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二价靶向缀合物

文献发布时间：2023-06-19 12:07:15

相关申请的交叉引用

本专利要求2018年11月2日提交的美国申请号62/755,179的优先权益，所述申请以引用的方式并入文本中。

背景技术

自从Ashwell和Morell的开创性论文阐明去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)在循环糖蛋白的识别和转运中的作用以来，这种受体已经成为深入研究的重点(D'Souza等,2015,J.Control Release,203,126-139)。肝细胞表面上的高水平表达使这种受体成为肝特异性递送剂的诱人靶标。所述受体具有选择性结合N-乙酰半乳糖胺的三价碳水化合物结合结构域。一般公认的规则是，对靶向配体的结合亲和力按以下顺序随着GalNac单元数的增加而增加：六个GalNac单元大于四个GalNac单元，四个GalNac单元大于三个GalNac单元，三个GalNac单元大于两个GalNac单元，两个GalNac单元大于一个GalNAc单元(Meier等,2000,JMol Biol,300,857-865；Spiess M,1990,Biochemistry,29,43,10009-10018；Grewal P.,2010,Methods in Enzymology,479,223-241；Lee等,1983,J Biol Chem,258,1,199-202；以及Valentijn等,1997,Tetrahedron,53,2,759-770)。

在大多数情况下，可能涉及多齿靶向配体的化学合成，这需要多个合成步骤(有时在20个到30个之间)。这会影响制造要求和商品成本。此外，GalNAc/siRNA缀合物的合成通常在固定的可控孔度玻璃(CPG)支撑物上进行。接近支撑物上的反应性位点与孔径有关，因此受到接近位点的分子大小的不利影响。靶向配体大小(单糖单元数、分子量、分子半径等)的增加会对支撑物上的负载效率产生不利影响。因此，目前需要具有有用的递送特性，但较易制备，制备较便宜，分子量较低，和/或负载效率较高的靶向配体。

发明内容

已经鉴定了含有两个糖基(例如，N-乙酰半乳糖胺部分)的双齿GalNac靶向配体，所述靶向配体的靶向活性与已知的三触角和四触角配体一样好或优于三触角和四触角配体。这些双齿靶向配体一般具有较短的合成途径，使得总合成效率较高。另外，双齿靶向配体的较小分子大小允许较多渗透至CPG上，使得与一些三触角和四触角配体相比，负载水平约高30-50％。另外，与三触角和四触角配体相比，双齿靶向配体具有简化的分析，这可加快ADME毒性研究和相关研究活动。本发明提供了双齿靶向配体、这些双齿靶向配体的核酸缀合物、包含双齿靶向配体和缀合物的组合物，以及用双齿缀合物靶向治疗性核酸的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了式(I)缀合物：

其中：

B是5-10元芳基或5-10元杂芳基，所述5-10元芳基或5-10元杂芳基任选地被一个或多个独立地选自由卤基、羟基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、(C

A不存在，是3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；

每个R

n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

或所述缀合物的盐。

本发明还提供了包含如本文所描述的式I缀合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明还提供了可用于制备式I缀合物的本文所公开的合成中间体和方法。

本发明的其它目的、特征和优点将由本领域技术人员从以下详述和图式中显而易见。

具体实施方式

除非另外指明，否则如本文所用的以下术语具有赋予它们的含义。

术语“烷氧基”和“烷硫基”以其常规含义使用，并且是指经由氧原子(“氧基”)或硫基与分子的其余部分连接的那些烷基，并且进一步包括其单卤化和多卤化变体。

除非另外规定，否则本身或作为另一个取代基的一部分的术语“烷基”意指具有指定碳原子数的直链或支链烃基(即，C

术语“动物”包括哺乳动物物种，例如人类、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、兔、家畜等。

如本文所用的术语“芳基”是指单个全碳芳环或多个稠合全碳环系统，其中至少一个环是芳香族的。举例来说，在某些实施方案中，芳基具有6至20个碳原子、6至14个碳原子、6至12个碳原子或6至10个碳原子。芳基包括苯基。芳基还包括具有约9至20个碳原子的多个稠合碳环系统(例如，包含2、3或4个环的环系统)，其中至少一个环是芳香族的并且其中其它环可以是芳香族的或非芳香族的(例如，环烷基)。当价数要求允许时，多个稠环系统的环可以经由稠合键、螺键和桥键相互连接。应了解，如上文所定义的多个稠环系统的连接点可以在环系统的任何位置，包括环的芳香族或碳环部分。芳基的非限制性实例包括但不限于苯基、茚基、茚满基、萘基、1,2,3,4-四氢萘基、蒽基等。

术语“环烷基”是指具有3至8个碳原子的饱和或部分不饱和(非芳香族)全碳环(即，(C

术语“基因”是指包含产生多肽或前体多肽所必需的部分长度或整个长度的编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。

如本文所用的“基因产物”是指基因的产物，例如RNA转录物或多肽。

除非另外规定，否则术语“卤基”或“卤素”意指氟、氯、溴或碘原子。

如本文所用的术语“杂芳基”是指在环中具有至少一个除碳以外的原子的单个芳环，其中所述原子选自由氧、氮和硫组成的组；“杂芳基”还包括具有至少一个此种芳环的多个稠环系统，所述多个稠环系统在下文进一步描述。因此，“杂芳基”包括约1至6个碳原子和约1-4个选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子的单个芳环。硫和氮原子也可以呈氧化形式存在，前提条件是，环是芳香族的。示例性杂芳基环系统包括但不限于吡啶基、嘧啶基、恶唑基和呋喃基。“杂芳基”还包括多个稠环系统(例如，包含2、3或4个环的环系统)，其中如上文所定义的杂芳基与一个或多个选自环烷基、芳基、杂环和杂芳基的环稠合。应了解，杂芳基或杂芳基多个稠环系统的连接点可以在杂芳基或杂芳基多个稠环系统的任何适合的原子上，包括碳原子和杂原子(例如，氮)。示例性杂芳基包括但不限于吡啶基、吡咯基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡唑基、噻吩基、吲哚基、咪唑基、三唑基、四唑基、恶唑基、异恶唑基、噻唑基、呋喃基、恶二唑基、噻二唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻唑基、苯并恶唑基、吲唑基、喹恶啉基和喹唑啉基。

术语“杂环”是指在环中具有至少一个除碳以外的原子的单个饱和或部分不饱和环，其中所述原子选自由氧、氮和硫组成的组；所述术语还包括具有至少一个此种饱和或部分不饱和环的多个稠环系统，所述多个稠环系统在下文进一步描述。因此，所述术语包括在环中具有约1至6个碳原子和约1至3个选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子的单个饱和或部分不饱和环(例如，3、4、5、6或7元环)。硫和氮原子也可以呈其氧化形式存在。示例性杂环包括但不限于氮杂环丁烷基、四氢呋喃基和哌啶基。术语“杂环”还包括多个稠环系统(例如，包含2、3或4个环的环系统)，其中单个杂环(如上文所定义)可以与一个或多个选自环烷基、芳基和杂环的基团稠合以形成多个稠环系统。当价数要求允许时，多个稠环系统的环可以经由稠合键、螺键和桥键相互连接。应了解，多个稠环系统的各个环可以相对于彼此以任何顺序连接。还应了解，多个稠环系统(如上文对于杂环所定义)的连接点可以在多个稠环系统的任何位置，包括环的杂环、芳基和碳环部分。在一个实施方案中，术语杂环包括3-15元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括3-10元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括3-8元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括3-7元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括3-6元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括4-6元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括包含1至4个杂原子的3-10元单环或双环杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括包含1至3个杂原子的3-8元单环或双环杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括包含1至2个杂原子的3-6元单环杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括包含1至2个杂原子的4-6元单环杂环。示例性杂环包括但不限于氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、高哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、四氢呋喃基、二氢恶唑基、四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、1,2,3,4-四氢喹啉基、苯并恶嗪基、二氢恶唑基、苯并二氢吡喃基、1,2-二氢吡啶基、2,3-二氢苯并呋喃基、1,3-苯并二氧杂环戊烯基、1,4-苯并二恶烷基、螺[环丙烷-1,1'-异吲哚啉基]-3'-酮、异吲哚基-1-酮、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚基、咪唑烷-2-酮咪唑烷、吡唑烷、丁内酰胺、戊内酰胺、咪唑烷酮、乙内酰脲、二氧杂环戊烷、邻苯二甲酰亚胺和1,4-二恶烷。

术语“糖”包括单糖、二糖和三糖，所有这些都可以任选地被取代。所述术语包括葡萄糖、蔗糖果糖、半乳糖和核糖，以及脱氧糖，例如脱氧核糖和氨基糖，如半乳糖胺。糖衍生物可以如国际专利申请公布号WO 96/34005和97/03995中所描述来方便地制备。糖可以方便地通过醚键、硫醚键(例如，S-糖苷)、胺氮(例如，N-糖苷)或碳-碳键(例如，C-糖苷)与式I化合物的其余部分连接。在一个实施方案中，糖可以方便地通过醚键与式I化合物的其余部分连接。

如本文所用的术语“小干扰RNA”或“siRNA”是指当siRNA与靶基因或序列处于同一细胞中时，能够减少或抑制靶基因或序列的表达(例如，通过介导与siRNA序列互补的mRNA的降解或抑制与siRNA序列互补的mRNA的翻译)的双股RNA(即，双链体RNA)。siRNA可以与靶基因或序列具有实质或完全同一性，或可以包含错配区(即，错配基序)。在某些实施方案中，siRNA的长度可以为约19-25个(双链体)核苷酸，并且长度优选地为约20-24个、21-22个或21-23个(双链体)核苷酸。siRNA双链体可以包含约1至约4个核苷酸或约2至约3个核苷酸的3'突出端和5'磷酸末端。siRNA的实例包括但不限于由分开的两股分子组装的双股多核苷酸分子，其中一股是有义股并且另一股是互补的反义股。

在某些实施方案中，siRNA的一股或两股上的5'和/或3'突出端包含1-4个(例如，1、2、3或4个)修饰和/或未修饰的脱氧胸苷(t或dT)核苷酸，1-4个(例如，1、2、3或4个)修饰(例如，2'OMe)和/或未修饰的尿苷(U)核糖核苷酸，和/或1-4个(例如，1、2、3或4个)与靶序列(例如，反义股中的3'突出端)或其互补股(例如，有义股中的3'突出端)具有互补性的修饰(例如，2'OMe)和/或未修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。

