一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) lut-Y1，其发酵液能抑制多种植物病原菌生长，还涉及其在抑制植物病原菌生长方面的应用。

背景技术

霉菌、细菌等病原微生物寄生在果蔬伤口、植物体内引起果蔬腐败和植物病害，不仅导致作物生长缓慢、减产，还可能引起果蔬外观、气味、色泽改变，影响外观或造成食物中毒或过敏。化学防腐剂由于腐蚀性强，或者难于分解，存在食品安全风险，正在逐渐被低毒、高效的生防制剂取代。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种来源广泛的细菌，在果蔬霉腐斑、土壤、水体中都能分离到。不同的解淀粉芽孢杆菌菌株有不同的特性，有的菌株有较强的次生代谢产物产生能力，能够分泌多种抗菌蛋白、抗生素、酶或多肽等活性物质，促进植物生长，防治植物真菌病害；有的菌株能抑制植物病原菌或腐败菌，可制成生防制剂，用于果蔬保鲜；有的菌株作为生物肥料促进植物的生长发育，提高植物品质。

链格孢菌(Alternaria alternate)是丝孢纲丝孢目链格孢属的一种，也是一种主要的农作物致病菌，能引起梨、红枣黑斑病。哈密瓜、梨、红枣果实感染链格孢菌后表皮出现褐色、凹陷的圆斑，果肉呈现黑色海绵状，失去商品性。

小孢壳二孢(Ascochyta leptospora)是半知菌亚门、球壳孢目、壳二孢属的一种真菌。壳二孢属真菌能引起枇杷壳二孢轮纹病、花生云纹斑病、龙眼枯叶病。小孢壳二孢则导致黑麦草枯萎病，给草坪的生产管理带来巨大损失。

德氏霉属(Drechsleraspp.)一些种在小麦在灌浆期侵染，使子粒胚部变黑，引起小麦黑胚病。该病虽然对小麦产量影响不大，但影响子粒的外观品质，种子的发芽率和出苗率。德氏霉属的另一些种类能引起多种草坪禾草发生叶斑、叶枯、根腐和茎基腐，造成草坪早衰、秃斑，严重危害草坪景观。

发明内容

本发明的目的是提供一株能拮抗多种病原菌的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)lut-Y1，其于2020年7月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心 (GCMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为，保藏编号为CGMCC NO.20462，其在抑制多种植物病原菌中能广泛应用。

本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens lut-Y1，其保藏编号为： CGMCC NO.20462。

本发明还提供上述的解淀粉芽孢杆菌lut-Y1发酵产物的制备方法，将上述的解淀粉芽孢杆菌lut-Y1接种在牛肉膏蛋白胨液体培养基(LB)中，得到发酵液，将发酵液离心后取上清液，得到解淀粉芽孢杆菌lut-Y1发酵产物。

作为优选，所述培养的条件为：在25-37℃下，120-160r·min

本发明还提供一种生物防治制剂，所述生物防治制剂的有效成分为应用上述方法制备的解淀粉芽孢杆菌lut-Y1发酵产物。

本发明还提供上述的解淀粉芽孢杆菌lut-Y1的菌体、芽体或生物防治制剂在制备抑制霉腐病原菌的产品中的应用。

作为优选，所述产品包括果蔬保鲜防腐剂、植物病害防治制剂和药物。

作为优选，所述霉腐病原菌为链格孢菌、小孢壳二孢和/或一种德氏霉属霉菌。

本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1是从甘肃省兰州市永登县枸杞生产合作社产的枸杞鲜果霉腐斑中分离得到，经扩增16s rDNA序列测序分析及形态学鉴定确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1微生物学特性为：在牛肉膏蛋白胨培养基(LB)上，30℃下培养24h形成浅棕黄色圆形菌落，边缘齐整，大且厚，中间隆起，不透明，光滑湿润，易被挑起；同样条件下在NA培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上形成乳白色圆形湿润菌落。在LB培养基中添加质量百分比为1％-1.25％的NaCl能促进生长，能耐受质量百分比2％以下的NaCl，当NaCl的质量百分比浓度大于2.5％时，显著抑制该菌株生长。该菌株生长曲线特征是：0-2h为潜伏期，2-14h为指数生长期，14-18h稳定生长。

本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1发酵液能作为生物防治制剂抑制链格孢菌(Alternaria alternate)、小孢壳二孢(Ascochytaleptospora)、一种德氏霉属 (Drechsleraspp.)霉菌的生长，将在果蔬防霉腐和由这些霉菌引起的植物病害防治方面有广泛广阔的应用价值。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1在不同培养基上的菌落形态。

