双链RNA及其用途

技术领域

本公开涉及非侵入性的和等位基因特异性治疗，特别是用于马查多-约瑟夫病(MJD)。本公开使用针对共济失调蛋白3基因中的外显子单核苷酸多态性(SNP)的RNA沉默技术(例如，RNA干扰)，其编码显性功能获得性突变体共济失调-3蛋白，从而导致对MJD的有效治疗。为此，设计并测试了高靶标特异性基因沉默RNA，其反义序列与致病性扩增处于连锁不平衡的SNP互补。

此外，本公开还涉及选择的腺相关病毒载体，特别是作为基因递送载体的血清型9(AAV9)，其上所述双链RNA可以通过微创途径被递送至中枢神经系统(CNS)(例如，静脉内施用)，因为这种特定的血清型有效地穿过血脑屏障(BBB)。

背景技术

马查多-约瑟夫病(MJD)是一种显性常染色体神经退行性疾病，其特征是小脑功能障碍和运动协调性丧失。该疾病与全世界最常见类型的共济失调相对应，是由共济失调-3基因(MJD1/ATXN3基因)编码区的遗传突变引起的。遗传突变涉及共济失调-3基因的DNA片段，称为CAG三核苷酸重复序列。通常，人的共济失调-3基因中的CAG片段被重复多次，即约10-42次。形成MJD的人在至少一个等位基因中的CAG重复序列的数量增加。患病的人通常从一个患病的父母遗传突变体等位基因。CAG重复序列超过51的人可能会出现MJD的体征和症状，而重复序列为60或更多的人几乎总是会出现这种疾病。CAG重复序列大小的增加导致产生伸长的(突变型)共济失调-3蛋白。该蛋白质在细胞中加工成较小的片段，这些片段具有细胞毒性，并在神经元中积累和聚集。这触发多种致病机制，最终导致多个脑区域发生神经退行性疾病，这是MJD症状和体征的基础。

纠正MJD的最直接、特异和有效的解决方案之一是使用RNA干扰(RNAi)抑制突变体共济失调-3表达，从而靶向该疾病的最初原因。RNAi是一种自然发生的机制，涉及信使RNA(mRNA)的序列特异性下调。mRNA的下调导致表达的蛋白质的量减少。RNAi由双链RNA(dsRNA)触发。dsRNA的一条链与其靶标mRNA基本或完全互补。该链被称为引导链或反义链。RNAi的机制涉及将引导链掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。在此过程中，RISC更喜欢5'端与其互补链更松散配对的链。RISC是一个多周转复合物，通过互补碱基配对与其靶mRNA结合。一旦与其靶标mRNA结合，它就可以切割mRNA或降低翻译效率。RISC可以在与引导链的核苷酸10和11配对的残基之间切割mRNA。自从发现以来，RNAi已被广泛用于敲除特定的靶基因。已经采用的诱导RNAi的起因包括使用小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。此外，可以自然触发RNAi的分子，即所谓的微小RNA(miRNA)，已被用于制造模仿其天然对应物的人工miRNA。这些策略的共同点是它们提供了旨在靶向所选基因的dsRNA分子。利用RNAi的序列特异性模式的基于RNAi的治疗方法正在开发中，目前有几种正在临床试验中。

RNA干扰已被用于靶向突变和非突变体共济失调-3基因(WO2005105995，Alves等，2010)。在后一种情况下，大鼠中正常的共济失调-3蛋白的敲低没有显示出具有任何明显的有害作用。然而，尚不清楚人脑中的神经细胞是否能耐受突变和非突变共济失调-3基因的长期沉默。因此，应该探索调节沉默或仅抑制突变等位基因的努力，因为MJD需要数十年的治疗。

一种最特异性和有效的解决方案是靶向位于共济失调-3基因的编码区中的SNP，特别是与疾病等位基因处于连锁不平衡的SNP碱基核苷酸。例如，位于扩增的CAG尾巴3'末端的SNP中的胞嘧啶(C)(

已经通过在rs12895357使用针对胞嘧啶(C)的siRNA或shRNA在细胞(US10072264B2)和MJD的啮齿动物模型(Alves等，2008a，Nobrega等，2013)中研究了突变体共济失调-3基因的等位基因特异性还原。然而，在这些先前的研究中，设计的序列不允许突变体等位基因的完全等位基因特异性沉默。此外，在持久治疗或野生型动物中，未评估沉默序列在啮齿动物模型的中枢神经系统(CNS)中的毒性。实际上，最近有报道说，shRNAs在长期治疗或使用高剂量时可导致严重的脑毒性。毒性副作用与细胞RNAi机制的饱和和内源性miRNA表达的变化有关。此外，在啮齿动物模型中突变体共济失调-3的先前等位基因特异性和基于病毒的沉默涉及开颅术和将病毒载体直接施用到脑实质中，这是一种侵入性程序，与潜在的不良反应相关，并导致整个大脑中有限的载体分散，因此不靶向MJD中受影响的所有区域。

公开这些事实是为了说明本公开解决的技术问题。

发明内容

一般说明

由于MJD涉及突变体脊髓小脑性共济失调3蛋白的表达，其积累导致疾病，RNAi提供了治疗疾病的机会，因为它可以减少脊髓小脑性共济失调3基因的表达。该方法的相关范例涉及突变体共济失调-3mRNA的水平的降低，同时保留正常的脊髓小脑性共济失调型3mRNA，从而降低突变体共济失调-3蛋白产生的毒性作用，实现降低和/或延迟MJD症状，或甚至完全预防MJD症状。

本公开提供了包含第一RNA序列和第二RNA序列的靶向SNP的dsRNA，其中所述第一RNA序列和第二RNA序列基本上互补，其中所述第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度，优选地具有19-23个核苷酸的序列长度，并且与SEQ ID NO.1、7、13、19互补。所述dsRNA用于诱导针对人突变体共济失调-3基因的靶标特异性RNAi。

本公开的靶向SNP的dsRNA涉及靶向存在于疾病等位基因的两个编码区域中的SNP，即rs12895357(外显子10)和rs1048755(外显子8)(图1)。这样的dsRNA可以直接或直接通过转染或间接通过DNA的递送(例如转染)或通过在其上可表达所述dsRNA的载体介导的表达在细胞中单独或组合递送，以特异性地靶向并减少突变型共济失调-3基因的表达，其在rs12895357(

特别地，当在miRNA支架中提供时，本公开的设计的靶向SNP的dsRNA之一，其第一链/序列是SEQ ID NO.2，能够通过靶向rs12895357处的C核苷酸而降低突变体共济失调-3mRNA和蛋白水平。与本领域中现有技术的靶向SNP的dsRNA相比时，该dsRNA提供了改进，其在靶向突变体共济失调-3基因方面更具特异性。当在基于慢病毒的MJD小鼠模型的纹状体中递送时，通过miRNA盒中的AAV9介导的表达，能够减少神经元细胞死亡和突变体共济失调-3聚集体。此外，当静脉内施用时，它能够在非常严重的MJD转基因小鼠模型中减少运动行为缺陷、小脑神经病理学和磁共振波谱生物标志物缺陷。

根据本公开的DsRNA可以siRNA、shRNA、pre-miRNA或pri-miRNA的形式提供。这样的dsRNA可以直接递送至靶细胞，例如，通过使用例如转染方法的细胞摄取。优选地，使用基因治疗载体实现所述递送，其中在载体中包括用于siRNA、shRNA、pre-miRNA或pri-miRNA的表达盒。以这种方式，可以为细胞提供恒定供应量的dsRNA，以实现持久的共济失调-3基因抑制，而无需重复施用。优选地，选择的病毒载体是AAV9或衍生物，因为该特定的AAV血清型有效地穿过BBB，从而能实现静脉内施用。可从https://www.addgene.org/viral-service/aav-prep/获得AAV9、AAVrh10或衍生物，例如PHP.B或PHP.eB或PHP.S。

因此，本公开提供了根据本公开的dsRNA的医学用途，例如MJD的治疗，其中这样的医学用途还可包含表达盒或病毒载体，例如AAV9，其能够表达本公开的所述dsRNA。

本公开涉及包含第一链RNA和第二链RNA的双链RNA，其中：

第一链RNA和第二链RNA基本上彼此互补，优选地第一链RNA和第二链彼此至少90％互补；

第一链RNA具有至少19个核苷酸的序列长度；

第一链RNA与SEQ ID NO.1、7、13或19至少86％互补；

第一链RNA与SEQ ID NO.26不同；且

第一链RNA的第一核苷酸不同于胞嘧啶。

在一个实施方式中，第一链RNA可具有至少19个核苷酸至23个核苷酸的序列长度，优选地，第一链RNA可以具有20-22个核苷酸的序列长度，更优选地并且为了获得更好的结果，第一链RNA可以具有21-22个核苷酸的序列长度，甚至更优选地并且为了获得甚至更好的结果，第一链RNA可以具有22个核苷酸的序列长度。

在一个实施方式中，第一链RNA可以与SEQ ID NO.2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、14、15、16、17、18、20、21、22、23或24具有90％同一性；优选地与SEQ ID NO.2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、14、15、16、17、18、20、21、22、23或24具有95％同一性；更优选地，与SEQ ID NO.2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、14、15、16、17、18、20、21、22、23或24具有100％同一性。

如下表中所概述测定同一性：

在一个实施方式中，第一链RNA可以与SEQ ID NO.1、7、13或19为至少90％互补，优选与SEQ ID No.1、7、13或19为95％互补，更优选与SEQ ID NO.1、7、13或19为99％互补，甚至更优选地，第一链RNA与SEQ ID NO.1、7、13、19为100％互补。

在一个实施方式中，第一链RNA可以选自SEQ ID NO.2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、14、15、16、17、18、20、21、22、23或24。

在一个实施方式中，并且为了获得更好的结果，第一链RNA可以与SEQ ID NO.1互补，且第一链RNA可以选自SEQ ID NO.2、3、4、5或6。

在一个实施方式中，并且为了获得甚至更好的结果，第一链RNA可以是SEQ IDNO.2或者可以是SEQ ID NO.3。

在一个实施方式中，第一链RNA可以与SEQ ID NO.7互补，且第一链RNA可以选自SEQ ID NO.8、9、10、11或12。

在一个实施方式中，第一链RNA可以与SEQ ID NO.13互补，且第一链RNA可以选自SEQ ID NO.14、15、16、17或18。

在一个实施方式中，第一链RNA可以与SEQ ID NO.19互补，且第一链RNA可以选自SEQ ID NO.20、21、22、23或24。

在一个实施方式中，并且为了获得甚至更好的结果，第一链RNA的第一核苷酸可以是尿嘧啶。

在一个实施方式中，双链RNA可以包含在pre-miRNA支架、pri-miRNA支架、miRNA支架、shRNA或siRNA中，优选地为miRNA支架或shRNA，更优选地为miRNA。