优选地，siRNA是化学合成的。siRNA还可以通过用大肠杆菌RNase III或Dicer使较长的dsRNA(例如，长度大于约25个核苷酸的dsRNA)裂解而产生。这些酶将dsRNA加工成生物活性siRNA(参见例如Yang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:9942-9947(2002)；Calegari等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14236(2002)；Byrom等,Ambion TechNotes,10(1):4-6(2003)；Kawasaki等,Nucleic Acids Res.,31:981-987(2003)；Knight等,Science,293:2269-2271(2001)；以及Robertson等,J.Biol.Chem.,243:82(1968))。优选地，dsRNA的长度为至少50个核苷酸至约100、200、300、400或500个核苷酸。dsRNA的长度可以长达1000、1500、2000、5000个核苷酸或更长。dsRNA可以编码整个基因转录物或部分基因转录物。在某些情况下，siRNA可以由质粒编码(例如，转录为自动折叠成具有发夹环的双链体的序列)。

短语“抑制靶基因的表达”是指本发明的siRNA使靶基因的表达沉默、减少或受抑制的能力。为了检查基因沉默的程度，将测试样品(例如，来自表达靶基因的所关注的生物体的生物样品，或表达靶基因的培养细胞样品)与使靶基因的表达沉默、减少或受抑制的siRNA接触。将测试样品中的靶基因的表达与不接触siRNA的对照样品(例如，来自表达靶基因的所关注的生物体的生物样品，或表达靶基因的培养细胞样品)中的靶基因的表达进行比较。可以给对照样品(例如，表达靶基因的样品)指定100％的值。在特定实施方案中，当相对于对照样品(例如，仅缓冲液、靶向不同基因的siRNA序列、加扰的siRNA序列等)，测试样品的值为约100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％时，达成靶基因表达的沉默、抑制或减少。适合的测定包括但不限于使用本领域技术人员已知的技术检查蛋白质或mRNA水平，例如，斑点印迹、诺瑟印迹(Northern blot)、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶功能以及本领域技术人员已知的表型测定。

治疗性核酸(例如siRNA)的“有效量”或“治疗有效量”是足以产生所需作用的量，所述作用例如与不存在siRNA的情况下所检测的正常表达水平相比，靶序列的表达受抑制。在特定实施方案中，当相对于对照(例如，仅缓冲液、靶向不同基因的siRNA序列、加扰的siRNA序列等)，用siRNA获得的值为约100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％时，达成靶基因或靶序列表达的抑制。用于测量靶基因或靶序列表达的适合的测定包括但不限于使用本领域技术人员已知的技术检查蛋白质或mRNA水平，例如，斑点印迹、诺瑟印迹、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶功能以及本领域技术人员已知的表型测定。

如本文所用的术语“核酸”是指呈单股或双股形式的含有至少两个核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物，并且包括DNA和RNA。“核苷酸”含有糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，所述嘌呤和嘧啶进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，包括但不限于安置新的反应基团，例如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸盐和烷基卤的修饰。核酸包括含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸类似的结合特性。此类类似物和/或修饰的残基的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。另外，核酸可以包含一个或多个UNA部分。

术语“保护基”是指通常用于封闭或保护化合物上的特定官能团的取代基。举例来说，“氨基保护基”是封闭或保护化合物中的氨基官能团的与氨基连接的取代基。适合的氨基保护基包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧羰基(BOC)、苯甲氧羰基(CBZ)和9-芴基亚甲氧羰基(Fmoc)。类似地，“羟基保护基”是指封闭或保护羟基官能团的羟基的取代基。适合的保护基包括乙酰基、硅烷基和2,2-二甲氧基丙烯。“羧基保护基”是指封闭或保护羧基官能团的羧基的取代基。常见的羧基保护基包括苯基磺酰基乙基、氰基乙基、2-(三甲基硅烷基)乙基、2-(三甲基硅烷基)乙氧基甲基、2-(对甲苯磺酰基)乙基、2-(对硝基苯基亚磺酰基)乙基、2-(二苯基膦基)-乙基、硝基乙基等。关于保护基及其使用的一般描述，参见P.G.M.Wuts和T.W.Greene,Greene's Protective Groups in Organic Synthesis第4版,Wiley-Interscience,New York,2006。

术语“合成活化基团”是指可以与原子连接来活化那个原子以使其与另一个反应基团形成共价键的基团。应了解，合成活化基团的性质可以取决于其活化的原子。举例来说，当合成活化基团与氧原子连接时，合成活化基团是将活化那个氧原子以与另一个反应基团形成键(例如，酯、氨基甲酸酯或醚键)的基团。此类合成活化基团是已知的。可以与氧原子连接的合成活化基团的实例包括但不限于乙酸酯基、琥珀酸酯基、三氟甲磺酸酯基和甲磺酸酯基。当合成活化基团与羧酸的氧原子连接时，合成活化基团可以是可衍生自已知偶联试剂(例如，已知酰胺偶联试剂)的基团。此类偶联试剂是已知的。此类偶联试剂的实例包括但不限于N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、羟基苯并三唑(HOBt)、碳酸N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙酯(EDC)、六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲氨基)磷(BOP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯基磷(PyBOP)、六氟磷酸(1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物(HATU)、丙基膦酸酐溶液(T3P)或六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲(HBTU)。

核酸

术语“核酸”包括任何寡核苷酸或多核苷酸，其中含有至多60个核苷酸的片段一般称为寡核苷酸，且更长的片段称为多核苷酸。脱氧核糖寡核苷酸由称为脱氧核糖的5-碳糖组成，所述5-碳糖在这种糖的5'和3'碳上与磷酸共价连接，以形成交替的无支链聚合物。DNA可以是例如反义分子、质粒DNA、预缩合DNA、PCR产物、载体、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些基团的衍生物和组合的形式。核糖寡核苷酸由类似的重复结构组成，其中5-碳糖是核糖。RNA可以是例如小干扰RNA(siRNA)、Dicer-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)、自扩增RNA(saRNA)和它们的组合的形式。因此，在本发明的上下文中，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)连接组成的核苷酸或核苷单体的聚合物或寡聚物。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”还包括包含具有类似功能的非天然存在的单体或其部分的聚合物或寡聚物。此类修饰或取代的寡核苷酸通常优于天然形式，这是由于其特性，例如增强的细胞摄取、降低的免疫原性和在核酸酶存在下增加的稳定性。

除非另外指示，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体来说，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来达成(Batzer等人,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。

在某些实施方案中，本文所描述的双齿靶向配体可以与核酸缀合。在某些实施方案中，核酸是本文所描述的核酸。举例来说，本文所用的核酸可以是单股DNA或RNA，或双股DNA或RNA，或DNA-RNA杂交体。双股RNA的实例在本文中描述，并且包括例如siRNA和其它RNAi剂，例如aiRNA和前体miRNA。单股核酸包括例如反义寡核苷酸、核酶、成熟miRNA和形成三链体的寡核苷酸。

在某些实施方案中，核酸是寡核苷酸。在特定实施方案中，寡核苷酸的长度在约10至约100个核苷酸的范围内。在各种相关的实施方案中，单股、双股和三股寡核苷酸的长度可以在约10至约60个核苷酸、约15至约60个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约15至约30个核苷酸、或约20至约30个核苷酸的范围内。

在某些实施方案中，核酸选自由以下组成的组：小干扰RNA(siRNA)、Dicer-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)、自扩增RNA(sa-RNA)和它们的组合。

在某些实施方案中，核酸是反义分子。在某些实施方案中，核酸是miRNA分子。在某些实施方案中，核酸是siRNA。适合的siRNA以及可用于其制备的方法和中间体在国际专利申请公布号WO2016/054421中进行了报道。

靶基因

在某些实施方案中，核酸(例如，siRNA)可以用于使所关注的基因的翻译(即，表达)下调或沉默。所关注的基因包括但不限于与病毒感染和存活相关的基因、与代谢性疾病和病症(例如，肝脏疾病和病症)相关的基因、与肿瘤发生和细胞转化(例如，癌症)相关的基因、血管生成基因、免疫调节基因(例如，与炎性和自身免疫反应相关的那些基因)、配体受体基因以及与神经退行性病症相关的基因。在某些实施方案中，在肝细胞中表达所关注的基因。

与病毒感染和存活相关的基因包括由病毒表达以便结合、进入细胞并在细胞中复制的那些基因。特别关注的是与慢性病毒性疾病相关的病毒序列。特别关注的病毒序列包括以下病毒的序列：丝状病毒，例如埃博拉病毒(Ebola virus)和马尔堡病毒(Marburgvirus)(参见例如Geisbert等,J.Infect.Dis.,193:1650-1657(2006))；沙粒病毒，例如拉沙病毒(Lassa virus)、胡宁病毒(Junin virus)、马丘波病毒(Machupo virus)、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)和萨比亚病毒(Sabia virus)(Buchmeier等,Arenaviridae:theviruses and their replication,FIELDS VIROLOGY,Knipe等(编),第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia,(2001))；流感病毒，例如甲型、乙型和丙型流感病毒(参见例如Steinhauer等,Annu Rev Genet.,36:305-332(2002)；以及Neumann等,J Gen Virol.,83:2635-2662(2002))；肝炎病毒(参见例如Hamasaki等,FEBS Lett.,543:51(2003)；Yokota等,EMBO Rep.,4:602(2003)；Schlomai等,Hepatology,37:764(2003)；Wilson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:2783(2003)；Kapadia等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:2014(2003)；以及FIELDS VIROLOGY,Knipe等(编),第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(2001))；人类免疫缺陷病毒(HIV)(Banerjea等,Mol.Ther.,8:62(2003)；Song等,J.Virol.,77:7174(2003)；Stephenson,JAMA,289:1494(2003)；Qin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:183(2003))；疱疹病毒(Jia等,J.Virol.,77:3301(2003))；以及人乳头瘤病毒(HPV)(Hall等,J.Virol.,77:6066(2003)；Jiang等,Oncogene,21:6041(2002))。

