枪头的结构示意图；

图2为本发明硒代蛋氨酸不同处理方式对PM2.524小时处理导致细胞毒性效应的实验现象图；

图3为本发明硒代蛋氨酸不同处理方式对PM2.548小时处理导致细胞毒性效应的实验现象图；

图4为本发明硒代蛋氨酸不同处理方式对PM2.5 24小时处理导致细胞毒性效应的结果统计图；

图5为本发明硒代蛋氨酸不同处理方式对PM2.5 48小时处理导致细胞毒性效应的结果统计图；

图6为本发明硒代蛋氨酸预处理不同时间拮抗PM2.5 48小时处理导致细胞毒性效应的结果统计图。

图中数字表示：

1-滤头接入端；2-吸嘴区；3-置液区；4-第一缓冲区；5-第二缓冲区；6-移液枪联通区。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

实施例1

一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，包括以下步骤：

步骤1：将100mgPM2.5粉末溶解于2mLDMSO溶液中，配置成浓度为50mg/mL的PM2.5储备液。

步骤2：A549细胞使用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清、1×10

步骤3：待细胞生长达到90％满度，弃去步骤2中培养基，加入胰酶消化液收集细胞并计数。在收集好的细胞内加入DMEM完全培养基，将细胞稀释至5×10

步骤4：待所述步骤3中的三组细胞生长至对数生长期后，弃去所述步骤3中处理组2各孔的培养基，加入含有硒代蛋氨酸的DMEM完全培养基；弃去所述步骤3中处理组1和处理组3各孔培养基，加入DMEM完全培养基；

步骤5：待步骤4进行12h后，弃去步骤4中处理组1和处理组2各孔的培养基，分别加入DMEM完全培养基、含有50μg/mLPM2.5的DMEM培养基、含有100μg/mLPM2.5的DMEM培养基；弃去步骤4中处理组3各孔的培养基，分别加入含有硒代蛋氨酸的DMEM完全培养基、含有硒代蛋氨酸和50μg/mL PM2.5的DMEM培养基、含有硒代蛋氨酸和100μg/mL PM2.5的DMEM培养基；

步骤6：待步骤5进行24h后，弃去步骤5中所有培养基，每孔依次加入含有1mg/mLMTT的培养基200μL，置于37℃培养箱中静置4h，弃去每孔培养基，依次加入DMSO 200μL，置于摇床上缓慢震荡，显色30min。

步骤7：每孔用特制枪头取100μL上清液，转移至新孔板对应位置孔中，用酶标仪于490nm处测定吸光度。按照以下公式计算细胞存活率：

细胞存活率(％)＝(A

As：实验孔(含处理细胞与DMSO)

Ac：对照孔(含未处理细胞与DMSO)

Ab：空白孔(仅含DMSO)

硒代蛋氨酸不同处理方式对PM2.524小时处理导致细胞毒性效应的实验现象图如图1所示，图中各组分别为：1-未经硒代蛋氨酸和PM2.5工作液处理组；2-20μM硒代蛋氨酸预处理12h且未经PM2.5工作液处理组；3-20μM硒代蛋氨酸处理24h且未经PM2.5工作液处理组；4-未经硒代蛋氨酸处理且经50μg/mL PM2.5工作液处理24h组；5-20μM硒代蛋氨酸预处理12h且经50μg/mL PM2.5工作液处理24h组；6-20μM硒代蛋氨酸和50μg/mL PM2.5工作液混合处理24h组；7-未经硒代蛋氨酸处理且经100μg/mL PM2.5工作液处理24h组；8-20μM硒代蛋氨酸预处理12h且经100μg/mL PM2.5工作液处理24h组；9-20μM硒代蛋氨酸和100μg/mLPM2.5工作液混合处理24h组。

以PM2.5浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制柱状图(如图4所示)，由图可知，相比于硒代蛋氨酸与PM2.5工作液混合处理组以及不加入硒代蛋氨酸处理组，硒代蛋氨酸预处理组细胞存活率显著升高。综上，硒代蛋氨酸预处理组对于PM2.5 24h染毒所导致的细胞毒性效应具有显著的拮抗作用。

特制枪头(如图1所示)包括依次联通的滤头接入端1、吸嘴区2、置液区3、第一缓冲区4、第二缓冲区5、移液枪联通区6。其中吸嘴区2、置液区3、第一缓冲区4、第二缓冲区5、移液枪联通区6一体成型，整体采用常见的PP(聚丙烯)材料制成。

滤头接入端1内径为1.0-1.5mm，外径为2.0-2.5mm，长度为6-8mm。滤头接入端1沿轴线方向从外及里内径逐渐增大。枪头通体内径为1.5-6mm。长度约为20-40mm。

在本发明中，特制枪头的用法如下：

移液枪接入移液枪联通区6；将用DMSO溶解的甲臜-DMSO溶液通过吸嘴区2吸入置液区3，后用针头过滤器连接滤头接入端1，使得溶液通过滤头接入端1接入的针头过滤器进入新孔板。

实施例2

一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，包括以下步骤：

步骤1：将100mgPM2.5粉末溶解于2mLDMSO溶液中，配置成浓度为50mg/mL的PM2.5储备液。

步骤2：A549细胞使用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清、1×10

步骤3：待细胞生长达到90％满度，弃去步骤2中培养基，加入胰酶消化液收集细胞并计数。在收集好的细胞内加入DMEM完全培养基，将细胞稀释至5×10

步骤4：待所述步骤3中的三组细胞生长至对数生长期后，弃去所述步骤3中处理组2各孔的培养基，加入含有硒代蛋氨酸的DMEM完全培养基；弃去所述步骤3中处理组1和处理组3各孔培养基，加入DMEM完全培养基；