在一个实施方式中，双链RNA可以包含在miRNA支架中，优选衍生自miR-155，例如Chung等(2006)中所公开的一种，更优选其中基于miR155的支架包含SEQ ID NO.27、28和29。

本公开还涉及：编码现在公开的双链RNA的分离的DNA序列，包含所述分离的DNA序列或所述双链RNA的表达盒。

本公开还涉及包含现在公开的分离的DNA或双链RNA或表达盒的载体；优选地，其中所述载体是腺相关病毒载体或慢病毒载体或腺病毒载体或非病毒载体；更优选地，其中腺相关病毒载体是AAV9或AAVrh10或PHP.B或PHP.eB或PHP.S。

本公开还涉及包含现在公开的分离的DNA序列或双链RNA或表达盒或载体的宿主细胞，优选其中所述宿主细胞是真核细胞，更优选地其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

本公开进一步涉及包含现在公开的分离的DNA或双链RNA或表达盒或载体或宿主细胞的组合物。

本公开进一步涉及包含现在公开的分离的DNA序列或双链RNA或表达盒或载体或宿主细胞或组合物的试剂盒。

此外，本公开还涉及用于医学的双链RNA、包含编码所述双链RNA的分离的DNA序列的载体或包含所述分离的DNA序列的表达盒。

本公开进一步涉及双链RNA、包含编码所述双链RNA的分离的DNA序列的载体或包含所述分离的DNA序列的表达盒，其用于治疗或预防神经退行性疾病或用于治疗或预防所述神经退行性疾病的细胞毒的用途，优选地其中神经退行性疾病可以是三核苷酸重复疾病，更优选地其中神经退行性疾病可以是CAG三核苷酸重复疾病，甚至更优选地施用双链RNA、载体或表达盒以调节神经代谢物的水平，优选地增加N-乙酰基天冬氨酸、减少肌醇、甘油磷酸胆碱和磷酸胆碱。

在一个实施方式中，神经退行性疾病是马查多-约瑟夫病。

在一个实施方式中，双链RNA全身、静脉内、肿瘤内、口服、鼻内、腹膜内、肌内、椎内、脑内、脑室内、脑池内、鞘内、眼内、心内、皮内或皮下施用，优选为静脉内，脑池内、鞘内或原位施用，通过脑内施用。

在本公开中，术语互补是指可以通过氢键与另一核酸序列结合的核酸序列的核苷酸，即能够碱基配对的核苷酸。互补RNA链形成双链RNA。双链RNA可以由两条分开的互补RNA链形成，或者两条互补RNA链可以包含在一条RNA链中。在互补RNA链中，核苷酸胞嘧啶和鸟嘌呤(C和G)可以形成碱基对、鸟嘌呤和尿嘧啶(G和U)以及尿嘧啶和腺嘌呤(U和A)。

在本公开中，术语基本互补是指不需要第一和第二RNA序列是完全互补的，或者第一RNA序列和SEQ ID NO.1、7、13或19完全互补。

此外，在本公开中，第一RNA序列与SEQ ID NO.1、7、13或19之间基本互补是指没有错配、一个错配的核苷酸、两个错配的核苷酸或三个错配的核苷酸。例如，考虑第一RNA序列和SEQ ID NO.1，可以理解一个错配的核苷酸是指在与SEQ ID NO.1碱基配对的第一RNA序列的整个长度上，一个核苷酸不与SEQ ID NO.1碱基配对。没有错配是指所有核苷酸与SEQID NO.1碱基配对。具有2个错配是指两个核苷酸不与SEQ ID No.1碱基配对。具有3个错配是指三个核苷酸不与SEQ ID NO.1碱基配对。同样适用于第一RNA序列和SEQ ID NO.7，第一RNA序列和SEQ ID NO.13，或第一RNA序列和SEQ ID NO.19。

在本公开中，第一RNA序列也可以长于19个核苷酸；在这种情况下，在SEQ ID No.1的整个长度上测定基本互补。这是指当与第一RNA序列碱基配对时，该实施方式中的SEQ IDNO.1在其整个长度上没有、一个或两个错配。下表说明了以上各段中说明的内容：

附图说明

以下附图提供了用于例示说明书的优选实施方式，并且不应被视为限制本公开的范围。

图1：MJD1基因和外显子单核苷酸多态性rs1048755和rs12895357的示意图。MJD1基因由11个外显子(灰色框)组成。CAG重复位于外显子10上，MJD可能是由多于51的重复引起的。CAG扩增后立即识别SNP(核苷酸987)-rs12895357。非突变体等位基因通常在该位置显示鸟嘌呤(G)，而突变体等位基因在70％的MJD患者中表现出胞嘧啶(C)。在外显子8(核苷酸669)-rs1048755上鉴定另一个SNP。在这种情况下，非突变体等位基因通常在该位置显示鸟嘌呤(G)，而突变体等位基因在70％的MJD患者中表现出腺嘌呤(A)。

图2：miR-ATXN3在体外介导了突变体共济失调-3的有效和等位基因特异性沉默。(a)人工微小RNA(miRs)和短发夹(sh)载体构建体的表示。基于现在公开的沉默序列SEQ.IDNO.2，设计了人工微小RNA构建体，其用于突变共济失调-3(miR-ATXN3)的特异性沉默。还设计了对照miRNA(miR-对照)，其序列不会使任何哺乳动物RNA沉默。两者均在U6启动子的控制下并且使用EGFP报告基因插入到AAV2质粒载体主链中。还使用了编码特异性靶向突变体共济失调-3并且是本领域已知的shRNA的质粒，(Alves等，2008a)(sh-mutATXN3)；b,c)将先前被编码具有72Q(b)的人突变体共济失调-3或具有27Q(c)的人野生型共济失调-3的慢病毒载体感染的Neuro2a细胞(小鼠神经嵴衍生的细胞系)用编码miR-对照(对照条件)、miR-ATXN3和sh-ATXN3的质粒转染。miR-ATXN3诱导人突变体共济失调-3mRNA的42.03±6.26％的降低，但不影响人共济失调-3的野生型mRNA水平。这些结果分别由d)和e)中的蛋白质印迹支持。数据表示平均值±s.e.m.；NS P>0.05、*P<0.05和**P<0.01。b、c、d、e)使用Bonferroni事后检验的单因素方差分析(ANOVA)。miR-对照n＝5；miR-ATXN3 n＝5；sh-ATXN3 n＝5。根据GenEx分析选择用于归一化的内部对照，对应于内源性小鼠共济失调-3和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA水平。CMV，巨细胞病毒增强剂；CBA，鸡β-肌动蛋白启动子；EGFP，增强型绿色荧光蛋白；ITR，反向末端重复序列。

图3：SEQ ID NO.3，与SEQ ID NO.2(miR-ATXN3)类似地在体外介导了突变体共济失调-3的有效和等位基因特异性沉默。a,b)将先前用编码具有72Q(a)的人突变体共济失调-3或具有27Q(b)的人野生型共济失调-3的慢病毒载体感染的Neuro2a细胞用编码miR-对照，SEQ ID NO.2(miR-ATXN3)、SEQ ID NO.3或sh-ATXN3的质粒转染。编码SEQ ID NO.3的基于人工miR155的构建体与编码SEQ ID NO.2(miR-ATXN3)的构建体类似诱导人突变体共济失调-3mRNA水平的降低，不影响野生型mRNA水平。数据表示平均值±s.e.m.；NS P>0.05，*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。(a，b)使用Bonferroni事后检验的单因素方差分析(ANOVA)。miR-对照n＝5；miR-ATXN3 n＝5；SEQ ID NO.3n＝5，和sh-ATXN3 n＝5。根据GenEx分析选择用于归一化的内部对照，对应于内源性小鼠共济失调-3和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA水平。

图4：miR-ATXN3治疗在体外不引起内源性小鼠共济失调-3mRNA水平的改变。(a,b)用编码miR-对照、miR-ATXN3和sh-ATXN3的质粒转染被(a)人突变体共济失调-3(72Q)或(b)人野生型共济失调-3(27Q)感染的Neuro2a细胞。通过定量逆转录酶-PCR测定小鼠共济失调-3mRNA的相对表达水平。数据代表平均相对mRNA水平±s.e.m.；与miR-对照相比，ns＝p>0.05。使用Bonferroni事后检验进行单因素方差分析(ANOVA)。miR-对照n＝5；miR-ATXN3 n＝5；sh-ATXN3 n＝5。

图5：在基于慢病毒的MJD小鼠模型中，miR-ATXN3降低了突变体共济失调-3mRNA和突变体聚集型共济失调-3的水平，并防止了颅内注射后纹状体变性。(a)用于生成基于纹状体慢病毒的MJD小鼠模型并使用AAV9沉默突变体共济失调-3的策略的示意图。将十周龄的小鼠与编码具有72Q(LV-Atx3-MUT)人突变体共济失调-3的慢病毒载体(LV-Atx3-MUT)和编码右半球(AAV9-miR-ATXN3)中的miR-ATXN3和左半球(AAV9-miR-对照)中的miR-对照的AAV9载体双边共注射到纹状体中。手术五周后，对小鼠实施安乐死。(b)来自共聚焦显微镜的图像显示两种rAAV9载体均能有效转导MJD纹状体慢病毒模型的小鼠纹状体。(c)定量逆转录酶-PCR分析表明，与左对照半球相比，miR-ATXN3诱导突变体共济失调-3mRNA水平降低63.75±2.25％。(d)蛋白质印迹分析还证实miR-ATXN3表达显著减少突变体共济失调-3聚集体。(e)与miR-对照或mir-ATXN3共注射的MJD的基于纹状体慢病毒小鼠模型的纹状体中的泛素免疫反应性。在(f)中计数并定量突变体共济失调-3包涵体的总数。比例尺，50μm。(g)DARPP-32染色显示在与人突变体共济失调-3和miR-对照共感染的纹状体半球中DARPP-32免疫反应性的重大丧失。比例尺，200μm。在(h)中将其量化为DARPP-32染色的耗竭体积。(i)甲酚紫染色表明在两个半球都存在固缩核。在对照半球中可见更多的固缩核。在j)中对此进行量化。比例尺，20μm。数据表示平均值±s.e.m.；与对照半球相比，ns p>0.05，*p<0.05，***p<0.001。(c，d)配对的学生t检验。n＝5。(f,h)配对的学生t检验。n＝8。(j)配对的学生t检验。n＝4。