图2为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1的细胞形态。

图3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1的16S rDNA序列与Gen Bank 核酸数据库比对结果。

图4为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1在不同盐浓度下生长情况。

图5为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1在LB培养基中的生长曲线。

图6为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1生物防治制剂对链格孢菌(Alternaria alternate)的抑制效果。

图7为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1生物防治制剂对小孢壳二孢 (Ascochyta leptospora)的抑制效果。

图8为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1生物防治制剂对一种德氏霉属(Drechsleraspp.)霉菌的抑制效果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。

本发明的培养基配制方法为：

牛肉膏蛋白胨培养基(LB)：称取3g牛肉膏，10g蛋白胨，5g氯化钠，20g琼脂，补水至1L，加热溶解，调pH为7.0，灭菌后分装至培养皿制成LB固体培养基；LB液体培养基制备同LB固体培养基，只是不加琼脂粉。

NA培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，琼脂20g，补水至1L，加热溶解，调为pH7.2-7.4，灭菌。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，补水至1L，自然pH，灭菌。

菌株来源：链格孢菌(Alternaria alternate)由本实验室从甘肃省兰州市永登县枸杞生产合作社产的枸杞鲜果霉腐斑中分离得到并保存，具体分离鉴定过程见文献(袁惠君，李虎军，贾鸿震，等。永登枸杞鲜果晾晒过程中霉腐病原真菌的分离鉴定。食品工业科技。 2016,37(21):135-138.)。

小孢壳二孢(Ascochyta leptospora)和一种德氏霉属(Drechslera spp.)霉菌由兰州大学草地农业科技学院植物病理实验室赠送，具体分离鉴定过程见文献(马敏芝.多年生黑麦草—内生真菌共生体抗病性及其对根腐离蠕孢(Bipolaris sorokiniana)抗病机制的研究[D]. 2015.)。

实施例1

本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1是从甘肃省兰州市永登县枸杞生产合作社产的枸杞鲜果霉腐斑中分离得到。分离过程为：宁夏枸杞霉腐果实于2014 年8月采自甘肃省兰州市永登县上川镇枸杞生产合作社晒床，置于无菌安倍瓶中当天运至本校实验室进行分离和纯化，采用组织分离法，选择晾晒3d病斑典型的发病果实冲洗干净后，在病健交界处剪下5mm×5mm的小块组织，先用2％的次氯酸钠表面消毒8min，无菌水洗5遍，再用75％的酒精消毒30s，无菌水洗8遍后，移至灭菌培养皿中加1mL 无菌水捣碎，用接种环蘸取含菌组织液在PDA平板上划线，28℃培养并挑取单菌落，连续纯化3次后的纯培养物保存于PDA斜面培养基上置于4℃冰箱贮存备用；将代表菌株分别置于不同的培养基上。细菌在LB培养基37℃下培养1d，观察记录菌落培养性状(图1)。挑取细菌，粘在样品台上，置于液氮中速冻后在扫描电镜下观察细胞形态特征(图2)。将供试菌株接种到PDA培养基上于30℃培养2d后送至大连宝生物工程有限公司提取菌株基因组DNA、用通用引物进行16S rDNA序列的PCR扩增，经双向测序得到rDNA序列，与Gen Bank核酸数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行比对(图3)，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。将该菌株于2020年7月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(GCMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏编号为CGMCC NO.20462。

实施例2

本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1 CGMCCNO.20462的抑菌性能的具体实验过程为：

(1)菌种活化：将已经灭菌的LB固体培养基分装在50mL试管里，每个试管倒15mL左右，斜置于桌面，做成斜面培养基，待培养基冷却凝固；用接种针将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1 CGMCC NO.20462划线接种于斜面培养基上，室温培养 24h。菌悬液的制备为：分别向斜面菌种中加入4mL无菌水，充分振荡，制成菌悬液。

(2)观察菌落形态：将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1划线于LB、 NA、PDA固体培养基平板上，37℃倒置培养24h后观察菌落形态。

(3)耐盐性测定：将500μl的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1菌悬液分别接种到50ml含有1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％和2.5％质量百分数的LB-NaCl 液体培养基，30℃，160r/min摇床振荡培养24h后，用分光光度计在波长660nm处测定培养液的吸光值。每处理设5次重复。