可以沉默的示例性丝状病毒核酸序列包括但不限于编码结构蛋白(例如，VP30、VP35、核蛋白(NP)、聚合酶蛋白(L-pol))和膜相关蛋白(例如，VP40、糖蛋白(GP)、VP24)的核酸序列。埃博拉病毒的完整基因组序列在例如Genbank登录号NC_002549；AY769362；NC_006432；NC_004161；AY729654；AY354458；AY142960；AB050936；AF522874；AF499101；AF272001；和AF086833中列出。埃博拉病毒VP24序列在例如Genbank登录号U77385和AY058897中列出。埃博拉病毒L-pol序列在例如Genbank登录号X67110中列出。埃博拉病毒VP40序列在例如Genbank登录号AY058896中列出。埃博拉病毒NP序列在例如Genbank登录号AY058895中列出。埃博拉病毒GP序列在例如Genbank登录号AY058898；Sanchez等,VirusRes.,29:215-240(1993)；Will等,J.Virol.,67:1203-1210(1993)；Volchkov等,FEBSLett.,305:181-184(1992)；以及美国专利号6,713,069中列出。另外的埃博拉病毒序列在例如Genbank登录号L11365和X61274中列出。马尔堡病毒的完整基因组序列在例如Genbank登录号NC_001608；AY430365；AY430366；和AY358025中列出。马尔堡病毒GP序列在例如Genbank登录号AF005734；AF005733；和AF005732中列出。马尔堡病毒VP35序列在例如Genbank登录号AF005731和AF005730中列出。另外的马尔堡病毒序列在例如Genbank登录号X64406；Z29337；AF005735；和Z12132中列出。靶向埃博拉病毒和马尔堡病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括美国专利公布号20070135370中所描述的那些，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

可以沉默的示例性流感病毒核酸序列包括但不限于编码核蛋白(NP)、基质蛋白(M1和M2)、非结构蛋白(NS1和NS2)、RNA聚合酶(PA、PB1、PB2)、神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)的核酸序列。甲型流感NP序列在例如Genbank登录号NC_004522；AY818138；AB166863；AB188817；AB189046；AB189054；AB189062；AY646169；AY646177；AY651486；AY651493；AY651494；AY651495；AY651496；AY651497；AY651498；AY651499；AY651500；AY651501；AY651502；AY651503；AY651504；AY651505；AY651506；AY651507；AY651509；AY651528；AY770996；AY790308；AY818138；和AY818140中列出。甲型流感PA序列在例如Genbank登录号AY818132；AY790280；AY646171；AY818132；AY818133；AY646179；AY818134；AY551934；AY651613；AY651610；AY651620；AY651617；AY651600；AY651611；AY651606；AY651618；AY651608；AY651607；AY651605；AY651609；AY651615；AY651616；AY651640；AY651614；AY651612；AY651621；AY651619；AY770995；和AY724786中列出。靶向流感病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括美国专利公布号20070218122中所描述的那些，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

可以沉默的示例性肝炎病毒核酸序列包括但不限于转录和翻译中所涉及的核酸序列(例如，En1、En2、X、P)和编码结构蛋白(例如，包括C蛋白和C相关蛋白的核心蛋白、衣壳和包膜蛋白(包括S、M和/或L蛋白)或其片段)的核酸序列(参见例如FIELDS VIROLOGY，同上)。可以沉默的示例性丙型肝炎病毒(HCV)核酸序列包括但不限于5'-非翻译区(5'-UTR)、3'-非翻译区(3'-UTR)、多蛋白翻译起始密码子区、内部核糖体进入位点(IRES)序列，和/或编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白酶/解螺旋酶、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和/或NS5B RNA依赖性RNA聚合酶的核酸序列。HCV基因组序列在例如Genbank登录号NC_004102(HCV基因型1a)、AJ238799(HCV基因型1b)、NC_009823(HCV基因型2)、NC_009824(HCV基因型3)、NC_009825(HCV基因型4)、NC_009826(HCV基因型5)和NC_009827(HCV基因型6)中列出。甲型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登录号NC_001489中列出；乙肝病毒核酸序列在例如Genbank登录号NC_003977中列出；丁型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登录号NC_001653中列出；戊型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登录号NC_001434中列出；并且庚型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登录号NC_001710中列出。编码与病毒感染和存活相关的基因的序列的沉默可以方便地与用于治疗病毒性疾患的常规剂的施用组合使用。靶向肝炎病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括美国专利公布号20060281175、20050058982和20070149470；美国专利号7,348,314；和2009年3月20日提交的美国临时申请号61/162,127中所描述的那些，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

与代谢性疾病和病症(例如，以肝脏为靶标的病症以及肝脏疾病和病症)相关的基因包括例如血脂异常中表达的基因(例如肝X受体，如LXRα和LXRβ(Genback登录号NM_007121)、类法尼醇X受体(FXR)(Genbank登录号NM_005123)、固醇调控元件结合蛋白(SREBP)、位点-1蛋白酶(SIP)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG辅酶A还原酶)、载脂蛋白B(ApoB)(Genbank登录号NM_000384)、载脂蛋白CIII(ApoC3)(Genbank登录号NM_000040和NG_008949区：5001.8164)和载脂蛋白E(ApoE)(Genbank登录号NM_000041和NG_007084区：5001.8612))；以及糖尿病(例如，葡萄糖6-磷酸酶)(参见例如Forman等,Cell,81:687(1995)；Seol等,Mol.Endocrinol.,9:72(1995)；Zavacki等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:7909(1997)；Sakai等,Cell,85:1037-1046(1996)；Duncan等,J.Biol.Chem.,272:12778-12785(1997)；Willy等,Genes Dev.,9:1033-1045(1995)；Lehmann等,J.Biol.Chem.,272:3137-3140(1997)；Janowski等,Nature,383:728-731(1996)；以及Peet等,Cell,93:693-704(1998))。本领域技术人员将认识到，与代谢性疾病和病症(例如，以肝脏为靶标的疾病和病症以及肝脏疾病和病症)相关的基因包括在肝脏本身中表达的基因以及在其它器官和组织中表达的基因。编码与代谢性疾病和病症相关的基因的序列的沉默可以方便地与用于治疗所述疾病或病症的常规剂的施用组合使用。靶向ApoB基因的siRNA分子的非限制性实例包括美国专利公布号20060134189中所描述的那些，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。靶向ApoC3基因的siRNA分子的非限制性实例包括2009年1月26日提交的美国临时申请号61/147,235中所描述的那些，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

与肿瘤发生和细胞转化(例如，癌症或其它瘤形成)相关的基因序列的实例包括有丝分裂驱动蛋白，例如Eg5(KSP、KIF11；Genbank登录号NM_004523)；丝氨酸/苏氨酸激酶，例如polo样激酶1(PLK-1)(Genbank登录号NM_005030；Barr等,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.,5:429-440(2004))；酪氨酸激酶，例如WEE1(Genbank登录号NM_003390和NM_001143976)；细胞凋亡抑制剂，例如XIAP(Genbank登录号NM_001167)；COP9信号转导体亚单位，例如CSN1、CSN2、CSN3、CSN4、CSN5(JAB1；Genbank登录号NM_006837)；CSN6、CSN7A、CSN7B和CSN8；泛素连接酶，例如COP1(RFWD2；Genbank登录号NM_022457和NM_001001740)；以及组蛋白脱乙酰酶，例如HDAC1、HDAC2(Genbank登录号NM_001527)、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9等。靶向Eg5和XIAP基因的siRNA分子的非限制性实例包括2007年5月29日提交的美国专利申请号11/807,872中所描述的那些，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。靶向PLK-1基因的siRNA分子的非限制性实例包括美国专利公布号20050107316和20070265438以及2008年12月23日提交的美国专利申请号12/343,342中所描述的那些，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。靶向CSN5基因的siRNA分子的非限制性实例包括2008年4月15日提交的美国临时申请号61/045,251中所描述的那些，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

与肿瘤发生和细胞转化相关的基因序列的另外的实例包括易位序列，例如MLL融合基因、BCR-ABL(Wilda等,Oncogene,21:5716(2002)；Scherr等,Blood,101:1566(2003))、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、BCL-2、AML1-ETO和AML1-MTG8(Heidenreich等,Blood,101:3157(2003))；过度表达的序列，例如多药耐药基因(Nieth等,FEBS Lett.,545:144(2003)；Wu等,Cancer Res.63:1515(2003))、细胞周期蛋白(Li等,Cancer Res.,63:3593(2003)；Zou等,Genes Dev.,16:2923(2002))、β-连环蛋白(Verma等,Clin CancerRes.,9:1291(2003))、端粒酶基因(Kosciolek等,Mol Cancer Ther.,2:209(2003))、c-MYC、N-MYC、BCL-2、生长因子受体(例如，EGFR/ErbB1(Genbank登录号NM_005228、NM_201282、NM_201283和NM_201284；还参见Nagy等Exp.Cell Res.,285:39-49(2003)、ErbB2/HER-2(Genbank登录号NM_004448和NM_001005862)、ErbB3(Genbank登录号NM_001982和NM_001005915)和ErbB4(Genbank登录号NM_005235和NM_001042599)；以及突变序列，例如RAS(在Tuschl和Borkhardt,Mol.Interventions,2:158(2002)中评述)。靶向EGFR基因的siRNA分子的非限制性实例包括2007年5月29日提交的美国专利申请号11/807,872中所描述的那些，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

编码DNA修复酶的序列的沉默可与化学治疗剂的施用组合使用(Collis等,CancerRes.,63:1550(2003))。编码与肿瘤迁移相关的蛋白质的基因也是所关注的靶序列，例如，整联蛋白、选择蛋白和金属蛋白酶。前述实例并非排他性的。本领域技术人员将了解，有助于或促进肿瘤发生或细胞转化、肿瘤生长或肿瘤迁移的任何完整或部分基因序列都可以作为模板序列包括在内。

血管生成基因能够促进新血管的形成。特别关注的是血管内皮生长因子(VEGF)(Reich等,Mol.Vis.,9:210(2003))或VEGFR。靶向VEGFR的siRNA序列在例如GB 2396864；美国专利公布号20040142895；和CA 2456444中列出，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

抗血管生成基因能够抑制新血管形成。这些基因对于治疗其中血管生成在疾病的病理发展中起作用的那些癌症特别有用。抗血管生成基因的实例包括但不限于内皮抑素(参见例如美国专利号6,174,861)、血管抑素(参见例如美国专利号5,639,725)和VEGFR2(参见例如Decaussin等,J.Pathol.,188:369-377(1999))，其公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