步骤5：待步骤4进行12h后，弃去步骤4中处理组1和处理组2各孔的培养基，分别加入DMEM完全培养基、含有50μg/mL PM2.5的DMEM培养基、含有100μg/mL PM2.5的DMEM培养基；弃去步骤4中处理组3各孔的培养基，分别加入含有硒代蛋氨酸的DMEM完全培养基、含有硒代蛋氨酸和50μg/mL PM2.5的DMEM培养基、含有硒代蛋氨酸和100μg/mL PM2.5的DMEM培养基；

步骤6：待步骤5进行48h后，弃去步骤5中所有培养基每孔依次加入含有1mg/mLMTT的培养基200μL，置于37℃培养箱中静置4h，弃去每孔培养基，依次加入DMSO 200μL置于摇床上缓慢震荡，显色30min。

步骤7：每孔用特制枪头取100μL上清液，转移至新孔板对应位置孔中，用酶标仪于490nm处测定吸光度。按照以下公式计算细胞存活率：

细胞存活率(％)＝(A

As：实验孔(含处理细胞与DMSO)

Ac：对照孔(含未处理细胞与DMSO)

Ab：空白孔(仅含DMSO)

硒代蛋氨酸不同处理方式对PM2.548小时处理导致细胞毒性效应的实验现象图如图3所示，图中各组分别为：1-未经硒代蛋氨酸和PM2.5工作液处理组；2-20μM硒代蛋氨酸预处理12h且未经PM2.5工作液处理组；3-20μM硒代蛋氨酸处理48h且未经PM2.5工作液处理组；4-未经硒代蛋氨酸处理且经50μg/mL PM2.5工作液处理48h组；5-20μM硒代蛋氨酸预处理12h且经50μg/mL PM2.5工作液处理48h组；6-20μM硒代蛋氨酸和50μg/mL PM2.5工作液混合处理48h组；7-未经硒代蛋氨酸处理且经100μg/mL PM2.5工作液处理48h组；8-20μM硒代蛋氨酸预处理12h且经100μg/mL PM2.5工作液处理48h组；9-20μM硒代蛋氨酸和100μg/mLPM2.5工作液混合处理48h组。

以PM2.5浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制柱状图(如图5所示)，由图可知，相比于硒代蛋氨酸与PM2.5工作液混合处理组以及不加入硒代蛋氨酸处理组，硒代蛋氨酸预处理组细胞存活率显著升高。综上，硒代蛋氨酸预处理组对于PM2.5 48h染毒所导致的细胞毒性效应具有显著的拮抗作用。

实施例3

一种硒代蛋氨酸拮抗PM2.5细胞毒性效应的暴露方法，包括以下步骤：

步骤1：将100mgPM2.5粉末溶解于2mLDMSO溶液中，配置成浓度为50mg/mL的PM2.5储备液。

步骤2：A549细胞使用DMEM完全培养基(含10％胎牛血清、1×10

步骤3：待细胞生长达到90％满度，弃去步骤2中培养基，加入胰酶消化液，收集细胞并计数。在收集好的细胞内加入DMEM完全培养基，将细胞稀释至5×10

步骤4：待所述步骤3中的两组细胞生长至对数生长期后，弃去所述步骤3中处理组2各孔的培养基，加入含有硒代蛋氨酸的DMEM完全培养基；弃去所述步骤3中处理组1各孔培养基，加入DMEM完全培养基；

步骤5：待步骤4进行0h、3h、6h、9h、12h后，弃去步骤4中处理组1和处理组2各孔的培养基，分别加入DMEM完全培养基和含有100μg/mL PM2.5的DMEM培养基；

步骤6：待步骤5进行48h后，弃去步骤5各孔培养基，依次加入含有1mg/mL MTT的培养基200μL，置于37℃培养箱中静置4h，弃去每孔培养基，依次加入DMSO 200μL置于摇床上缓慢震荡，显色30min。

步骤7：每孔用特制枪头取100μL上清液，转移至新孔板对应位置孔中，用酶标仪于490nm处测定吸光度。按照以下公式计算细胞存活率：

细胞存活率(％)＝(A

As：实验孔(含处理细胞与DMSO)

Ac：对照孔(含未处理细胞与DMSO)

Ab：空白孔(仅含DMSO)

以硒代蛋氨酸预处理时间为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制柱状图(如图6所示)，图中为各处理组吸光度与未经PM2.5工作液处理和硒代蛋氨酸预处理组吸光度的比值。由图可知，相比于仅PM2.5工作液处理组(硒代蛋氨酸预处理0h组)，硒代蛋氨酸预处理9h、12h组，细胞存活率明显升高；而硒代蛋氨酸预处理3h、6h组，细胞存活率升高不明显。因此，硒代蛋氨酸预处理组对于PM2.5 48h染毒处理的细胞毒性效应具有拮抗作用，且硒代蛋氨酸预处理时间最好为9-12h。

综上所述，本发明提供的硒代蛋氨酸拮抗PM2.5导致人II型肺泡上皮细胞系A549细胞毒性效应的暴露方法，证实在短期低剂量PM2.5暴露条件下，硒代蛋氨酸9-12h预处理能够切实降低PM2.5对A549细胞存活率的影响，优于其他预处理时间以及硒代蛋氨酸与PM2.5进行混合处理的方式。这种高效的暴露方式有效地降低了实验中硒代蛋氨酸处理方式的时间成本，方法简单、易于操作、成本低、结果可靠，可对各种地区收集的PM2.5材料开展硒代蛋氨酸拮抗其导致细胞毒性效应的研究，适合大规模推广。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。