图6：静脉注射的rAAV9载体介导野生型和转基因MJD小鼠整个大脑的有效转导。3月龄鼠的大脑中GFP免疫组织化学的代表性图像(灰色表示)：A)未注射的转基因小鼠；B)在出生后第1天接受rAAV9-miR-ATXN3 IV注射的转基因小鼠；C)接受相同程序的野生型小鼠。图像显示通过5倍和20倍物镜获得的全脑、小脑(CB)、海马体(HIP)、桥脑核(PN)和髓质/脊髓(rdAV)的rAAV9转导。

图7：rAAV9载体表现出转基因小鼠小脑的有效转导。接受rAAV9-miR-ATXN3新生儿IV注射的3月龄小鼠小脑中GFP可见免疫组织化学的代表性图像(灰色表示)。以20倍物镜获得的图像显示出具有特别有效的转导作用的小脑区域，包括：小脑深核(DCN)、小叶10、9、7和6以及第四脑室的脉络丛细胞(4V)。

图8：rAAV9靶向转基因小鼠小脑中突变体共济失调-3积累的主要区域。代表性图像显示了在P1处接受rAAV9-miR-ATXN3注射的转基因小鼠小脑中的HA和GFP的免疫荧光。在具有20倍物镜的共聚焦显微镜中获得图像。a)rAAV9阳性浦肯野细胞的代表性图像，显示了HA和GFP信号的共定位(白色)。DCN-小脑深核；PCL-浦肯野细胞层。

图9：沉默突变体共济失调-3改善MJD转基因小鼠中的转帮性能。a)MJD转基因小鼠中的实验计划，分为三个重要任务：1)PN1处的AAV9静脉注射；2)在3个不同时间点的行为评估，以及3)牺牲和神经病理学分析。b)恒速(5r.p.m)下的转棒表现。c)加速度下的转棒表现。数据表示为对照组小鼠(miR-对照，n＝11)和注射miR-ATXN3(n＝8)的小鼠的跌落±SEM平均潜伏时间。使用未配对的学生t检验进行统计分析(*P≤0.05，**p<0.01)。

图10：miR-ATXN3处理改善MJD转基因小鼠的游泳、横木行走表现和步态脊髓小脑性共济失调。a)基于动物在游泳池中游泳和爬平台所花费的时间评估动物。数据表示为平均潜伏时间±SEM。b)基于在-mm圆横木上行走时的表现对动物进行评估。考虑到穿过横木的总时间和运动协调性，每只动物都得到一个分数。通过测量以下内容来分析步态模式：c)后基础宽度，d)前基础宽度和e)足迹重叠(cm)。数据以平均性能得分±SEM表示。使用未配对的学生t检验(*p<0.05)进行统计分析，比较对照小鼠(miR-对照，n＝11)和注射了rAAV9-miR-ATXN3(n＝8)的小鼠的表现。

图11：miR-ATXN3处理有效减少突变体共济失调-3聚集体的数量并有效保留分子层厚度。a)在对照(miR-对照)和治疗的(miR-ATXN3)转基因小鼠的小叶10中，免疫荧光标记突变体共济失调-3(白色的HA)的代表性图像。在具有20倍物镜的共聚焦显微镜中获得图像。b)在小叶10、9和6中每个面积的突变体共济失调-3聚集体的定量。c)用20倍物镜获得的经处理的和对照的转基因小鼠的小叶10中甲酚紫染色的代表性图像。d)小叶10、9和6中的分子层厚度的定量。值对应于每只动物三个特定部分的平均值±SEM(miR-对照，n＝11；miR-ATXN3，n＝8)。使用未配对的学生t检验进行统计分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。ML-分子层厚度；Lob10-小叶10

图12：在本公开中，AAV9-miR-ATXN3治疗影响的潜在可能机制的示意图。i)将编码miR-ATXN3的rAAV9载体静脉内注射到新生儿MJD转基因小鼠中，导致ii)小脑中的突变体共济失调-3沉默，因此iii)减轻神经病理和行为障碍。尽管rAAV9载体已在小叶10和9中有效转导浦肯野细胞(PC)，但其他机制可能潜在增加其转导水平和/或有益作用，例如：1)通过脉络丛中的转导的上皮细胞将病毒载体从血液转移到CSF中和/或将miR构建体分泌到CSF中；2)rAAV9从DCN逆行转运到PC层和/或将miR从DCN中的转导细胞转移到PC投影；3)在相邻PC之间传输或miR；4)rAAV9阳性PC诱导的神经保护作用。CSF-脑脊液；DCN-小脑深核；PC-浦肯野细胞

图13：不同的rAAV9转导水平与治疗的小鼠的神经病理学和行为参数有关。a)对于rAAV9-miR-ATXN3处理的动物(n＝8)，小叶9和10中的GFP平均强度(AU＝任意单位)与同一区域中的聚集体/mm

图14：rAAV9-miR-ATXN3 Iv注射不影响野生型小鼠中的转棒表现。a)恒速(5r.p.m)下的转棒表现。b)加速度下的转棒表现。数据表示为野生型小鼠(miR-对照，n＝5)和注射AAV9-miR-ATXN3(n＝5)的小鼠的跌落±SEM平均潜伏时间。使用未配对的学生t检验进行统计分析(ns＝非显著的)。

图15：miR-ATXN3治疗改善小脑中关键代谢产物的水平。a)磁共振波谱：75天时miR-对照、miR-ATXN3和WT小鼠的小脑神经化学图谱。当与野生型小鼠相比时，NAA、tChol和Ins代谢产物在转基因MJD中高度失调。当与对照组小鼠相比时，注射了rAAV9 miR-ATXN3的小鼠表现出较高水平的NAA(神经元标志物)和较低水平的Ins和tCho(细胞死亡标志物)，证明miR-ATXN3治疗的功效。b)使用NAA/Ins、NAA/tCho和NAA/(Ins+tCho)比评估这种基于基因的疗法的功效。所有值均以平均值±SEM表示，并使用单因素方差分析进行统计分析。miR-对照(n＝8)、miR-ATXN3(n＝7)和WT(n＝8)。星号表示各组之间的统计学显著性差异，*p<0.05，****p<0.0001。Ins：肌醇，NAA：N-乙酰基天门冬氨酸，tCho：甘油磷酸胆碱+磷酸胆碱。

图16：使用pri-miR-155，在包埋在人工miRNA支架中的rs12895357(胞嘧啶)上的靶向共济失调-3mRNA的本公开的dsRNA的实例。dsRNA的第一RNA序列/链(SEQ ID NO.2)以矩形描绘。

具体实施方式

本公开提供了包含第一RNA序列/链和第二RNA序列/链的靶向SNP的dsRNA，其中第一和第二RNA序列/链基本上彼此互补，优选地第一RNA链和第二RNA链彼此至少90％互补，其中第一个RNA序列/链的序列长度为至少19个核苷酸，优选为19-23个核苷酸，与SEQ IDNO.1、7、13、19为至少86％互补。优选地，第一链RNA不同于SEQ ID NO.26；第一链RNA的第一核苷酸不同于胞嘧啶。

在本公开中，为了增加哺乳动物细胞中基因沉默的效率，所有设计的靶向SNP的dsRNA无一例外地包括：i)在5'端的一个尿嘧啶(U)，ii)在5'末端的前八个核苷酸中至少五个A/U残基；以及iii)在第一链(反义链)中不存在长度大于五个核苷酸的任何GC延伸。

现在公开的等位基因特异性基因沉默通过在第一RNA序列/链的种子区域外部精确地配对(即，反义)，更精确地在接近切割位点的位置12处实现的。反义的5'-末端“种子”序列(位置2-8)与两个等位基因(即，正常和突变体等位基因)互补。因此，所有选择的靶向SNP的dsRNA与含有靶SNP等位基因的mRNA完全互补，但在位置12与非靶mRNA形成错配，允许歧视性沉默。

根据该基本原理，沉默序列(SEQ ID NO.2)首先被设计为靶向位于共济失调-3基因(

遵循相同的基本原理，位于外显子8的外显子SNP rs1048755(

为了评估本公开中用于设计等位基因特异性沉默序列的基本原理，我们首先进行体外研究以评估SEQ ID NO.2。此后，在两种不同的MJD小鼠模型中，即在基于慢病毒的小鼠模型和在MJD的转基因小鼠模型中，测试SEQ ID NO.2的治疗潜力。

在一个实施方式中，如下产生基于miRNA的RNAi质粒。基于SEQ ID NO.2或SEQ IDNo.3，设计了在rs12895357处靶向共济失调-3mRNA的基于miR155的人工miRNA(miR-ATXN3)。还设计了对照miRNA，其序列不会使任何哺乳动物mRNA沉默(miR-对照)。随后将这两种人工miRNA克隆到自身互补的腺相关病毒血清型2骨架(scAAV2-U6-miRempty-CBA-eGFP质粒)中，由Miguel Sena-Esteves(UMass Medical School,Gene Therapy Center,Worcester,MA,USA)友情提供，其包括增强的绿色荧光报告基因(EGFP)且其中人工miRNA由U6启动子驱动(图2A)。

在一个实施方式中，如已经描述的(Alves等，2008a)产生了编码特异地靶向突变体共济失调-3并且是本领域已知(sh-ATXN3)的shRNA的质粒(图2A)。与SEQ ID NO.2类似，ATXN3(SEQ ID NO:26)旨在靶向位于外显子10(rs12895357)的扩增CAG尾巴的3'末端的SNP中的C核苷酸。shRNA表达受H1启动子驱动。

在一个实施方式中，先前已经在具有四质粒系统的HEK293T细胞中产生了编码分别具有27Q和72Q的人野生型(LV-WT-ATXN3)和突变体共济失调-3(LV-Mut-ATXN3)的慢病毒载体，如已经描述的(Alves等，2008b)。将慢病毒颗粒重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中的1％牛血清白蛋白(BSA)中。通过评估HIV-1p24抗原水平(RETROtek,Gentaur,Paris,France)确定批次的病毒颗粒含量。病毒原液保存在-80℃下直至使用。

在一个实施方式中，小鼠神经嵴衍生的细胞系(Neuro2a细胞)培养物如下获得。小鼠神经嵴衍生的细胞系获自美国典型培养物保藏中心细胞生物学库(CCL-131)，并在37℃和5％CO

在一个实施方式中，Neuro2a细胞感染如下进行。为了获得稳定表达突变体或非突变体(即，野生型)共济失调-3的神经元细胞系，在rs12895357(外显子)处，将Neuro2a细胞用编码在rs12895357(外显子10)处具有C的全长人突变体共济失调-3(72Q)或在相同SNP处具有G的野生型(27Q)的慢病毒载体感染，如前所述。简言之，在聚凝胺存在下，将Neuro2a细胞与各自的载体以10ng的p24抗原/10