免疫调节基因是调节一种或多种免疫反应的基因。免疫调节基因的实例包括但不限于细胞因子，例如生长因子(例如，TGF-α、TGF-β、EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、CGF、GM-CSF、SCF等)、白介素(例如，IL-2、IL-4、IL-12(Hill等,J.Immunol.,171:691(2003))、IL-15、IL-18、IL-20等)、干扰素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)和TNF。Fas和Fas配体基因也是所关注的免疫调节靶序列(Song等,Nat.Med.,9:347(2003))。造血和淋巴样细胞中编码次级信号传导分子的基因也包括在本发明中，例如Tec家族激酶，如布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton'styrosine kinase，Btk)(Heinonen等,FEBS Lett.,527:274(2002))。

细胞受体配体包括能够结合至细胞表面受体(例如，胰岛素受体、EPO受体、G蛋白偶联受体、具有酪氨酸激酶活性的受体、细胞因子受体、生长因子受体等)以调节(例如，抑制、活化等)受体所涉及的生理路径(例如，葡萄糖水平调节、血细胞发育、有丝分裂等)。细胞受体配体的实例包括但不限于细胞因子、生长因子、白介素、干扰素、促红细胞生成素(EPO)、胰岛素、胰高血糖素、G蛋白偶联受体配体等。编码三核苷酸重复序列(例如，CAG重复序列)扩展的模板可用于使三核苷酸重复序列扩展引起的神经退行性病症，例如脊延髓肌萎缩症和亨廷顿氏舞蹈病(Huntington's Disease)的致病序列沉默(Caplen等,Hum.Mol.Genet.,11:175(2002))。

可以由核酸(例如，由siRNA)靶向以使基因的表达下调或沉默的某些其它靶基因包括但不限于平滑肌主动脉肌动蛋白α2(ACTA2)、乙醇脱氢酶1A(ADH1A)、乙醇脱氢酶4(ADH4)、乙醇脱氢酶6(ADH6)、阿法明(Afamin，AFM)、血管紧张素原(AGT)、丝胺酸-丙酮酸氨基转移酶(AGXT)、α-2-HS-糖蛋白(AHSG)、醛-酮还原酶家族1成员C4(AKR1C4)、血清白蛋白(ALB)、α-1-微球蛋白/比库蛋白(bikunin)前体(AMBP)、血管生成素相关蛋白3(ANGPTL3)、血清淀粉样蛋白P组分(APCS)、载脂蛋白A-II(APOA2)、载脂蛋白B-100(APOB)、载脂蛋白C3(APOC3)、载脂蛋白C-IV(APOC4)、载脂蛋白F(APOF)、β-2-糖蛋白1(APOH)、水通道蛋白9(Aquaporin-9，AQP9)、胆汁酸-CoA:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)、C4b-结合蛋白β链(C4BPB)、由LINC01554编码的假定未表征蛋白(C5orf27)、补体因子3(C3)、补体因子5(C5)、补体因子C6(C6)、补体因子C8α链(C8A)、补体因子C8β链(C8B)、补体因子C8γ链(C8G)、补体因子C9(C9)、钙调蛋白结合转录活化因子1(CAMTA1)、CD38(CD38)、补体因子B(CFB)、补体因子H相关蛋白1(CFHR1)、补体因子H相关蛋白2(CFHR2)、补体因子H相关蛋白3(CFHR3)、大麻素受体1(CNR1)、血浆铜蓝蛋白(CP)、羧肽酶B2(CPB2)、结缔组织生长因子(CTGF)、C-X-C基序趋化因子2(CXCL2)、细胞色素P450 1A2(CYP1A2)、细胞色素P450 2A6(CYP2A6)、细胞色素P450 2C8(CYP2C8)、细胞色素P450 2C9(CYP2C9)、细胞色素P450家族2亚家族D成员6(CYP2D6)、细胞色素P450 2E1(CYP2E1)、叶绿醌ω-羟化酶CYP4F2(CYP4F2)、7-α-羟基胆固-4-烯-3-酮12-α-羟化酶(CYP8B1)、二肽基肽酶4(DPP4)、凝血因子12(F12)、凝血因子II(凝血酶)(F2)、凝血因子IX(F9)、纤维蛋白原α链(FGA)、纤维蛋白原β链(FGB)、纤维蛋白原γ链(FGG)、类纤维蛋白原1(FGL1)、含黄素单氧化酶3(FMO3)、含黄素单氧化酶5(FMO5)、种群特异性组分(维生素D结合蛋白)(GC)、生长激素受体(GHR)、甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)、透明质酸结合蛋白2(HABP2)、铁调素抗微生物肽(HAMP)、羟酸氧化酶(乙醇酸氧化酶)1(HAO1)、HGF活化因子(HGFAC)、结合珠蛋白相关蛋白；结合珠蛋白(HPR)、血红素结合蛋白(HPX)、富组氨酸糖蛋白(HRG)、羟基类固醇(11-β)脱氢酶1(HSD11B1)、羟基类固醇(17-β)脱氢酶13(HSD17B13)、间-α-胰蛋白酶抑制因子重链H1(ITIH1)、间-α-胰蛋白酶抑制因子重链H2(ITIH2)、间-α-胰蛋白酶抑制因子重链H3(ITIH3)、间-α-胰蛋白酶抑制因子重链H4(ITIH4)、前激肽释放酶(KLKB1)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、肝脏表达的抗微生物肽2(LEAP2)、白细胞衍生趋化因子2(LECT2)、脂蛋白(a)(LPA)、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸肽酶2(MASP2)、S-腺苷甲硫氨酸合酶同种型1型(MAT1A)、NADPH氧化酶4(NOX4)、聚[ADP核糖]聚合酶1(PARP1)、对氧磷酯酶1(PON1)、对氧磷酯酶3(PON3)、维生素K依赖性蛋白C(PROC)、视黄醇脱氢酶16(RDH16)、组成性血清淀粉样蛋白A4(SAA4)、丝氨酸脱水酶(SDS)、丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serpin)家族A成员1(SERPINA1)、丝氨酸蛋白酶抑制因子A11(SERPINA11)、人源性激肽释放酶结合蛋白(Kallistatin，SERPINA4)、皮质类固醇结合球蛋白(SERPINA6)、抗凝血酶-III(SERPINC1)、肝素辅因子2(SERPIND1)、丝氨酸蛋白酶抑制因子家族H成员1(SERPINH1)、溶质运载蛋白家族5成员2(SLC5A2)、钠/胆汁酸共转运体(SLC10A1)、溶质运载蛋白家族13成员5(SLC13A5)、溶质运载蛋白家族22成员1(SLC22A1)、溶质运载蛋白家族25成员47(SLC25A47)、溶质运载蛋白家族2促葡萄糖转运体成员2(SLC2A2)、钠偶联中性氨基酸转运体4(SLC38A4)、溶质运载蛋白有机阴离子转运体家族成员1B1(SLCO1B1)、神经鞘磷脂磷酸二酯酶1(SMPD1)、胆汁盐磺基转移酶(SULT2A1)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)、色氨酸2,3-双加氧酶(TDO2)、UDP葡萄糖醛酸基转移酶2家族多肽B10(UGT2B10)、UDP葡萄糖醛酸基转移酶2家族多肽B15(UGT2B15)、UDP葡萄糖醛酸基转移酶2家族多肽B4(UGT2B4)和玻连蛋白(VTN)。

除了使上述基因中的任一者的表达沉默以达到治疗目的的效用以外，本文所描述的某些核酸(例如，siRNA)还可用于研究和开发应用以及诊断、预防、预后、临床和其它医疗保健应用。作为非限制性实例，某些核酸(例如，siRNA)可以用于靶标验证研究中，所述靶标验证研究旨在测试所关注的基因是否具有作为治疗靶标的潜力。某些核酸(例如，siRNA)还可以用于靶标鉴定研究中，所述靶标鉴定研究旨在发现作为潜在治疗靶标的基因。

产生siRNA分子

可以提供几种形式的siRNA，包括例如作为一种或多种分离的小干扰RNA(siRNA)双链体、作为较长的双股RNA(dsRNA)或作为从DNA质粒的转录盒转录的siRNA或dsRNA。在一些实施方案中，siRNA可以酶促产生或通过部分/完全有机合成来产生，并且修饰的核糖核苷酸可以通过体外酶促或有机合成而引入。在某些情况下，每股都是化学制备的。合成RNA分子的方法在本领域中是已知的，例如，Verma和Eckstein(1998)中所描述或本文所描述的化学合成方法。

分离RNA、合成RNA、使核酸杂交、制造和筛选cDNA文库以及进行PCR的方法在本领域中是众所周知的(参见例如Gubler和Hoffman,Gene,25:263-269(1983)；Sambrook等,同上；Ausubel等,同上)，PCR方法也是众所周知的(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis等编,1990))。表达文库也是本领域技术人员众所周知的。公开用于本发明的一般方法的另外的基本文本包括Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版1989)；Kriegler,GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等编,1994)。这些参考文献的公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

通常，siRNA是化学合成的。包含本发明的siRNA分子的寡核苷酸可以使用本领域中已知的多种技术中的任一者来合成，例如以下文献中所描述的那些技术：Usman等,J.Am.Chem.Soc.,109:7845(1987)；Scaringe等,Nucl.Acids Res.,18:5433(1990)；Wincott等,Nucl.Acids Res.,23:2677-2684(1995)；以及Wincott等,Methods Mol.Bio.,74:59(1997)。寡核苷酸的合成利用了常见的核酸保护和偶联基团，例如在5′末端的二甲氧基三苯甲基和在3′末端的亚磷酰胺。作为非限制性实例，小规模合成可以使用0.2μmol规模的方案在Applied Biosystems合成仪上进行。或者，在0.2μmol规模下的合成可以在来自Protogene(Palo Alto,CA)的96孔板合成仪上进行。然而，更大或更小规模的合成也在本发明的范围内。用于寡核苷酸合成的适合试剂、用于RNA脱保护的方法以及用于RNA纯化的方法是本领域技术人员已知的。

siRNA分子可以由两个不同的寡核苷酸组装，其中一个寡核苷酸包含siRNA的有义链并且另一个包含siRNA的反义链。举例来说，每股可以单独地合成并且在合成和/或脱保护之后通过杂交或接合而连接在一起。

连接基团

本发明的化合物和缀合物可以包括一个或多个连接基团(例如，L

在一个实施方案中，每个连接基团包含约3-1000个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包含约3-500个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包含约3-200个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包含约3-50个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包含约10-1000个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包含约10-500个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包含约10-200个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包含约10-50个原子。