(4)生长曲线测定：将50μl的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1菌悬液加入到50ml的LB液体培养基中，30℃，160r/min摇床振荡培养24h，每2h通过分光光度计在波长660nm处测定培养液的吸光值，以吸光度为纵轴，时间为横轴，绘制生长曲线。每处理设5次重复。

(5)生物防治制剂的制备：在LB液体培养基中接入解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)lut-Y1菌株，接种量为500μL菌悬液，在30℃条件下，160r·min

(6)制作接种用菌饼：分别向待试菌链格孢菌(Alternaria alternate)、小孢壳二孢(Ascochyta leptospora)、一种德氏霉属(Drechslera spp.)霉菌斜面菌种中加入4mL无菌水，充分振荡，制成菌悬液后，取1mL涂布在PDA固体培养基平板中，细菌在室温下培养1-2天，霉菌在室温下培养5-7天，至菌体长满平板，用无菌打孔器在平板中央取直径为1cm 的待试菌菌饼。

(7)本发明的生物防治制剂对待试菌的抑制效果：按表1配比配制梯度浓度生物防治制剂-PDA固体培养基，灭菌后分装在直径9cm的培养皿中，每皿25mL。在生物防治制剂-PDA固体培养基平板中央贴待试菌菌饼，每菌种重复4次，将接种待试菌菌饼的培养皿置于30℃的恒温培养箱分别培养5-7d，观察菌落形态，并测量待试菌的生长圈直径，用SPSSStatistics 21统计软件进行单因素方差分析待试菌的生长圈直径变化。

表1梯度浓度生物防治制剂-PDA液体培养基的配制比例

实验结果为：

(1)本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1在牛肉膏蛋白胨培养基(LB)上，30℃下培养24h形成浅棕黄色圆形菌落，边缘齐整，大且厚，中间隆起，不透明，光滑湿润，易被挑起；同样条件下在NA培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 上形成乳白色圆形湿润菌落(图1)。扫描电镜下菌体呈圆杆状或椭圆形(图2)。16S rDNA 测序得到1468bp rDNA序列，与GenBank中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)(登录号:HG328253.1、CP003838.1、CP010556.1、KP119809.1、KM373520.1、KM015452.1) 的菌株序列相似性均达100％(图3)。根据上述形态和分子生物学特征，将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1的16s rDNA序列如下：

图1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1在不同培养基上的菌落形态。

图2为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1的细胞形态。

图3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1的16S rDNA序列与Gen Bank 核酸数据库比对结果。

(2)本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1菌株在LB培养基中添加1％-1.25％NaCl能促进生长，能耐受2％以下的NaCl，当NaCl的浓度大于2％时，显著抑制该菌株生长(图4)。

图4为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1在不同盐浓度下生长情况。

(3)本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1菌株的生长曲线特征是：0-2h为潜伏期，2-14h为指数生长期，14-18h稳定生长(图5)。

图5为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1在LB培养基中的生长曲线。

(4)本发明的生物防治制剂对链格孢菌(Alternaria alternate)的生长有显著抑制作用。与对照相比，培养基中添加体积百分数8％、17％、25％、33％生物防治制剂，能使链格孢菌落直径分别降低31％、59％、87％、100％(图6)。

图6为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1生物防治制剂对链格孢菌 (Alternaria alternate)的抑制效果。

(6)本发明的生物防治制剂对小孢壳二孢(Ascochyta leptospora)生长有显著的抑制作用。与对照相比，培养基中添加体积百分数8％、17％、25％、33％生物防治制剂，能使小孢壳二孢菌落直径分别降低25％、44％、68％、98％(图7)。

图7为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1生物防治制剂对小孢壳二孢 (Ascochyta leptospora)的抑制效果。

(7)本发明的生物防治制剂对一种德氏霉属霉菌(Drechslera spp.)的生长有显著的抑制作用。与对照相比，培养基中添加体积百分数8％、17％、25％、33％生物防治制剂，能使德氏属霉菌落直径分别降低23％、40％、78％、89％(图8)。

图8为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1生物防治制剂对一种德氏霉属(Drechslera spp.)霉菌的抑制效果。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 兰州理工大学

<120> 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1468

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 1

acgctgtgag cgcgtgccta atacatgcaa gtcccggggg cagatgggag cttgctccct 60

gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac 120

tccgggaaac cggggctaat accggatggt tgtctgaacc gcagggttca gacataaaag 180

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