在一个实施方式中，Neuro2a细胞转染如下进行。在转染前一天，将先前使用慢病毒载体感染突变型或野生型共济失调-3的Neuro2a细胞铺板在十二孔板中(180.000个细胞/孔)。使用聚乙烯亚胺(PEI)线性Mw 40,000(Polysciences,Inc.,Warrington,PA,USA)作为转染试剂，用相应的AAV质粒：miR-对照、miR-ATXN3和sh-ATXN3转染细胞。简言之，通过将10μL的DMEM、4μL的PEI(1mg/ml)和800ng的DNA混合来诱导DNA:PEI复合物形成。在室温下孵育10分钟后，将500μL的DMEM完全培养基添加到混合物中。最后，在除去一半培养基后，将Neuro2a细胞与每孔500μL的转染溶液一起孵育。转染后48小时，Neuro2a细胞用PBS1X洗涤，用胰蛋白酶处理，离心收集并储存在-80℃下。

在一个实施方式中，RNA提取、DNA酶处理和cDNA合成如下进行。根据制造商的说明，使用Nucleospin RNA试剂盒(Macherey Nagel,Düren,Germany)分离总RNA。简言之，细胞裂解后，将总RNA吸附到二氧化硅基质，用推荐的缓冲液洗涤，并通过离心用无RNase的水洗脱。使用Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific,Waltham,USA)通过光密度(OD)定量RNA总量，并通过测量260和280nm下OD比来评估纯度。

在一个实施方式中，为了避免基因组DNA污染和共扩增，根据生产商的说明书，使用Qiagen无RNase的DNase组(Qiagen,Hilden,Germany)进行DNase处理。简言之，反应的最终体积为6μL，其包含0.6μL的DNase缓冲液，0.25μL的DNase和500ng的RNA。在37℃下孵育30分钟后，添加0.5μL的20mM的EDTA pH＝8以终止反应。最后一步是在65℃下孵育10分钟。

在一个实施方式中，然后通过使用iScript Select cDNA合成试剂盒(Bio-Rad,Hercules,USA)根据制造商的说明转化420ng的总RNA而获得cDNA。使用2μL的反应混合物(5倍)，0.5μL的iScript逆转录酶和适当体积的RNA模板和无核酸酶的水制备总体积为10μL的完全混合物。将完全反应混合物在25℃下孵育5分钟，然后在42℃下孵育30分钟，并在85℃下孵育5分钟。逆转录酶反应后，将混合物储存在-20℃下。

在一个实施方式中，定量实时PCR(qPCR)如下进行。根据制造商的说明，所有qPCR均在Applied Biosystems StepOnePlus实时PCR系统(Life technologies,USA)中使用96孔微量滴定板和SsoAdvanced SYBR Green Supermix(Bio-Rad,Hercules,USA)进行。

在一个实施方式中，根据MIQE指南，反应在20μL的最终体积反应混合物中进行，所述反应混合物包含10μL的SsoAdvanced SYBR Green Supermix(Bio-Rad,Hercules,USA)、10ng的DNA模板和500nM的人共济失调-3的先前已验证的特异性引物-3，小鼠共济失调-3、小鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和小鼠次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)。通过变性程序(95℃持续30秒)启动PCR方案，然后进行两个步骤的40个循环：在95℃下变性5秒和在56℃下退火/延伸10秒。熔解曲线方案在扩增循环后开始，通过逐渐的温度升高，从65升高至95℃，加热速率为0.5℃/5s。

在一个实施方式中，通过StepOnePlus软件(Life technologies,USA)自动确定循环阈值(Ct)。对于每个基因，获得标准曲线，并通过软件确定定量PCR效率。通过Pfaff方法确定相对于对照样品的mRNA相对定量。使用GenEx软件确定理想的参考基因。

在一个实施方式中，从neuro2a细胞提取蛋白质，并使用与蛋白酶抑制剂混合物和2mM的二硫苏糖醇混合的RIPA裂解缓冲液匀浆。进一步超声处理裂解物，并通过Bradford方法(Bio-Rad Protein Assay,Bio-Rad)估算蛋白质浓度。然后将60微克的总变性蛋白质上样至4％富集、10％拆分的聚丙烯酰胺凝胶中，以进行电泳分离。然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Merck Millipore)上，并封闭在5％脱脂牛奶中。使用单克隆抗共济失调-3抗体(1H9,1:1000；Chemicon)和β-微管蛋白进行免疫印迹。突变体或非突变体人共济失调-3和内源性小鼠共济失调-3的光密度定量相对于β-微管蛋白。

在一个实施方式中，腺相关病毒血清型9(AAV9)载体的产生如下进行。简言之，通过用AAV构建体(miR-ATXN3和miR-对照)、pFΔ6(腺病毒辅助质粒)和AAV9 rep/cap质粒的磷酸钙沉淀三重转染HEK293T细胞来制备载体原液，如前所述，导致产生rAAV9-miR-ATXN3和rAAV9-miR-对照。然后通过碘克沙醇梯度离心纯化AAV9载体，然后如前所述进行浓缩和透析。通过定量实时PCR(qPCR)，使用特异性引物和牛生长激素聚A元素(pBGH)探针，确定载体滴度。

在一个实施方式中，在颅内施用后，在基于慢病毒(LV)的MJD小鼠模型中评估该基于AAV9的策略的功能和功效(图5A)。这种特殊的小鼠模型可以在短时间内测试治疗方法，并定量分析突变体共济失调-3表达诱导的神经病理缺陷(Alves等，2008b)。

在一个实施方式中，将十三只10周龄小鼠麻醉，并与编码人突变体共济失调-3(72Q)的慢病毒载体(3x10

在一个实施方式中，对来自三只动物的两个半球进行蛋白质印迹。解剖注射的纹状体，并使用与蛋白酶抑制剂混合物和2mM的二硫苏糖醇混合的RIPA裂解缓冲液匀浆。进一步超声处理裂解物，并通过Bradford方法(Bio-Rad Protein Assay,Bio-Rad)估算蛋白质浓度。然后将60微克的总变性蛋白质上样至4％富集、10％拆分的聚丙烯酰胺凝胶中，以进行电泳分离。然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Merck Millipore)上，并封闭在5％脱脂牛奶中。使用单克隆抗共济失调-3抗体(1H9，1:1000；Chemicon)和抗肌动蛋白(克隆AC-74，1:5000；Sigma)进行免疫印迹。突变体聚集型共济失调-3的光密度定量相对于β-肌动蛋白。

在一个实施方式中，使用具有x20物镜的Zeiss Axio Imager Z2显微镜扫描显示纹状体的完整的头尾之间采样的冠状切片(12个切片/动物)。纹状体的分析区域包括整个区域泛素包涵体，如通过抗泛素抗体染色所揭示的。使用自动图像分析软件包(Image Jsoftware,USA)对所有夹杂物及其面积进行计数。

在一个实施方式中，通过数字化每只动物12个染色切片(以200μm间隔的25μm厚的切片)分析纹状体中DARPP-32损失的程度，以获得纹状体的完整的头尾之间采样。为了计算DARPP-32损失，使用Zen软件(Zeiss)的拼贴功能对切片进行成像。使用以下公式估算纹状体的耗竭面积：体积＝d(a1+a2+a3+…)，其中d是连续切片之间的距离(200μm)，且a1、a2、a3是单个连续切片中DARPP-32耗竭面积。

在一个实施方式中，通过以200μm的间隔分析每只动物的3个染色切片(靠近注射斑痕)，进行纹状体中的浓缩的固缩核数目的定量分析。使用Adobe Photoshop软件手动进行定量。

在一个实施方式中，还使用了聚Q69-转基因MJD小鼠。该模型在L7启动子的控制下，在小脑浦肯野细胞中特异性表达带有69个聚谷氨酰胺尾巴的N末端截短的人共济失调-3。而且，突变蛋白在氨基末端展示血凝素(HA)表位。重要的是，转基因在CAG扩增下游(rs12895357)包含先前鉴定的SNP，因此显示与miR-ATXN3互补。转基因小鼠的特征在于突变体脊髓小脑性共济失调3在浦肯野细胞层和小脑深核中积累，并伴有明显的小脑萎缩。他们从出生后的第21天开始表现出重度脊髓小脑性共济失调表型(P21)。

在一个实施方式中，通过使杂合雄性与C57BL/6雌性回交，将转基因小鼠种群(C57BL/6背景)维持在科英布拉大学神经科学与细胞生物学中心(CNC)的动物房设施将动物饲养在温度控制的房间中，该房间保持12小时光照/12小时黑暗循环。随意提供食物和水。在4周龄时通过PCR进行基因分型。

在一个实施方式中，根据欧洲共同体理事会指令(86/609/EEC)进行实验动物的护理和使用的实验。研究人员接受充实的培训(FELASA认证的课程)和由葡萄牙当局(

在一个实施方式中，实验设计如下进行。本公开使用了19只雌性杂合MJD小鼠，其在出生后第1天(P1)注射编码AAV9的miR-ATXN3(n＝8)和编码AAV9的miR-对照(n＝11)(图9A)。

在一个实施方式中，然后基于其行为表现和神经病理学改变评估对照和治疗的MJD小鼠。在35、55和85天进行一系列行为测试。在出生后第95天(P95)处死小鼠，然后进行脑病理分析。

在一个实施方式中，AAV9新生儿注射如下进行。在新生MJD小鼠和野生型同窝仔(P1)的面静脉中进行静脉注射。在优化方案中，首先在大约1分钟的时间内用冰床麻醉新生儿。之后，使用30规格注射器(Hamilton,Reno,NV,USA)将总共3.5x10

在一个实施方式中，行为测试如下进行。在适应环境一小时后，MJD转基因小鼠在35、55和85天的年龄下，在同一黑暗而安静的房间中，在受控温度下进行一系列行为测试。

在一个实施方式中，使用转棒仪(Letica Scientific Instruments,Panlab)以通过测量MJD小鼠跌倒的潜伏时间(以秒为单位)来评估MJD小鼠的运动协调和平衡。在固定的转棒上，使用5rpm的恒定速度分析性能，在加速的转棒上，其中将速度从4rpm逐渐增加到40rpm，两者最长5分钟。对于每个时间点(35、55和85天)，测试进行连续三天，每天总共进行四次试验。在随后的试验之间，小鼠的休息时间为至少20分钟。为了统计分析，考虑所有连续天数和试验，计算每个时间点的平均跌倒潜伏时间。