在一个实施方案中，每个连接基团包含选自H、C、N、S和O的原子。

在一个实施方案中，每个连接基团包含选自H、C、N、S、P和O的原子。

在一个实施方案中，每个连接基团包含支链或无支链、饱和或不饱和烃链，所述烃链具有约1至1000个(或1-750、1-500、1-250、1-100、1-50、1-25、1-10、1-5、5-1000、5-750、5-500、5-250、5-100、5-50、5-25、5-10或2-5个碳原子)，其中一个或多个碳原子任选地独立地被-O-、-S、-N(R

在一个实施方案中，每个连接基团包含聚乙二醇。在一个实施方案中，连接基团包含通过羰基与靶向缀合物的其余部分连接的聚乙二醇。在一个实施方案中，聚乙二醇包含约1至约500个或约5至约500个或约3至约100个重复(例如，-CH

本发明的实施方案

本发明的一个方面是如发明内容中所阐述的式I化合物或其盐。

在一个实施方案中，A不存在。

在一个实施方案中，A是3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基。

在一个实施方案中，B是5-10元芳基。

在一个实施方案中，B是萘基或苯基。

在一个实施方案中，B是苯基。

在一个实施方案中，基团：

是：

在一个实施方案中，B是5-10元杂芳基。

在一个实施方案中，B是吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、咪唑基、噻唑基、恶二唑基或恶唑基。

在一个实施方案中，基团：

是：

在一个实施方案中，基团：

是：

在一个实施方案中，L

-C(＝O)N(H)-CH

-C(＝O)N(CH

在一个实施方案中，L

-C(＝O)N(H)-CH

-C(＝O)N(CH

在一个实施方案中，R

其中：

X是NR

每个R

在一个实施方案中，R

其中：

X是NR

每个R

在一个实施方案中，R

在一个实施方案中，L

在一个实施方案中，核酸分子R

在一个实施方案中，基团：

选自由以下组成的组：

其中

每个R'独立地是C

在一个实施方案中，基团：

选自由以下组成的组：

其中：

每个R'独立地是C

以*标记的价键与L

以**标记的价键与R

在一个实施方案中，基团：

是：

本发明还提供了可用于制备式(I)缀合物的本文所公开的合成中间体和方法。举例来说，本发明包括式(Ia)化合物：

其中：

B是5-10元芳基或5-10元杂芳基，所述5-10元芳基或5-10元杂芳基任选地被一个或多个独立地选自由卤基、羟基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、(C

A是3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；

每个R

n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

或其盐。

在一个实施方案中，R

实施例

将通过具体实施例更详细地描述本发明。以下实施例出于说明的目的而提供，并且不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地识别多种非关键性参数，可以改变或修改所述参数以得到基本上相同的结果。

以下流程1-22说明了可以用于制备式I缀合物的中间体化合物的制备。流程1-22中所说明的中间体化合物和合成工艺是本发明的实施方案。

流程1制备化合物6

步骤1.制备(3aR,6aS)-5-苯甲基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮1

向3,4-二甲基呋喃-2,5-二酮(40g，317mmol)和N-苯甲基-1-甲氧基-N-((三甲基硅烷基)甲基)甲胺(94.1g，396.5mmol)于DCM(600ml)中的经冷却溶液(0℃)中缓慢添加三氟乙酸(732μl)。搅拌过夜以使溶液缓慢升温至室温。将反应混合物浓缩至干，溶解于EtOAc(500ml)中，用饱和碳酸氢钠(2x 500ml)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干。通过硅胶柱色谱法(梯度：于己烷中的20％乙酸乙酯至100％乙酸乙酯)进行纯化，得到呈黄色油状的(3aR,6aS)-5-苯甲基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮(53.7g，65％)。Rf 0.85 40％EtOAc-己烷

步骤2.制备((3R,4S)-1-苯甲基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇2

经过一下午，向(3aR,6aS)-5-苯甲基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮(53.7g，205.7mmol)于无水乙醚(750ml)中的经冷却(0℃)溶液中分批缓慢添加氢化铝锂粒料(17.6g，463mmol)。随着冰水浴融化，将溶液搅拌过夜，从而升温至室温。完成后，将反应物冷却至0℃，并且用25ml 5M NaOH、继而用12ml水极缓慢地淬灭。搅拌30分钟，然后添加硫酸镁并过滤。浓缩滤液，得到呈无色油状的((3R,4S)-1-苯甲基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(33.6g，65％)。Rf 0.25 10％CH

步骤3.制备((3R,4S)-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇3

向((3R,4S)-1-苯甲基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(40.1g，161mmol)于甲醇(300ml)中的溶液中添加湿的10％钯/活性炭(4g)。在氢气氛下剧烈搅拌溶液16小时。完成后，通过硅藻土过滤溶液并浓缩至干，得到呈无色固体状的((3R,4S)-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(24g，94％)。Rf 0.05 10％CH

步骤4.制备10-((3R,4S)-3,4-双(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸甲酯4

用HBTU(62.9g，166mmol)和胡尼格氏碱(Hunig's base)(105ml，604mmol)处理3(24g，151mmol)和癸二酸单甲酯(34.2g，159mmol)于CH

步骤5.制备10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸甲酯5

将4(41.5g，116mmol)和4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(38.8g，116mmol)于吡啶(400ml)中的溶液搅拌过夜。然后在减压下去除吡啶并且对粗物质进行色谱法(梯度：0％CH

步骤6.制备10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂6

向化合物5(29.5g，45mmol)于THF(250ml)和水(250ml)中的溶液中添加氢氧化锂(1.19g，50mmol)。在室温下搅拌溶液18小时，然后浓缩以去除THF。将剩余水溶液冷冻干燥过夜，得到呈浅紫色固体状的6(28.5g，98％)。Rf 0.56 10％CH

流程2制备化合物10

步骤1.制备12-氨基十二烷酸甲酯8

在室温下于MeOH中搅拌12-氨基十一烷酸7(10g，4.64mmol)。逐滴添加乙酰氯(856μl，12mmol)，并且搅拌反应物1.5小时。在真空中去除溶剂，将残余物溶于MTBE中并且在冰箱中冷却过夜。通过过滤收集所得沉淀物，用冰冷的MTBE洗涤并且在高真空下干燥，得到12-氨基十二烷酸甲酯8。

步骤2.制备12-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)十二烷酸甲酯9

在室温下将10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂(6)(2g，3.1mmol)、12-氨基十二烷酸甲酯(8)(778mg，3.1mmol)、HBTU(1.2g，3.1mmol)和TEA(1.4ml，10mmol)于DCM中搅拌过夜。通过过滤去除沉淀物，在真空中浓缩滤液并通过柱色谱法(5％MeOH，DCM)纯化残余物。TLC显示两个具有相同质量的接近的过柱斑点，这些斑点被指定为几何异构体并且以定量方式一起汇集成12-(10-(3-((双(4-(甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)十二烷酸甲酯(9)。

步骤3.制备12-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)-十二烷酸锂10

在室温下将12-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)十二烷酸甲酯9(3.1mmol)于THF:H

流程3制备化合物13

步骤1.制备4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯12

将四乙二醇(11)(934g，4.8mol)于THF(175ml)和NaOH水溶液(5M，145ml)中的溶液冷却(0℃)，并且用溶解于THF(605ml)中的对甲苯磺酰氯(91.4g，480mmol)处理，然后搅拌两小时(0℃)。用水(3L)稀释反应混合物并且用CH

步骤2.制备2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇13

用叠氮化钠(131g，2.02mol)处理12(140g，403mmol)于DMF(880ml)中的溶液并加热(45℃)过夜。在减压下去除大部分DMF，并且将残余物溶解于CH

流程4制备化合物19a-19c

步骤1.制备(3R,4R,5R,6R)-6-(羟甲基)-3-(((E)-4-甲氧基苯亚甲基)氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三醇16

在室温下将D-半乳糖胺盐酸盐(14)(9g，41.7mmol)于1M NaOH溶液中搅拌。添加茴香醛(51ml，420mmol)并剧烈搅拌反应物直至固化。使固体反应物在4℃下保持16小时。添加冰冷的水(200ml)并通过过滤收集所得固体，同时用冰冷的EtOH/Et

步骤2.制备三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(((E)-4-甲氧基苯亚甲基)氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯17

在0℃下将(3R,4R,5R,6R)-6-(羟甲基)-3-(((E)-4-甲氧基苯亚甲基)氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三醇(16)(9.81g，30mmol)于吡啶中搅拌。添加乙酸酐(34ml)，继而添加DMAP(100mg，催化剂)，并且搅拌反应物16小时，使其缓慢升温至室温。将所得溶液倾倒至碎冰上并且在4℃下保持16小时。用EtOAc(x 3)萃取反应物，并且用H

步骤3.制备三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯盐酸盐18

在回流下将三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(((E)-4-甲氧基苯亚甲基)氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯(17)(6.0g，43％)于丙酮(300ml)中加热。添加HCl(水溶液)(5N，3.0ml)，并且搅拌反应物15分钟。冷却后，添加Et

步骤4a.制备三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯19a

在室温下将三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯盐酸盐(18)(13.5g，35.2mmol)和TEA(7.83g，77.4mmol)于DCM中搅拌。逐滴添加含TFAA(8.13g，38.7mmol)的DCM，并且搅拌反应物1小时。用DCM稀释反应物，依序用1M HCl、饱和NaHCO

步骤4b.制备三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-丙酰氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯19b

以类似于三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯(19a)的方式，使用丙酸酐代替TFAA来制备这种化合物，得到三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-丙酰氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯(19b)(1.2g，85.3％)。通过MS(ESI+ve)确认产物。

步骤4c.制备三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2-二氟丙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯19c

在室温下将三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯盐酸盐(18)(15.34g，39.98mmol)、2,2-二氟丙酸(4.4g，39.98mmol)、HATU(24.37g，64mmol)和TEA(12.14g，120mmol)于DMF中搅拌16小时。将反应物在EtOAc与水之间分配。分离有机物，依序用1M HCl、饱和NaHCO

流程5制备化合物24

步骤1.制备(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苯甲酯22

用N-(苯甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(21)(550g，2.21mol)分批处理氨基醇(20)(313.6g，2.1mol)于THF(3.5L)中的溶液。一旦反应完成(18小时)，即在减压下去除THF，并且将残余物溶解于CH

步骤2.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯23

用5mol％Sc(OTf)

步骤3.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯24

用H

流程6制备化合物34

步骤1.制备2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇25

在室温下将2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(13)(70.0g，318mmol)于MeOH中搅拌。将反应物在10％PD-C(7g)上氢化16小时。通过硅藻土过滤反应物并且在真空中浓缩，得到2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(25)(61.4g，100％)，其未经进一步纯化即使用。通过MS(ESI+ve)确认产物。

步骤2.制备(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-氨基甲酸苯甲酯27

在5℃下将2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(25)(61.4g，318mmol)于H

步骤3.制备(1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)氨基甲酸苯甲酯28

在室温下将(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(27)(23.6g，72.1mmol)和TEA(7.7g，75.7mmol)于DCM中搅拌。添加DMTr-Cl(25.65g，75.7mmol)，并且在室温下搅拌反应物2小时。依序用饱和NaHCO

步骤4.制备(1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸苯甲酯29

在0℃下将(1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)氨基甲酸酯(28)(25.5g，40.5mmol)和MeI(46.0g，324mmol)于无水THF中搅拌。添加NaH(于矿物油中的60％分散体)(2.92g，121.5mmol)，并且在0℃下、然后在室温下搅拌反应物1小时。将反应物在EtOAc与H

步骤5.制备(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸苯甲酯30

在室温下将(1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸苯甲酯(29)(26.06g，40.5mmol)于DCM中搅拌。添加TFA(5.1g，44.5mmol)并且搅拌1小时。添加另外2当量TFA，并且搅拌反应物16小时。在真空中浓缩反应物，并且通过自动快速色谱法(5％MeOH/DCM)纯化残余物，得到(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸苯甲酯(30)(6.76g，48.9％)。通过MS(ESI+ve)确认产物。

步骤6.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((4-甲基-3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯31

在回流下将(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸酯(30)(6.76g，19.8mmol)、三乙酸(3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯(7.71g，19.8mmol)和Sc(III)OTf(0.49g，1.0mmol)于DCE中加热2小时。冷却后，用TEA淬灭反应物，并且依序用1M HCl、饱和NaHCO

步骤7.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((1,1,1-三氟-3-甲基-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯32

在室温下将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((4-甲基-3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(31)(9.37g，14.0mmol)和TFA(1.76g，15.4mmol)于MeOH中搅拌。将反应物在10％Pd-C(1g)上氢化约2小时。通过硅藻土过滤反应物并且在真空中浓缩，得到二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((1,1,1-三氟-3-甲基-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(32)(9.0g，98.9％)。产物未经纯化即使用。通过MS(ESI+ve)确认产物。

步骤8.制备四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((4-硝基-1,2-亚苯基)双(2-甲基-1-氧代-5',8',11'-三氧杂-2'-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯34

在室温下将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((1,1,1-三氟-3-甲基-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(32)(4.5g，6.93mmol)、4-硝基邻苯二甲酸(33)(0.73g，3.46mmol)、HATU(8.45g，22.18mmol)和TEA(4.21g，41.6mmol)于DCM中搅拌16小时。用DCM稀释反应物，并且依序用1MHCl、饱和NaHCO

流程7制备化合物43

步骤1.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯

在室温下将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(45.0g，70.8mmol)和Na

步骤2.制备(2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苯甲酯36

在不透气的密封反应容器中于室温下将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(35)(25.12g，38.3mmol)于7N氨的MeOH溶液中搅拌16小时。使反应物在50℃下蒸发以去除氨，并且在真空中浓缩剩余物，得到(2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苯甲酯(36)(20.3g，100％)，其未经进一步纯化即用于后续反应中。通过MS(ESI+ve)确认产物。

步骤3.制备(2-(2-(2-(2-(((3aR,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-(羟甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊二烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苯甲酯37

在室温下将(2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苯甲酯(36)(20.3g，38.3mmol)于DMF(200ml)中搅拌。添加2,2-二甲氧基丙烷(274g，1.6mol)和pTsOH(催化剂)，并且在65℃下加热反应物16小时。将反应物冷却至室温，添加TEA(20ml)并且搅拌30分钟。在真空中去除溶剂，将残余物溶于MeOH/H

步骤4.制备4-甲基苯磺酸((3aR,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-2,2-二甲基-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊二烯并[4,5-c]吡喃-4-基)甲酯38

在0℃下将(2-(2-(2-(2-(((3aR,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-(羟甲基)-2,2-二甲基-四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊二烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苯甲酯(37)(25.5g，44.8mmol)和TEA(9.97g，98.5mmol)于DCM中搅拌。添加含对甲苯-磺酰氯(18.8g，98.5mmol)的DCM，并且搅拌反应物16小时，使其升温至室温。用DCM稀释反应物，依序用1M HCl、饱和NaHCO

步骤5.制备(2-(2-(2-(2-(((3aS,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-(叠氮基甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊二烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨基甲酸苯甲酯39

在100℃下将4-甲基苯磺酸((3aR,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-2,2-二甲基-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊二烯并[4,5-c]吡喃-4-基)甲酯(38)(25.0g，34.5mmol)和NaN

步骤6.制备(2-(2-(2-(2-(((3aS,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊二烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苯甲酯40

在室温下将(2-(2-(2-(2-(((3aS,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-(叠氮基甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊二烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苯甲酯(39)(16.1g，27.0mmol)于MeOH(200ml)中搅拌。依序添加1-乙炔基-3-甲氧基苯(4.28g，32.4mmol)、三(苯甲基三唑基甲基)胺(0.72g，1.35mmol)、CuSO

步骤7.制备(2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苯甲酯41

在室温下将(2-(2-(2-(2-(((3aS,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑1-基)甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊二烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苯甲酯(40)(15.0g，20.6mmol)于MeCN(200ml)和1.84％H

步骤8.制备二乙酸(2R,3S,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯42

在室温下将(2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨基甲酸苯甲酯(41)(11.0g，16.0mmol)于吡啶(200ml)中搅拌。添加乙酸酐(16.3g，160mmol)，并且在室温下搅拌反应物16小时，继而在50℃下搅拌3小时。将反应物倾倒于水上并且用DCM(250ml)萃取三次。用饱和NaHCO

步骤9.制备二乙酸(2R,3S,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-((1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯43

在室温下将二乙酸(2R,3S,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(42)(9.06g，11.74mmol)和TFA(1.47g，12.91mmol)于MeOH中搅拌。将反应物在10％Pd-C上氢化1小时。通过硅藻土过滤反应物并且在真空中浓缩，得到二乙酸(2R,3S,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-((1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(43)(8.8g，99.7％)，其未经纯化即用于后续反应中。通过MS(ESI+ve)确认产物。

流程8制备化合物54

步骤1.制备过乙酰化半乳糖胺44

经过45分钟，用乙酸酐(1.25L，13.2mol)处理含D-半乳糖胺盐酸盐(14)(250g，1.16mol)的吡啶(1.5L)。搅拌过夜后，将反应混合物分成三个1L的部分。将每1L部分倾倒至3L冰水中并且混合一小时。混合后，滤出固体，合并，在液氮上冷冻，然后冻干五天，得到呈白色固体状的过乙酰化半乳糖胺(44)(369.4g，82％)。Rf(0.58，10％MeOH-CH

步骤2.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯45

在90℃下将过乙酰化半乳糖胺(44)(25g，64.21mmol)与三氟甲磺酸钪(1.58g，3.21mmol)于无水DCE中加热3小时。将反应物冷却至室温，用5ml TEA淬灭并且在真空中浓缩。通过自动柱色谱法(2-10％MeOH/DCM)纯化残余物，得到二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(45)(27g，76.5％)。通过MS确认产物。

步骤3.制备2,2,2-三氟乙酸2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵46

用钯/木炭(1.5g，10％w/w，湿基)处理叠氮化物45(7.12g，13mmol)于EtOAc(150ml)和三氟乙酸(2ml)中的溶液。然后用氢气吹扫反应混合物并且剧烈搅拌过夜。用氮气吹扫后，通过硅藻土过滤混合物，同时用MeOH冲洗。浓缩滤液并且经由色谱法(5％→10％→20％MeOH-CH

步骤4.制备四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-硝基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯48

在室温下将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(46)(13.25g，20.84mmol)、5-硝基间苯二甲酸(47)(2.0g，9.5mmol)、HATU(12.3g，32.21mmol)和TEA(5.75g，59.0mmol)于DCM中搅拌16小时。用DCM稀释反应物，依序用1MHCl、饱和NaHCO

步骤5.制备四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-氨基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯49

在室温下将四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-硝基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(48)(26.1g，23.05mmol)于MeOH中搅拌。在室温下将反应物在10％Pd-C(2.6g)上氢化2小时。通过硅藻土过滤反应物并且在真空中浓缩，得到四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-氨基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(49)(28.0g，99.9％)，其未经进一步纯化即用于后续反应中。通过MS(ESI+ve)确认产物。

步骤6.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-6-((1-(3-((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-5-乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-(2-(((苯甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)苯基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯51

在室温下将四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-氨基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(49)(0.5g，0.45mmol)和CBZ-gly(50)(0.09g，0.45mmol)于EtOAc中搅拌。添加T3P(于EtOAc中的50％溶液)(0.29g，0.91mmol)，并且在室温下搅拌反应物过夜。添加另外的T3P(0.3当量)，并且再搅拌反应物1小时。用饱和NaHCO

步骤7.制备四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(2-((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)乙酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯52

在室温下将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-6-((1-(3-((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-5-乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-(2-(((苯甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)苯基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(51)(3.3g，2.39mmol)和TFA(0.29g，2.51mmol)于MeOH中搅拌。将反应物在10％Pd-C(400mg)上氢化两小时，通过硅藻土过滤并且在真空中浓缩，得到四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(2-((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)-乙酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(52)(3.21g，98.7％)，其未经进一步纯化即用于后续反应中。通过MS(ESI+ve)确认产物。

步骤8.制备四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(2-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)乙酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯53

在室温下将四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(2-((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)乙酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(52)(1.0g，0.73mmol)、10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基-吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂(6)(0.45g，0.73mmol)、HATU(0.47g，1.25mmol)和TEA(0.22g，2.2mmol)于DCM中搅拌4小时。用DCM稀释反应物，并且依序用饱和NaHCO

步骤9.制备4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸54

在60℃下将四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(2-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)乙酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂)-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(54)(1.05g，0.57mmol)、琥珀酸酐(0.28g，2.84mmol)、DMAP(0.35g，2.84mmol)和TEA(0.58g，5.68mmol)于无水DCE中加热2小时。添加MeOH(5ml)，并且再搅拌反应物30分钟，然后冷却并且在真空中浓缩。将残余物溶于DCM中，并且依序用饱和NaHCO