在一个实施方式中，为了评估由于治疗产生的可能毒性，接受rAAV9-miR-ATXN3(n＝5)和rAAV9-miR-对照(n＝5)Iv注射的一组野生型小鼠也进行转棒测试。在这种情况下，仅在连续两天的最后一个时间点(85天)进行测试，每天总共进行四次试验。为了统计分析，考虑第二天计算平均跌倒潜伏时间。

在一个实施方式中，还通过在玻璃水箱(70cm长，12.5cm宽和19.5cm高的壁)中的游泳表现来评估MJD小鼠的肢体协调。泳池末端有一个可见的平台，并注满水直至其高度(8.5cm)。然后将小鼠放在水箱的一端，并鼓励它们游向对端的逃生平台。对于每个时间点，动物进行了四次试验，每次试验在水箱中游泳两次，试验之间休息至少20分钟。他们的表现被录制视频，以测量全程游泳并用四个爪子爬上平台所需的时间。统计分析基于试验2、3和4的平均得分。

在一个实施方式中，通过评估MJD小鼠穿越一系列升高的横木的能力来评估其运动协调和平衡。将长木横木水平放置在衬垫表面上方20cm处，并将两端安装在支架上。对于每个时间点，小鼠都对每个横木进行了两次连续的试验，从最简单到最困难的试验逐渐发展：i)118-mm正方形宽度，ii)9-mm正方形宽度和iii)9-mm圆直径横木。对于所有动物来说，小鼠都必须横穿40cm才能到达封闭的安全平台。记录穿越横木的潜伏时间和运动表现，并根据预定义的评定量表进行评分。

在一个实施方式中，分析了MJD小鼠的足迹模式，以便比较不同的步态参数。在分别用无毒红色和蓝色涂料涂覆前爪和后爪后，鼓励动物在50cm长，10cm宽，纸覆盖的走廊上直线走入一个密闭的盒子中。对于每个时间点，选择每侧五个连续步骤，优选是在运行中间以进行分析。测量步幅长度值，对应于随后的左右前肢和后肢之间的距离。后座和前座宽度通过分别测量左右后爪和前爪之间的距离来确定。为了评估台阶交替均匀性，将重叠部分测量为同一侧前爪和后爪之间的距离。对于每个时间点，将从所选的五个连续步骤中获得的平均值用于统计分析。

在一个实施方式中，在科英布拉大学的核科学应用卫生研究所(ICNAS)，使用9.4T磁共振小型动物扫描仪(BioSpec 94/20)进行体内图像采集，该扫描仪具有标准的布鲁克交叉线圈设置，使用励磁体积线圈(内/外径分别为86/112mm)和用于信号检测的正交鼠标表面线圈(Bruker Biospin,Ettlingen,Germany)。进行体积分析和1H-MRS。

在一个实施方式中，在过量的戊巴比妥后进行组织制备，将小鼠心内灌注冷PBS1X，然后用4％冷多聚甲醛(PFA 4％)固定。然后取出大脑，并在4℃下在4％多聚甲醛中后固定24小时，通过在4℃下在25％蔗糖/PBS中孵育48小时进行冷冻保护。

在一个实施方式中，对于每只动物，使用低温恒温器(LEICA CM3050S,Germany)在-20℃下在一个脑半球上切成96个30μm的矢状切片。然后将它们收集并存储在两个48孔板中，在4℃下作为补充有0.05％叠氮化钠的PBS 1X中的自由浮动切片。

在一个实施方式中，如先前报道的进行免疫组织化学方案(

在一个实施方式中，该程序通过将切片在含有0.1％苯肼的PBS1X中(Merck,USA)中在37℃下孵育30分钟开始于内源性过氧化物酶抑制。随后，在室温下在PBS1X中制备的0.1％Triton X-100 10％NGS(正常山羊血清，Gibco)中进行组织封闭和通透化1小时。然后将切片与预先在封闭液中以适当稀释度(1:1000)制备的一抗兔抗GFP(Invitrogen)在4℃下孵育过夜。在洗涤三遍后，将脑切片在室温下在封闭溶液(1:250)中稀释的抗兔生物素化二抗(Vector Laboratories)中孵育2小时。随后，漂洗自由漂浮的切片并在室温下在30分钟内用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories)处理，诱导形成抗生物素蛋白/生物素化的过氧化物酶复合物。然后通过将切片与过氧化物酶底物一起孵育来产生信号：3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB底物试剂盒，Vector实验室)。在达到最佳染色效果后，通过在PBS1X中洗涤切片来终止反应。随后将脑切片固定在凝胶涂覆的载玻片上，以升序的乙醇系列(75％、95％和100％)脱水，用二甲苯清洗，最后用Eukitt封固剂(Sigma-Aldrich)盖片。

在一个实施方式中，在Zeiss Axio Imager Z2显微镜中获得经受GFP免疫组织化学的矢状脑切片的图像。使用EC Plan-Neofluar 5×/0.16物镜获取全脑图像，而使用Plan-Apochromat 20×/0.8物镜获取特定区域的图像。

在一个实施方式中，还进行了免疫荧光。对于每只动物，选择八个相交距离为240μm的矢状切片。简言之，该方案从封闭和透化步骤开始，其中将自由漂浮切片保存在补充10％NGS(正常山羊血清，Gibco)的PBS1X中的0.1％Triton X-100，并在室温下放置1小时。然后将脑切片与以下在封闭溶液中稀释的一抗(在PBS中的10％NGS，0.1％Triton X-100)一起在4℃下孵育过夜：小鼠抗HA(1:1000，Invivo Gen)和兔抗GFP(1:1000，Invitrogen)。在PBS1X中进行三个洗涤步骤后，将自由漂浮的切片在室温下与在封闭液中以适当的稀释度制备的荧光团偶联的二抗孵育2小时：分别为与Alexa Fluor 594和488缀合的抗小鼠和抗兔(1:200,Life technologies)。在PBS1X中经过三个上升步骤后，使用DAPI(4'，6-联脒-2-苯基吲哚)进行核染色。随后，清洗脑切片，将其固定在明胶涂覆的显微镜载玻片上，最后盖片在Dako荧光封固剂上(S3023)。

在一个实施方式中，使用八矢状切片进行甲酚紫染色，每只动物的相交距离为240μm。将选定的脑切片预先安装在明胶涂覆的载玻片上，并在室温下干燥。在水中洗涤后，将切片进行脱水(使用96％和100％的乙醇)、脱脂(使用二甲苯替代物)和再水化(使用75％的乙醇和水)。然后，将载玻片浸入甲酚紫中5分钟，以染色神经元体内存在的尼斯尔物质。最后，将切片在水中洗涤，在70％的乙醇中分化，并通过96％和100％的乙醇溶液进行脱水。在二甲苯中进行清洁步骤后，将切片用Eukitt(Sigma-Aldrich)固定。

进行GFP和HA免疫荧光后，选择特定的矢状切片以获取整个小脑的图像。通过共聚焦显微镜(蔡司细胞观察旋转圆盘显微镜)捕获连续的z-stack图像(间隔＝0.9μm)。使用复消色差透镜20×/0.8物镜采集图像，并使用固态激光线(561nm或488)进行激发。

在一个实施方式中，在来自治疗动物的3个特定的矢状切片中进行平均和整合的GFP荧光强度的定量(在中线外侧的矢状平面0.48、0.72和0.96mm中切割：在(

在一个实施方式中，确定平均GFP荧光强度以定量特定小脑小叶中的病毒转导水平。对于每个切片，通过Zen软件确定平均GFP荧光强度，并在背景减除后进行计算。考虑到每只动物的三个分析切片，最终值对应于平均强度。

在一个实施方式中，总共确定小脑小叶的积分GFP荧光强度，以便比较不同动物中的总病毒转导水平。在这种情况下，确定包括所有小脑小叶的平均GFP荧光强度，并将该值乘以相应面积，以计算积分荧光强度。考虑到每只动物的三个分析切片，最终值对应于平均积分强度。

在一个实施方式中，血凝素标记的(HA)聚集体的定量分析如下进行。选择每只动物三个特定的切片以量化小叶10、9和6中的聚集体数量(根据(Franklin and Paxinos)，小叶9和10中线外侧的矢状面为0.48、0.72和0.96mm；小叶6中线外侧的矢状面为0.72、0.96和1.68mm)。

如前所述，使用共聚焦显微镜获取图像。使用Zen Black 2012软件获得每个部分的平均强度投影。在手动量化每个小叶中聚集体的数量后，将值用在Zen软件中确定的相应小叶面积进行归一化。最终值对应于每只动物三个选定部分的聚集体平均数/mm

在一个实施方式中，分子层厚度的定量如下进行。选择每只动物三个特定的切片以量化小叶10、9和6中的分子层厚度，然后甲酚紫染色(根据(Franklin and Paxinos)，小叶9和10中线外侧的矢状面为0.48、0.72和0.96mm；小叶6中线外侧的矢状面为0.72、0.96和1.68mm)。

在一个实施方式中，在具有复消色差20×/0.8物镜的Zeiss Axio Imager Z2显微镜中获得整个小脑的图像，并用Zen Blue软件进行分析。

在一个实施方式中，对于每个部分，使用在预定的特定区域中的三个测量值，分别在小叶10、9和6中计算分子层厚度。考虑到每只动物的三个选定部分，最终值对应于相应小叶中的平均分子层厚度。治疗组和对照组均包括在该分析中。

在一个实施方式中，使用Prism GraphPad软件进行统计分析。数据表示为平均值±平均值标准误差(SEM)，并且根据Grubb检验(α＝0.05)去除离群值。进行未配对学生t检验来比较对照组和治疗组，而单因素方差检验用于多次比较。参数之间的相关性根据皮尔逊相关系数确定。根据以下标准确定显著性：p>0.05＝不显著(ns)；*p<0.05，**p<0.01***p<0.001和****p<0.0001。

本公开涉及靶向SNP的dsRNA，其可以特异性地靶向并降低人突变体共济失调-3蛋白的水平，同时维持非突变形式的水平。

本公开特别地涉及dsRNA序列(SEQ ID NO.2)，其旨在将C核苷酸精确地靶向位于共济失调-3基因外显子10(rs12895357)的扩增CAG尾巴的3'端的SNP，据报道其与全世界70％的MJD患者的异常CAG扩增有关(图1)。

在一个实施方式中，SEQ ID NO.2整合入miR-155支架中，产生人工微小RNA(图16)。平行地，还使用控制序列(SEQ.ID NO.25)，其不沉默任何哺乳动物mRNA，并整合到miR-155支架中。两种人工miRNA均在U6启动子的控制下并以EGFP作为报告基因(miR-对照和miR-ATXN3)克隆到自身互补的AAV2骨架中(图2A)。

为了确认这种新型沉默序列的沉默能力和特异性，将miR-ATXN3质粒转染到小鼠神经嵴衍生的细胞系(Neuro2a)中，其先前感染了稳定表达以下的慢病毒载体：在rs12895357处具有C核苷酸的人突变体共济失调-3(72Q)，或ii)在rs12895357处具有G核苷酸的人野生型共济失调-3(27Q)。将miR-对照质粒用作阴性对照，且本领域已知的编码sh-ATXN3的慢病毒质粒以沉默人突变体共济失调-3(SEQ ID NO.26)，用作阳性对照(图2A)。

根据定量逆转录酶PCR(qPCR)结果，用miR-ATXN3质粒转染导致突变体共济失调-3mRNA水平降低42.03％±6.26％，接近于在sh-ATXN3存在下发生的情况(图2B)。然而，与sh-ATXN3相比，在用mut-ATXN3质粒转染后，未检测到野生型共济失调-3mRNA水平的变化(图2C)，证明SEQ ID NO.2精确地靶向SNP rs12895357处的C核苷酸，使人共济失调-3的等位基因特异性沉默。使用编码SEQ ID NO.3的人工miRNA-155构建体获得类似的结果，如图3所示。

就蛋白质水平而言，miR-ATXN3与sh-ATXN3一样有效地降低了突变体共济失调-3蛋白水平(图2D)(miR-ATXN：50.66±8.34％对比sh-ATXN3：55.65±6.04％)；然而，它更具选择性。事实上，在用miR-ATXN3质粒转染后，未检测到野生型蛋白水平的变化，而sh-ATXN3诱导了表达野生型形式的Neuro2a细胞中人野生型共济失调-3mRNA的显著降低(图2E)。

总体地，这表明现在公开的基于miR的策略保留了本领域先前报道的序列的突变型共济失调-3沉默能力，但选择性更高。这意味着miR-ATXN3允许区分突变体和野生型转录本，从而保持共济失调-3正常功能，这是将这种治疗方法翻译到人患者时的显著优势。

此外，未检测到内源性小鼠共济失调-3mRNA水平的变化(图4)，证明沉默作用对人共济失调-3mRNA具有特异性。

为了探索SEQ ID NO.2在体内的治疗潜力，将miR-ATXN3和miR-对照AAV质粒包装到rAAV9衣壳中。鉴于其有效的神经元转导、长期转基因表达和安全性，AAV载体被认为是CNS基因传递的首选平台。特别地，AAV血清型9(AAV9)还具有在野生型啮齿动物、猫、非人类灵长类动物和人类中绕过BBB的能力，从而可以进行静脉注射(IV)。

miR-ATXN3在MJD的两种不同小鼠模型中进行了测试，即在基于慢病毒和MJD的转基因小鼠模型中，分别通过脑实质内和静脉内施用。

首先，我们在颅内(IC)给药后，在基于慢病毒(LV)的MJD小鼠模型中评估了miR-ATXN3的功能和功效。这种小鼠模型可以在短时间内测试治疗方法，并精确定量分析突变体共济失调-3表达诱导的神经病理缺陷(Alves等，2008b)。因此，将十三只10周龄小鼠在纹状体中双边共注射在右半球具有编码具有72个CAG重复序列的人突变型共济失调-3的慢病毒载体(LV)和编码miR-ATXN3的rAAV9载体和在左半球编码miR-对照的rAAV9载体(图5A)。

注射后五周，处死五只小鼠以评估突变体共济失调-3mRNA的表达水平(通过qPCR)和突变体聚集型共济失调-3蛋白水平(通过蛋白质印迹)，并灌注八只小鼠并处死以进行免疫组织化学分析(EGFP、抗泛素、DARPP-32、甲酚紫)。

如图5B所示，荧光显微镜显示，通过报告基因EGFP的强烈表达可以看出，AAV9载体的颅内施用在两个半球都是有效的。

通过qPCR(图5C)和通过蛋白质印迹(图5D)，观察到当与左对照半球相比时，mir-ATXN3的表达分别诱导突变体共济失调-3的纹状体mRNA水平63.75±2.25％降低和突变体共济失调-3的聚集体形式的37.64±4.52％降低。

由于含有聚集型共济失调-3的神经元核内包涵体的存在是MJD的一个重要标志之一，因此接下来评估了miR-ATXN3治疗在IC施用后减少泛素阳性包涵体的总数和大小的潜力。当与左对照半球相比时，观察到注射编码miR-ATXN3的rAAV9的半球中聚集体数量的清除，证明该治疗的有效性(图5E和图5F)。

然后，为了评估该策略是否可以介导纹状体神经保护作用，针对DARPP-32(一种多巴胺受体信号传导调节剂和神经元功能障碍的敏感标志物)进行免疫组织化学，我们先前已证明它是检测基于LV的MJD模型中的早期神经元功能障碍的敏感标志物(Alves等，2008b)。与miR-对照相比，miR-ATXN3的颅内施用减少了DARP-32耗竭病变(占80.87％)(图5G和图5H)。

最后，进行甲酚紫染色以评估由于突变体共济失调-3表达引起的细胞损伤，并且在右处理的半球中观察到明显的细胞核深染减少(约30％)(图5I和图5J)。

总体而言，这些结果表明，基于AAV9的策略，突变型共济失调-3的等位基因特异性沉默可有效降低IC注射后突变型共济失调-3mRNA和突变体聚集型蛋白的水平。这促进了泛素阳性包涵体的清除，防止细胞损伤和纹状体变性。

接下来，我们探索严重受损的MJD转基因小鼠模型(PolyQ69转基因小鼠)及其在P1的野生型同窝仔中，静脉注射后开发的rAAV9载体转置BBB和转导神经元的能力。这种转基因小鼠模型在小脑浦肯野细胞(PC)中表达包含69个谷氨酰胺重复序列的截短形式的人共济失调-3(共济失调-3)并形成重度早发性(P21)病理表型。此外，这种MJD转基因小鼠模型允许评估等位基因特异性策略，因为截短型人共济失调-3在rs12895357SNP处携带C变体，并存在于70％的MJD患者中。

实际上，为了在PolyQ69转基因小鼠中获得治疗效果，注射IV的rAAV9载体必须规避BBB并有效地转导大脑。结果，进行了在95天大的处死后rAAV9在MJD转基因小鼠脑中的分布的研究。为此，使用抗绿色荧光蛋白(GFP)的抗体、存在于AAV质粒中的报告基因进行矢状脑切片的免疫组织化学。除了分析注射rAAV9的转基因小鼠的切片外，我们还使用未注射的MJD小鼠作为阴性对照和注射rAAV9的野生型(WT)小鼠来比较rAAV9分布(图6)。

在接受rAAV9 IV注射的对照组和治疗组的转基因小鼠中，GFP表达的模式都非常相似。载体被证明有效扩散到整个大脑，包括通常在MJD中受影响的区域，例如小脑、脑干、脊髓和纹状体。特别地，桥脑核是MJD变性的主要部位，显示出很高的转基因表达。其他有效转导的区域包括大脑皮层、嗅球和海马体。rAAV9 Iv注射到转基因成年动物的尾静脉中，也介导了小鼠脑的有效转导。在转基因动物和野生型动物之间观察到的主要差异与小脑GFP表达相对应。实际上，与WT小鼠整个小脑中的稳健转基因表达相比，MJD动物显示出较弱和空间限制的GFP信号(图6B和图6C)。这些观察结果可以用这种特殊转基因动物模型中的小脑血管形成缺陷来解释，这些缺陷已经被报道。

鉴于人突变体共济失调-3表达仅限于polyQ69 MJD转基因小鼠的小脑PC，rAAV9-miR-ATXN3的治疗作用在很大程度上取决于载体转导小脑的能力，尤其是这种细胞亚型。因此，在免疫组织化学处理之后，进一步详细分析该区域中GFP信号的分布。

如图7所示，GFP表达在整个小脑中分布不均，在小脑小叶10中尤其明显，其次是小脑深核(DCN，可能是MJD中最早熟的区域)和小叶9。在小叶6和7以及其余小叶中也检测到转导的分离的神经元，尽管程度较轻。重要的是，第四脑室的脉络丛神经细胞也表现出明显的GFP表达。对于所有接受rAAV9 IV注射的转基因动物，包括对照组和治疗组，均观察到这种GFP分布模式。

小叶9和10上的这种优先的小脑转导可能是由于该区域的血管形成更好，或者可能是由于其与第四脑室的脉络丛接近而发生。脉络丛(CP)由单层的上皮细胞组成，它们负责脑脊液(CSF)的产生，并构成血液和CSF之间的屏障-血液CSF屏障(BCSFB)。因此，到达CP的血液循环rAAV9载体最终可能绕过BCSFB并传递到CSF。由于小叶10中靠近CP并且在CSF流动路径中，因此rAAV9进入PC优先出现在该小脑区域中。

最后，评估了rAAV9是否靶向该小鼠模型中主要受影响的细胞群体，即表达突变体共济失调-3的PC。为此，进行了同时标记GFP和血凝素(HA)的共免疫荧光。如预期的那样，在PC细胞层中检测到HA信号，其中突变体共济失调-3以弥散染色的形式和聚集体形式分布在整个体细胞中(图8)。此外，突变体共济失调-3聚集体也在小脑深核(DCN)的PC轴突终末中被检测到。当比较GFP和HA信号的分布时，在PC层和DCN中发现了共定位，这是突变体共济失调-3积累的两个主要区域(图8)。后一个发现表明，AAV载体可能从DCN逆行转运至PC，从而产生治疗效果。此外，DCN rAAV9转导也可能对MJD患者有益，因为该区域在疾病背景下受到严重影响。对于所有rAAV9-IV注射的小鼠，包括对照组和治疗组，这种模式都是相似的。

在本公开中，还研究了rAAV9-miR ATXN3注射是否会减轻与MJD相关的行为缺陷。最常见的MJD症状包括运动协调和平衡受损，以及共济失调步态。PolyQ69转基因小鼠成功地模仿了这些特征，表现出了极为严重的脊髓小脑性共济失调表型，且发病较早(P21)。这些行为障碍是由于PC功能障碍而引起的，一种神经元亚群，在运动协调和学习中起着重要作用。实际上，PC易受攻击，容易损坏，从而导致运动控制能力受损。