流程9制备化合物56

步骤1.制备四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(10-(3-((双(4-甲氧基-苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯55

在室温下将四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-氨基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(49)(4g，3.36mmol)、10-(3-((双(4-甲氧基苯基)-(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂(6)(2.13g，3.36mmol)、TEA(1ml，6.7mmol)和T3P(于EtOAc中的50％W/W溶液)(4.3g，6.72mmol)于DCM中搅拌16小时。依序用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤反应物，干燥(Na

步骤2.制备4-((1-(10-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸56

以类似于4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸(54)的方式制备这种化合物

流程10制备化合物57

合成3-((((1-(10-((3,5-双((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)羰基)氧基)丙酸57

以类似于4-((1-(10-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸(54)的方式制备这种化合物

流程11制备化合物66

步骤1.制备5-(羟甲基)间苯二甲酸二甲酯59

在室温下将苯-1,3,5-三甲酸三甲酯(58)(40g，159mmol)和NaBH

步骤2.制备5-(氯甲基)间苯二甲酸二甲酯60

使5-(羟甲基)间苯二甲酸二甲酯(59)(20.5g，80.5％)于SOCl

步骤3.制备5-(叠氮基甲基)间苯二甲酸二甲酯61

使5-(氯甲基)间苯二甲酸二甲酯(60)(10.84g，45mmol)和NaN

步骤4.制备5-(叠氮基甲基)间苯二甲酸62

在室温下将5-(叠氮基甲基)间苯二甲酸二甲酯(61)(9.84g，39.5mmol)和LiOH(2.1g，87mmol)于THF/H

步骤5.制备四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-(叠氮基甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯63

在室温下将5-(叠氮基甲基)间苯二甲酸(62)(4.42g，20mmol)、2,2,2-三氟乙酸2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵(46)(25g，40mmol)、HATU(24.4g，64mmol)和TEA(17ml，120mmol)于DCM中搅拌16小时。依序用1M HCl、饱和NaHCO

步骤6.制备四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-(((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯64

在室温下将四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-(叠氮基甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(63)(10.9g，8.9mmol)和TFA(0.68ml，8.9mmol)于MeOH中搅拌。将反应物在10％Pd-C上氢化1小时。通过硅藻土过滤反应物，在真空中浓缩，并且通过自动快速色谱法(15％MeOH/DCM)纯化残余物，得到四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-(((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(64)(6.41g，54.7％)。通过MS(ESI+ve)确认产物。

步骤7.制备四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-((10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯65

在室温下将四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-(((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(3.0g，2.3mmol)、10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂(65)(1.5g，2.3mmol)、HATU(1.4g，3.7mmol)和TEA(1ml，7.0mmol)搅拌过夜。用DCM稀释反应物，用饱和NaHCO

步骤8.制备4-((1-(10-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯甲基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸66

流程12制备化合物67

合成4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸67

以类似于54(流程8)的方式，使用三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯代替过乙酰化半乳糖胺(6)来制备这种化合物。通过MS(ESI+ve)确认产物。

流程13制备化合物68

合成4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-3-丙酰氨基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸68

以类似于54(流程8)的方式，使用三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-丙酰氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯(19b)代替过乙酰化半乳糖胺(44)来制备这种化合物。通过MS(ESI+ve)确认产物。

流程14制备化合物69

合成4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2-二氟丙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸69

以类似于54(流程8)的方式，使用三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2-二氟丙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基酯(19c)代替过乙酰化半乳糖胺(44)来制备这种化合物。通过MS(ESI+ve)确认产物。

流程15制备化合物70

合成4-((1-(10-((2-((3,4-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(甲基)氨甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸70

以类似于化合物54(流程8)的方式，使用四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((4-硝基-1,2-亚苯基)双(2-甲基-1-氧代-5',8',11'-三氧杂-2'-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(34)代替四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-硝基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯(48)来制备这种化合物。

流程16制备化合物71

合成4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸71

以类似于化合物54(流程8)的方式，使用二乙酸(2R,3S,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-((1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(43)代替2,2,2-三氟乙酸2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵(46)来制备这种化合物。

流程17制备化合物72

合成4-((4-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-1,2-二甲基环戊基)甲氧基)-4-氧代丁酸72

以类似于化合物54(流程8)的方式，使用二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(24)代替2,2,2-三氟乙酸2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵(46)来制备这种化合物。

流程18制备化合物81

步骤1.制备12-(苯甲氧基)-12-氧代十二烷酸76

向十二烷二酸(74)(21.0g，91.3mmol)于DMF(200ml)中的溶液中添加碳酸钾(10g，72.4mmol)和苯甲基溴(75)(10ml，84.2mmol)。在80℃下搅拌溶液4小时，冷却至0℃，然后小心地用6M HCl酸化。用水(250ml)稀释并且用乙酸乙酯(500ml)萃取。用盐水(3x 250ml)洗涤乙酸乙酯萃取物，在硫酸镁上干燥，过滤并且浓缩至干。将固体悬浮于二氯甲烷(200ml)中并过滤。浓缩现在富集有产物的滤液，然后在硅胶60上通过柱色谱法(梯度：含0至10％甲醇的DCM)纯化，得到呈无色固体状的12-(苯甲氧基)-12-氧代十二烷酸(76)(13g，45％)。通过质谱法确认结构

步骤2.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-(12-(苯甲氧基)-12-氧代十二烷酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯78

向二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-氨基苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)-四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(77)(4.0g，3.6mmol)、12-(苯甲氧基)-12-氧代十二烷酸(76)(1.3g，4.1mmol)和三乙胺(1.5ml，10.8mmol)于二氯甲烷(75ml)中的溶液中逐滴添加T3P(4.5g，约9ml，于乙酸乙酯中的50％溶液)。在室温下搅拌溶液过夜。完成后，用二氯甲烷稀释反应混合物，并且小心地用碳酸氢钠饱和溶液(200ml)淬灭。剧烈搅拌两相溶液30分钟。分离DCM层，并且用二氯甲烷(1x 100ml)萃取水相。在硫酸镁上干燥合并的萃取物，过滤并且在真空中浓缩至干。在硅胶60上通过柱色谱法(梯度：含0-10％MeOH的DCM)纯化残余物，得到呈无色固体状的标题化合物(1.5g，30％)。

步骤3.制备12-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-12-氧代十二烷酸79

向二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨甲酰基)-5-(12-(苯甲氧基)-12-氧代十二烷酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)-乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(78)(1.5g，1.1mmol)于甲醇(25ml)中的溶液中添加10％钯/碳(湿基，150mg，10％wt/wt)。经过1小时，向溶液中缓慢通入氢气。完成后，向溶液中通入氮气，通过硅藻土过滤，并且在真空中浓缩至干，得到无色固体(1.1g，79％)。

步骤4.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-(12-氧代-12-(全氟苯氧基)十二烷酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯81

向12-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-12-氧代十二烷酸(79)(0.6g，0.46mmol)和三乙胺(125μL，0.92mmol)于二氯甲烷(50ml)中的溶液中添加三氟乙酸五氟苯酯(80)(150mg，1.1mmol)。在室温下搅拌溶液30分钟，然后在真空中浓缩至干。在硅胶60上通过柱色谱法(梯度：含0至10％甲醇的二氯甲烷)纯化残余物，得到呈无色固体状的标题化合物(475mg，70％)。质量(ESI+)m/z 741.0(M+2H)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),8.52(t,J＝5.6Hz,2H),8.14(d,J＝1.4Hz,2H),7.91(t,J＝1.6Hz,1H),7.80(d,J＝9.2Hz,2H),5.21(d,J＝3.4Hz,2H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,2H),4.54(d,J＝8.5Hz,2H),4.06-3.99(m,7H),3.88(dt,J＝11.2,8.8Hz,2H),3.77(ddd,J＝11.1,5.6,3.9Hz,2H),3.62-3.46(m,22H),3.46-3.38(m,5H),2.77(t,J＝7.2Hz,2H),2.31(t,J＝7.4Hz,2H),2.10(s,7H),1.99(s,7H),1.89(s,7H),1.77(s,7H),1.69-1.54(m,4H),1.40-1.20(m,14H)。质量(ESI+)m/z 741.0(M+2H)。

流程19制备化合物90

步骤1.制备12-((叔丁氧基羰基)氨基)十二烷酸84

将12-氨基十二烷酸(82)(5.0g，23.3mmol)、二碳酸二叔丁酯(83)(6.1g，27.9mmol)和三乙胺(6.3ml，46.6mmol)于甲醇(75ml)中的溶液加热至60℃保持3小时，然后在室温下过夜。完成后，将溶液在真空中浓缩至干并且未经进一步纯化即用于下一个步骤中。

步骤2.制备12-((叔丁氧基羰基)氨基)十二烷酸苯甲酯85

在室温下将粗的12-((叔丁氧基羰基)氨基)十二烷酸(84)(9.0g，30.0mmol)、苯甲醇(85)(3.1g，30.0mmol)、EDC盐酸盐(6.9g，36.0mmol)和三乙胺(12ml，90.0mmol)于二氯甲烷(100ml)中的溶液搅拌过夜。完成后，用饱和碳酸氢钠溶液(100ml)和盐水(100ml)洗涤溶液。在硫酸镁上干燥二氯甲烷溶液，过滤并且浓缩至干。在硅胶60上通过柱色谱法(梯度：含0至50％乙酸乙酯的己烷)纯化，得到呈无色固体状的标题化合物(2.0g，21％，经过两个步骤)。

步骤3.制备三氟乙酸12-(苯甲氧基)-12-氧代十二烷-1-铵87

在室温下将12-((叔丁氧基羰基)氨基)十二烷酸苯甲酯(86)(2.0g，4.9mmol)、二氯甲烷(15ml)和TFA(5ml)的溶液搅拌过夜。将反应混合物浓缩至干，得到呈粘性油状的产物(2.1g，定量)。

步骤4.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-(12-((12-(苯甲氧基)-12-氧代十二烷基)氨基)-12-氧代十二烷酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯88