为了探索miR-ATXN3治疗对转基因小鼠行为的影响，在三个不同的年龄：35、55和85天，对经治疗和对照动物(即，分别接受P1静脉注射编码miR-ATXN3或miR-对照的rAAV9载体)进行一系列测试：(图9A)。这些测试包括固定式和加速式转棒，以及横木行走测试，因为它们适合评估平衡和运动协调。此外，游泳测试允许进一步评估运动表现和强度。另一方面，足迹分析使我们能够评估与MJD相关的步态缺陷。

转棒表现被确定为当小鼠以恒定和加速的速度在转棒设备中行走时平均跌落的潜伏时间。该治疗方法被证明在所有时间点和两个范例中均具有有益的作用(图9B和图9C)。在85天时获得了最一致的结果，因为这种改进在固定和加速转棒上均具有统计学意义(跌落的潜伏时间分别增加了1.7和1.5倍)。

在游泳测试中，将小鼠放在一个装满水的玻璃水箱的一个末端，并鼓励它们在游泳池中游泳并爬上平台。记录每只动物游动整个距离并爬上平台所需的时间。根据结果，经治疗的动物在55天时表现出更好的表现(图10A)。

在横木行走测试中，小鼠越过了i)18-mm正方形的宽度，ii)9-mm正方形的宽度和iii)9-mm直径的圆形升高横木。根据动物完成行走所需的时间及其运动协调对动物进行评估。根据预定义的评定量表对表现进行评分，其中较高的分数表示更好的平衡和协调。根据该分析，对于18-mm和9-mm正方形宽度的横木，对照组和治疗组之间没有差异。然而，动物在9-mm直径9的圆形横木上表现出独特的表现，这被认为是最难穿越的(图10B)。在对照组中，观察到了表现分数随时间的逐渐降低，而接受治疗的小鼠保留了其穿越横木的能力。结果，注射rAAV9-miR-ATXN3的动物在最后时间点的横木行走测试中表现出明显更好的性能(平均得分增加2.2倍)(图10B)。

为了评估治疗是否能够减轻MJD特征性肢体和步态共济失调，分析了两个实验组的足迹模式。共济失调步态通常特征在于：i)步幅宽度增加；ii)步幅宽度较短，和iii)重叠距离增加，这反映了步距交替的均匀性降低。与对照组相比，治疗动物的步态模式分析显示，在不同时间点有几处改善，主要是：后和前底宽分别显着减少，分别为55天和35天。另外，在最后时间点(85天)，检测到足迹重叠距离的显著减少(图10C、图10D和图10E)。

总体而言，经治疗的动物在所有行为测试中均表现出更好的表现，其中在转棒、游泳、横木行走和足迹分析方面取得了显著结果，表明运动技能得到了总体改善(图9和图10)。这是AAV介导的共济失调-3沉默后显著行为改善的首次报道，也是rAAV9-IV注射首次在PolyQ疾病中表现出积极的行为影响。

总体而言，这表明对我们的策略的优越的治疗效果，可能是由于本公开的靶向SNP的dsRNA、选择的血清型和递送途径的选择性。

随后，还评估了rAAV9-miR-ATXN3注射对MJD相关神经病理学变化的影响。MJD的主要标志之一由突变体共济失调3聚集体的积累组成，这反映了疾病的进展。在选定的小鼠模型中，这些聚集体从P40开始在PC中形成，并且数量和大小随时间显著增加。

因此，进行来自治疗和对照MJD小鼠的矢状切片中的血凝素(HA)的免疫荧光，因为该标签存在于突变体共济失调3的N端(图11A)。然后，定量小脑小叶10和9中每单位面积的突变体共济失调-3聚集体的数量，因为它们对应于具有更高转导水平的区域。为了评估rAAV9处理在低转导效率区域的影响，还分析小叶6。根据现在公开的结果，miR-ATXN3治疗降低了所有三个被分析的小叶的聚集(小叶10、9和6分别降低了35％、18％和20％)，从而导致神经病理学衰减(图11B)。

MJD患者的另一个重要特征包括小脑萎缩，这是该区域神经退行性疾病的结果，通常与临床症状相关。在这种特定的小鼠模型中，早在3周龄时就检测到明显的小脑萎缩。因此，由于不同细胞类型之间的强相互联系，PC中的变性或功能/形态改变可能会影响其他小脑区域。特别地，Q69转基因小鼠特征在于PC中的较差树突分枝，因此减小了分子层厚度。因此，为了区分小脑层，在两个实验组的矢状切片中均进行了甲酚紫染色(图11C)。通过分析分子层，在经miR-ATXN3处理的小鼠小叶10和9中发现显著更大的厚度(分别为21％和15％)，以及小叶6中的强烈趋势(13％，p＝0,0587)(图11D)。

总体而言，现在公开的结果表明，通过rAAV9 IV注射使突变体共济失调-3沉默是转基因MJD小鼠的一种有效的治疗方法，可减轻行为和神经病理学损伤。重要的是，这些积极作用是在早发型的非常严重的模型中获得的，其在出生当天就已经表现出神经系统和血管化缺陷。因此，如果在其他MJD模型中测试该策略，则可以预测到甚至更大的影响，这些模型表现出晚期和轻度表型。

尽管有关rAAV9在MJD转基因小鼠中分布的最初观察结果表明仅在小叶10中存在局部治疗反应，但在整个小脑和小鼠行为中检测到非常普遍的作用。可以推测，小叶10的高效转导足以诱导横木行走测试或转棒的改进，因为该小叶是前庭系统的一部分，对于保持平衡很重要。然而，只有整体有益的作用才能解释治疗小鼠的总体更好表现，尤其是在探索运动协调性、力量和步态的测试中。一种可能的解释是，其他小叶中被转导的PC虽然稀少，但可能足以在各自区域诱发阳性效应。这可以通过在整个小脑中由rAAV9阳性PC诱导的神经保护作用来发生，例如，通过释放神经营养因子或抑制神经炎症。另外，转导的PC可能将miR-ATXN3分子转移到邻近的细胞中。因此，转导的PC可能通过可能的单独miR转移和/或使用含有miR-ATXN3的细胞外囊泡与rAAV9阴性神经元通信。使用类似的机制，DCN中的转导细胞也可以释放miR-ATXN3构建体，然后将其传递到PC投影中。最后，CP上皮细胞本身被rAAV9转导的事实可能有助于我们的发现。因此，已经在溶酶体贮积症的背景下研究了CP指导的基因疗法，其中其允许治疗性蛋白质连续分泌到CSF中，从而产生有益的作用。同样，CP上皮细胞可以分泌整合到细胞外囊泡中的miRNA。基于此，第四脑室中的rAAV9阳性CP细胞可能会将含miR-ATXN3的细胞外囊泡转移至CSF，然后其在小脑中发挥其沉默作用。图12总结了本公开中rAAV9-miR-ATXN3治疗影响的潜在可能机制。

还评估了在治疗的小鼠中的治疗效果是否取决于rAAV9小脑转导的水平。特定动物表现出更明显的行为改善或神经病理学减弱的事实可以由转导PC的更高的载体剂量来解释。

为此，在小叶10和9上分析了GFP平均荧光，并分析了相应区域中每个区域的聚集体数量。发现这两个参数之间存在反相关关系，从而得出结论，小叶10和9上的更高转导水平伴随着聚集体清除率的提高(图13A)。然而，无法为小叶6建立相同的关系，表明对该特定区域的有益影响可能取决于其他参数。

此外，评估了具有优异小脑转导的小鼠是否与具有更好运动表现的小鼠相对应。在这种情况下，发现所有小脑小叶中的GFP积分强度与加速型转棒中的平均表现之间呈正相关(图13B)。

考虑到所有这些因素，得出的结论是，在治疗动物中观察到的行为测试和神经病理病征的变异性可能是由不同的转导效率引起的。这可能是由于对新生小鼠进行面内施用的技术要求，结合大量的注射量，或者某些动物可能接受了不同的载体剂量这一事实。此外，可能由于血管化或AAV受体水平的差异，在不同动物之间到达小脑的病毒颗粒的数量也可能不同。

总之，rAAV9-miR-ATXN3注射诱导剂量依赖性应答，因为小脑中较高的载体浓度对应于更强大的治疗效果。因此，基于这些结果，可以得出结论，通过增加注射的载体剂量，即每只动物的病毒颗粒数，可以潜在地最大化治疗效果。

除了已证明的功效外，还需要评估治疗策略的安全特性，以实现可能的临床翻译。最近的研究报道了rAAV9递送后大脑中触发的免疫应答以及由于miR诱导的脱靶沉默而引起的毒性。尽管我们尚未详细探讨所有这些参数，但根据它们在85天时的静止和加速转棒表现在野生动物中评估现在公开的治疗策略，以评估这种治疗是否耐受良好。静脉内注射rAAV9-miR-对照或rAAV9-miR-ATXN3的野生型小鼠的转棒表现没有检测到差异(图14A和图14B)。这些发现表明该治疗序列不引起主要的毒性作用。

最后，在PN75处，动物也接受了磁共振成像(MRI)和光谱学(MRS)以评估使用9.4Tesla(特斯拉)扫描仪对经治疗和对照的MJD转基因小鼠以及野生型同窝仔的小脑的形态和代谢变化。

当与小脑中的野生型小鼠相比时，转基因MJD中的三种神经化学物质高度失调：即，N-乙酰天冬氨酸(NAA)、肌醇(Ins)和甘油磷酸胆碱+磷酸胆碱(tCho)(图15A)。有趣的是，在注射miR-ATAX3的MJD小鼠中，这三种神经代谢物的水平得到改善，这意味着与对照MJD小鼠相比时，更高水平的NAA(神经元标志物)和更低水平的Ins和tCho(细胞死亡标志物)(图15B)。

神经化学比NAA/Ins和NAA/总胆碱，以及NAA/(Ins+tCho)比也用于评估该疗法的疗效。当与对照MJD小鼠相比时，在治疗的MJD小鼠中所有三个比值均显著更高，证明了miR-ATAX3治疗的功效(图15B)。

总而言之，这表明神经化学生物标志物，特别是NAA、Ins和tCho，可以在临床前试验期间用于监测这种基于基因的疗法的功效，随后可作为重要的非侵入性治疗生物标志物翻译为人临床试验。

总之，本公开提供了令人信服的证据，即在P1处静脉内注射编码包含SEQ ID NO.2的基于miR155的人工miRNA的rAAV9能够：i)转置血脑屏障，ii)精确沉默突变体共济失调3mRNA和iii)减轻MJD神经病理学改变和运动障碍。

此外，本公开报道了在rAAV9静脉内施用后的聚谷氨酰胺病症中的显著行为改善，并且构成了能够通过非侵入性系统诱导广泛和长期的共济失调-3沉默的第一MJD治疗方法。

每当在本文献中使用时，术语“包括”旨在表示存在所述特征、整数、步骤、组件，但不排除存在或增加一个或多个其他特征、整数、步骤、组件或其组。

本领域普通技术人员将理解，除非本文另外指出，否则所描述的步骤的特定顺序仅是说明性的，并且在不脱离本公开的情况下可以改变。因此，除非另有说明，否则所描述的步骤因此是无序的，意味着在可能的情况下，可以任何方便或可取的顺序执行这些步骤

不应以任何方式将本公开局限于所描述的实施方式，并且本领域普通技术人员将预见到对其修改的许多可能性。上述实施方式是可组合的。

以下权利要求进一步阐述了本公开的特定实施方式。

序列表：

1.1外显子10(rs12895357)上的靶序列和相应的靶向SNP的双链RNA

1.1.1在rs12895357(胞嘧啶)上靶向共济失调-3mRNA的双链RNA的靶序列和反义序列

SEQ ID NO.1:外显子10(rs12895357)(C)处的靶序列：agcagcagcag

SEQ ID NO.2：(miR357C.22)：5’-ugauagguccc

SEQ ID NO.3:(miR357C.21):5’-ugauaggucccgcugcugcug-3’(21nt)

SEQ ID NO.4:(miR357C.19):5’-ugauaggucccgcugcugc-3’(19nt)

SEQ ID NO.5：(miR357C.20):5’-ugauaggucccgcugcugcu-3’(20nt)

SEQ ID NO.6:(miR357C.23):5’-ugauagguccc

1.1.2.在rs12895357(鸟嘌呤)上靶向共济失调-3mRNA的双链RNA的靶序列和反义序列

SEQ ID NO.7：外显子10(rs12895357)(G)的靶序列：agcagcagcag

SEQ ID NO.8(miR357G.22):5’-ugauagguccc

SEQ ID NO.9(miR357G.19):5’-ugauaggucccccugcugc-3’(19nt)

SEQ ID NO.10(miR357G.20):5’-ugauaggucccccugcugcu-3’(20nt)

SEQ ID NO.11(miR357G.21):5’-ugauaggucccccugcugcug-3’(21nt)

SEQ ID NO.12(miR357G.23):5’-ugauagguccc

1.2外显子8(rs1048755)上的靶序列和相应的靶向SNP的双链RNA

1.2.1rs1048755(腺嘌呤)处靶向共济失调-3等位基因的双链RNA的靶序列和反义序列

SEQ ID NO.13：

SEQ ID NO.14(miR755A.22):5’-ugcuucuaaca

SEQ ID NO.15(miR755A.19):5’-ugcuucuaaca

SEQ ID NO.16(miR755A.20):5’-ugcuucuaaca

SEQ ID NO.17(miR755A.21):5’-ugcuucuaaca

SEQ ID NO.18(miR755A.23):5’-ugcuucuaaca

1.2.2rs1048755(鸟嘌呤)处靶向共济失调-3等位基因的双链RNA的靶序列和反义序列

SEQ ID NO.19：外显子8(rs1048755)(G)的靶序列：accuggaacga

SEQ ID NO.20(miR755G.22):5’-ugcuucuaaca

SEQ ID NO.21(miR755G.19):5’-ugcuucuaaca

SEQ ID NO.22(miR755G.20):5’-ugcuucuaaca

SEQ ID NO.23(miR755G.21):5’-ugcuucuaaca

SEQ ID NO.24(miR755G.23):5’-ugcuucuaaca

其他序列

SEQ ID NO.25(miR-对照):5’-caacaagaugaagagcaccaa-3’(21nt)

SEQ ID NO.26(sh-ATXN3):5’-gauaggucccgcugcugcu-3’(19nt)

SEQ ID NO.27(miR155-5’臂):

5’-cuggaggcuugcugaaggcuguaugcug-3’

SEQ ID NO.28(miR环):5’-guuuuggccacugacugac-3’(19nt)

SEQ ID NO.29(miR155-3’臂):

5’-caggacaaggccuguuacuagcacucacauggaacaaauggcc-3’(43nt)

参考文献

US10072264B2

WO2005105995

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序列表

<110> 科英布拉大学

<120> 双链RNA及其用途

<130> P661.4 WO

<150> PT115253

<151> 2019-01-09

<160> 29

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> 外显子10处的靶序列 (rs12895357)(C)

<400> 1

agcagcagca gcgggaccua uca 23

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR357C.22

<400> 2

ugauaggucc cgcugcugcu gc 22

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR357C.21

<400> 3

ugauaggucc cgcugcugcu g 21

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR357C.19

<400> 4

ugauaggucc cgcugcugc 19

<210> 5

<211> 20

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR357C.20

<400> 5

ugauaggucc cgcugcugcu 20

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR357C.23

<400> 6

ugauaggucc cgcugcugcu gcu 23

<210> 7

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> 外显子10处的靶序列 (rs12895357)(G)

<400> 7

agcagcagca gggggaccua uca 23

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR357G.22

<400> 8

ugauaggucc cccugcugcu gc 22

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR357G.19

<400> 9

ugauaggucc cccugcugc 19

<210> 10

<211> 20

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR357G.20

<400> 10

ugauaggucc cccugcugcu 20

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR357G.21

<400> 11

ugauaggucc cccugcugcu g 21

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR357G.23

<400> 12

ugauaggucc cccugcugcu gcu 23

<210> 13

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> 外显子8处的靶序列 (rs1048755) (A)

<400> 13

accuggaacg aauguuagaa gca 23

<210> 14

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR755A.22

<400> 14

ugcuucuaac auucguucca gg 22

<210> 15

<211> 19

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR755A.19

<400> 15

ugcuucuaac auucguucc 19

<210> 16

<211> 20

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR755A.20

<400> 16

ugcuucuaac auucguucca 20

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR755A.21

<400> 17

ugcuucuaac auucguucca g 21

<210> 18

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR755A.23

<400> 18

ugcuucuaac auucguucca ggu 23

<210> 19

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> 外显子8处的靶序列 (rs1048755) (G)

<400> 19

accuggaacg aguguuagaa gca 23

<210> 20

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR755G.22

<400> 20

ugcuucuaac acucguucca gg 22

<210> 21

<211> 19

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR755G.19

<400> 21

ugcuucuaac acucguucc 19

<210> 22

<211> 20

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR755G.20

<400> 22

ugcuucuaac acucguucca 20

<210> 23

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR755G.21

<400> 23

ugcuucuaac acucguucca g 21

<210> 24

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR755G.23

<400> 24

ugcuucuaac acucguucca ggu 23

<210> 25

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR-对照

<400> 25

caacaagaug aagagcacca a 21

<210> 26

<211> 19

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> sh-ATXN3

<400> 26

gauagguccc gcugcugcu 19

<210> 27

<211> 28

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR155 - 5’ 臂

<400> 27

cuggaggcuu gcugaaggcu guaugcug 28

<210> 28

<211> 19

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR 环

<400> 28

guuuuggcca cugacugac 19

<210> 29

<211> 43

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR155 - 3’ 臂

<400> 29

caggacaagg ccuguuacua gcacucacau ggaacaaaug gcc 43

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种核糖核酸(RNA)分子，包含：

碱基配对至基本上互补的正义核糖核苷酸序列的反义核糖核苷酸序列；

其中所述反义RNA序列的每个核糖核苷酸与突变体人共济失调-3的相应的核糖核苷酸互补，所述突变体人共济失调-3包括在与所述突变体人共济失调-3基因的马查多-约瑟夫病(MJD)等位基因连锁不平衡中的单核苷酸多态性，并且

其中与所述突变体人共济失调-3mRNA的所述单核苷酸多态性互补的所述反义RNA序列的核糖核苷酸是除所述反义RNA序列的5’端处的核糖核苷酸之外的10个核糖核苷酸。

2.根据权利要求1所述的RNA分子，其中碱基配对的所述正义核糖核苷酸序列与所述反义核糖核苷酸序列不完全互补。

3.根据权利要求1所述的RNA分子，其中所述反义核糖核苷酸序列与所述正义核糖核苷酸序列至少90％互补。

4.根据权利要求1所述的RNA分子，其中所述反义核糖核苷酸序列与SEQ ID NO.1或13互补。

5.根据权利要求1所述的RNA分子，其中所述反义核糖核苷酸序列是SEQ ID NO.2、3、4、5、6、14、15、16、17或18。

6.根据权利要求1所述的RNA分子，其中所述反义核糖核苷酸序列是SEQ ID NO.2。

7.根据权利要求1所述的RNA分子，其中所述反义RNA序列的5’端和3’端处的核糖核苷酸相距至少17个核糖核苷酸。

8.根据权利要求1所述的RNA分子，其中所述反义RNA序列的5’端和3’端处的核糖核苷酸相距17-21个核糖核苷酸。

9.根据权利要求1所述的RNA分子，其中所述RNA分子是单个RNA分子。

10.根据权利要求7所述的RNA分子，其中所述RNA分子式miRNA。

11.根据权利要求1所述的RNA分子，其中所述单核苷酸多态性(SNP)包含所述人共济失调-3基因的rs1048755(外显子8)或rs12895357(外显子10)等位基因的SNP。

12.根据权利要求1所述的RNA分子，其中所述RNA分子是在选择性沉默所述突变体人共济失调-3基因的所述马查多-约瑟夫病(MJD)等位基因而不是野生型人共济失调-3等位基因的表达方面治疗有效的。

13.根据权利要求1所述的RNA分子，所述RNA分子包含衍生自miR-155的miRNA支架，其中所述反义核糖核苷酸是SEQ ID NO.2，并且所述正义核糖核苷酸是SEQ ID NO.1。

14.一种腺相关病毒载体，包含与启动子可操作连接的分离的DNA序列，其中所述DNA序列编码权利要求1所述的RNA分子。

15.一种用于选择性沉默突变体人共济失调-3等位基因的表达的方法，所述突变体人共济失调-3等位基因具有在与突变体人共济失调-3的马查多-约瑟夫病(MJD)等位基因连锁不平衡中的单核苷酸多态性，所述方法包括对需要其的受试者施用权利要求12所述的腺相关病毒载体。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述单核苷酸多态性(SNP)包含所述突变体人共济失调-3基因的rs1048755(外显子8)或rs12895357(外显子10)等位基因的SNP。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述腺相关病毒载体是全身、静脉内、肿瘤内、口服、鼻内、腹膜内、肌内、椎内、脑内、脑室内、脑池内、鞘内、眼内、心内、皮内或皮下施用，优选为静脉内，脑池内、鞘内或者原位通过脑内施用。