在室温下将12-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-12-氧代十二烷酸(88)(750mg，0.54mmol)、三氟乙酸12-(苯甲氧基)-12-氧代十二烷-1-铵(87)(225mg，0.54mmol)、HBTU(210mg，0.54mmol)和二异丙基乙胺(0.3ml，1.62mmol)于二氯甲烷(30ml)中的溶液搅拌过夜。用二氯甲烷(50ml)稀释溶液，并且用饱和碳酸氢盐溶液(100ml)洗涤。在硫酸镁上干燥二氯甲烷，过滤并且在真空中浓缩至干。在硅胶60上通过柱色谱法(梯度：含0至10％甲醇的二氯甲烷)纯化残余物，得到呈无色固体状的标题化合物(88)(605mg，70％)。

步骤5.制备12-(12-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-12-氧代十二烷酰氨基)十二烷酸89

如先前所描述进行氢化，得到(89)(350mg，55％)

步骤6.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-(12-氧代-12-((12-氧代-12-(全氟苯氧基)-十二烷基)氨基)十二烷酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)-四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯90

如先前所描述进行PFP酯的形成，得到所需的产物(90)(112mg，23％)。

流程20制备化合物94

步骤1.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-(2-(12-(苯甲氧基)-12-氧代十二烷酰氨基)乙酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯92

在室温下将三氟乙酸2-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙-1-铵(91)(1.0g，0.8mmol)、12-(苯甲氧基)-12-氧代十二烷酸(76)(256mg，0.8mmol)、HBTU(341mg，0.9mmol)和二异丙基乙胺(0.4ml，2.4mmol)于二氯甲烷(20ml)中的溶液搅拌过夜。完成后，用二氯甲烷(80ml)稀释反应混合物，并且用饱和碳酸氢钠(100ml)洗涤。在硫酸镁上干燥溶液，过滤并且在真空中浓缩至干。在硅胶60上通过柱色谱法(梯度：含0至10％甲醇的二氯甲烷)纯化残余物，得到呈无色固体状的标题化合物(0.8g，68％)。

步骤2.制备12-((2-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-12-氧代十二烷酸93

使用与本文中对于类似转化所描述的那些条件类似的条件制备化合物93(450mg，60％)。

步骤3.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-(2-(12-氧代-12-(全氟苯氧基)十二烷酰氨基)乙酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯94

使用与本文中对于类似转化所描述的那些条件类似的条件制备化合物94(460mg，91％)。质量(ESI+)m/z 1537.8(M+H)。

流程21制备化合物95

合成四乙酸(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-((((((((5-(2-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((((2-氰基乙氧基)(二异丙氨基)磷烷基)-氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)乙酰氨基)-间苯二甲酰基)双(氮烷二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))-双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三基)酯95

向二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨甲酰基)-5-(2-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)乙酰氨基)苯甲酰氨基)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(72)(1.6g，0.9mmol)和二异丙基乙胺(0.4ml，1.8mmol)于无水二氯甲烷(25ml)中的溶液中添加2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(0.3ml，1.35mmol)。在室温下搅拌溶液75分钟，然后浓缩至干。通过柱色谱法(梯度：含0至10％MeOH的DCM(0.1％TEA))纯化残余物，得到呈无色固体状的产物(1.1g，62％)。31P NMR(400MHz,DMSO-d6):δ146.76(s),146.42(s,2个重叠信号),146.34(s)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.20(s,1H),8.54(t,J＝5.6Hz,2H),8.17-8.09(m,3H),7.94(s,1H),7.80(d,J＝9.2Hz,2H),7.39-7.26(m,4H),7.26-7.17(m,6H),6.91-6.83(m,4H),5.21(d,J＝3.4Hz,2H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,2H),4.54(d,J＝8.5Hz,2H),4.02(s,6H),3.93-3.82(m,4H),3.73(s,10H),3.66-3.36(m,35H),3.28-3.06(m,6H),3.06-2.87(m,3H),2.72-2.63(m,J＝11.5,5.8Hz,2H),2.10(m,12H),1.99(s,6H),1.89(s,6H),1.77(s,6H),1.47(d,J＝7.2Hz,4H),1.23(dq,J＝13.9,6.4Hz,18H),1.17-1.04(m,10H),0.98(dt,J＝13.4,5.9Hz,10H)。

流程22制备化合物96

步骤1.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-(2-(12-((10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸基)氨基)十二烷酰氨基)乙酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯95

使用与本文中对于类似转化所描述的那些条件类似的条件制备化合物95(1.9g，61％)。

步骤2：制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨甲酰基)-5-(2-(12-((10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-甲基)-4-((((2-氰基乙氧基)(二异丙氨基)磷烷基)氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸基)氨基)十二烷酰氨基)乙酰氨基)苯甲酰氨基)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯96

使用与本文中对于类似转化所描述的那些条件类似的条件制备化合物96(1.35g，65％)。

流程23具有通过寡核苷酸的3'末端偶联的寡核苷酸的式I缀合物的一般合成(化合物73)

从对于4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸所例示的琥珀酸酯配体合成双齿ASGPr靶向配体的一般方法97

使用标准酰胺偶联化学将琥珀酸酯负载至

流程24和25具有通过寡核苷酸的5'末端偶联的寡核苷酸的式I缀合物的一般合成(化合物98)

使用标准偶联条件使五氟苯酯与在有义股寡核苷酸上具有磷酸酯/硫代磷酸酯连接的C

使用标准亚磷酰胺偶联化学将亚磷酰胺与有义股末端核苷酸的5'羟基偶联。标准裂解和脱保护得到所需的有义股缀合物。举例来说，亚磷酰胺95用于得到以下缀合物99。

实施例1-9

使用流程23中所说明的一般程序，制备本发明的以下缀合物，其中R

实施例1

MS(+VE)计算值：8184.7；测量值：8184.2

实施例2

MS(+VE)计算值：8212.7；测量值8211.9

实施例3

MS(+VE)计算值：8212.7；测量值：8212.8

实施例4

MS(+VE)计算值：8096.6；测量值：8097.0

实施例5

MS(+VE)计算值：8499.0；测量值：8498.7

实施例6

MS(+VE)计算值：8284.7；测量值：8283.8

实施例7

MS(+VE)计算值：7596.0；测量值：7596.8

实施例8

MS(+VE)计算值：8140.6；测量值：8139.6

实施例9

MS(+VE)计算值：8038.5；测量值：8037.5

实施例10-11

使用流程24中所说明的一般程序，制备本发明的以下缀合物，其中R

实施例10

MS(+VE)计算值：8056.7；测量值：8056.1

实施例11

MS(+VE)计算值：8254.0；测量值：8253.5

实施例12：TTR siRNA双齿缀合物的体内测试

在TTR敲减的野生型小鼠模型中测试其中寡核苷酸是表A中所描述的修饰的TTRsiRNA的双齿缀合物(实施例1-8)的体内活性。TTR缀合物是用于TTR(运甲状腺素蛋白)淀粉样变性的罕见疾病的一种可能的治疗。在罹患这种疾病的那些人中，已知运甲状腺素蛋白的错误折叠和聚集与疾病进展相关。通过使用这种siRNA缀合物，可以减少患者体内错误折叠/聚集的蛋白质的量，从而可能使疾病的进展停止。

表A.化学修饰的TTR siRNA双链体

2'-O-甲基核苷酸＝小写；2'-氟核苷酸＝

TTR siRNA序列和动物模型均由Nair等J.Am.Chem.Soc.,2014,136(49),16958-16961描述。所有与动物有关的程序都根据书面操作程序，依照加拿大动物护理委员会(CCAC)的良好动物实践指南来进行，并且得到当地机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。

siRNA治疗：在肩胛区中经由皮下注射，第0天向雌性C57BL/6小鼠(n＝4)施用一次2mg/kg单剂量的TTR siRNA缀合物(每只动物1个剂量)。一组仅施用媒剂(PBS)的动物充当对照。

采集：在施用测试物品之后的规定时间点(第2天、第4天、第5天、第7天、第8天、第9天、第14天和第21天)对所有动物进行测试放血，以确定血浆TTR水平的最大降低和药理活性的持续时间。

分析：使用Abnova Prealbumin(小鼠)ELISA试剂盒(Cedar Lane，目录号KA2070)按照制造商的说明书确定血浆样品中的TTR蛋白水平。计算各个血浆样品的TTR血浆蛋白值并且确定每组的平均值。从这些平均值，确定相对于对照的TTR蛋白水平(相对于PBS处理的动物的％)。

结果：测试结果呈现于表B中。值代表治疗后第2天、第4天、第5天、第7天、第8天、第9天、第14天和第21天的％TTR蛋白水平(相对于PBS对照)。

结论：用TTR双齿缀合物治疗的动物展现出明显的靶mRNA和蛋白质敲减，在皮下注射后第4天与第9天之间出现最大的TTR蛋白敲减。

表B.单次静脉内施用(2mg/kg)来自表A的GalNAc双齿缀合的siRNA之后小鼠体内的血浆TTR蛋白水平。

TTR蛋白数据表示为PBS处理的小鼠值的百分比

实施例13：TTR siRNA双齿缀合物的体内测试

在TTR敲减的野生型小鼠模型中测试其中R

化合物A(单价)

化合物B(双齿)

化合物C(三价)

化合物D(四价)

TTR缀合物是用于TTR(运甲状腺素蛋白)淀粉样变性的罕见疾病的一种可能的治疗。在罹患这种疾病的那些人中，已知运甲状腺素蛋白的错误折叠和聚集与疾病进展相关。通过使用这种siRNA缀合物，可以减少患者体内错误折叠/聚集的蛋白质的量，从而可能使疾病的进展停止。

采集：在施用测试物品之后的规定时间点(第2天、第5天、第7天、第14天和第21天)对所有动物进行测试放血，以确定血浆TTR水平的最大降低和药理活性的持续时间。

结果：测试结果呈现于表C中。值代表治疗后第2天、第5天、第7天、第14天和第21天的％TTR蛋白水平(相对于PBS对照)。

结论：用TTR双齿、三价和四价缀合物治疗的动物展现出类似水平的靶mRNA和蛋白质敲减，在皮下注射后第2天与第7天之间出现最大的TTR蛋白敲减。TTR单价缀合物显示极少的(如果有的话)靶mRNA和蛋白质敲减。

表C.单次静脉内施用(2mg/kg)GalNAc缀合的siRNA化合物A-D之后小鼠体内的血浆TTR蛋白水平。

TTR蛋白数据表示为PBS处理的小鼠值的百分比

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专利发明人：詹姆斯·海斯;理查德·J·霍兰德;洛恩·拉尔夫·帕尔默;马克·伍德;
专利申请人：阿布特斯生物制药公司;