一种空间邻近化学发光二步法检测抗体的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及化学发光试剂盒技术领域，具体涉及一种空间邻近化学发光二步法检测抗体的试剂盒及方法。

背景技术

空间邻近化学发光技术是一种均相化学发光技术，发明人为美国H·阿哈万-塔夫狄，“非分离式测定方法”一步法检测。专利申请号201010616899.1的中国专利申请公开了一种非分离测定方法，其原理是一个抗体上标记辣根过氧化物酶(HRP)，另一个抗体上标记9,10-二氢吖啶(Acridan)，当样本中的抗原与特异性二个抗体标记物形成抗原抗体夹心复合物，使得辣根过氧化物酶与9,10-二氢吖啶(Acridan)在空间上得以相互接近，加入激发液后发光，通过已知浓度的校准品及其发光值绘制工作曲线，即可根据样本的发光值计算出样本中待测抗原的含量。该技术不需洗涤，真正均相，简单快速，已在临床上得到应用。

空间邻近化学发光技术的优势很明显，反应过程不需包被，不需洗涤，简单快速，但在临床应用过程中也存在不足，如临床上有许多检测项目需通过二步法才能完成，即通过洗涤步骤，排除非特异性的干扰，例如自身抗体检测等，现有的空间邻近化学发光技术则无法完成二步法检测，使得该技术在临床应用中存在局限性，很多项目由于方法学的局限性无法检测。

如对寨卡病毒抗体检测时，也需要二步法完成，检测过程需要通过洗涤，除去非特异的免疫球蛋白，即可达到特异性检测寨卡病毒抗体的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种空间邻近化学发光二步法检测抗体的试剂盒及方法，该试剂盒解决了空间邻近化学发光技术无法完成二步法检测的局限性；在检测体系中导入链霉亲和素/生物素系统，应用空间邻近化学发光技术能够完成需要二步法才能完成检测的临床项目，从而提高空间邻近化学发光技术临床应用范围和价值。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种空间邻近化学发光二步法检测抗体的试剂盒，该试剂盒中固相包被物是生物素标记的抗原，而H·阿哈万-塔夫狄发明专利固相包被物是抗体；所述试剂盒包括：

发光标记物、酶标记物、生物素标记抗原固相包被物、辅助剂、触发剂和校准品；

所述发光标记物原料组分包括9,10-二氢吖啶标记的抗人免疫球蛋白单克隆抗体；

所述酶标记物原料组分包括HRP标记的亲和素/链霉亲和素。

优选地，所述酶标记物的原料组分还包括0.05M磷酸盐缓冲液；

优选地，所述酶标记物的制备方法包括：

在1mg HRP中加入60mmol/L NaIO

优选地，所述生物素标记抗原固相包被物中固相载体为磁珠，并且通过如下方法制得：

取0.5ml商品化活性磁珠加入5ml反应杯中，放入专用试管架，用PH9.5的0.1mol/L的PB缓冲液，混匀洗涤，重复操作3次；将生物素标记抗原溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时后，用PH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液清洗包被磁珠3次，然后用磁珠保存液配置成0.05％的生物素磁分离试剂。

优选地，所述发光标记物的原料组分还包括0.05M Tris缓冲液；

优选地，所述发光标记物的制备方法包括：

将发光底物Acridan用500μL的DMF溶解；

吸取溶解的Acridan 41.3μL，加入0.05M硼酸钠缓冲液708.7μL，再加入250μL抗人免疫球蛋白单克隆抗体，翻转混匀4～5次，室温静置30min；

将标记反应管置于摇床上，于2～8℃下混合过夜，取出加入适量甘油后置于-20℃冰箱保存。

优选地，所述辅助剂的组分包括发光辅助剂和pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液，所述发光辅助剂为对羟基苯基丙烯酸；

优选地，所述辅助剂的制备方法包括：

称取枸橼酸1.82g，枸橼酸钠10.45g，加纯水溶解并定容至1000mL，在枸橼酸盐缓冲液中加入发光辅助剂，混匀后分装，置于4℃冰箱保存备用；其中，更优选每瓶装10mL。

优选地，所述触发剂选用0.05M pH 8.0Tris-HCl缓冲液；

优选地，所述触发剂的制备方法包括：

称取Tris 6.06g，氯化钠9g，加适量纯水溶解，再加入浓HCl 2.1mL混匀；之后加入吐温-20 2mL，混匀后定容至1000mL，分装，置于4℃冰箱保存备用；其中，更优选每瓶装200mL。

优选地，所述校准品包括不同浓度抗体的校准品和0.1M校准品稀释液；

优选地，所述校准品的制备方法包括：

配制校准品稀释液：称取磷酸二氢钾14.1g，NaH2PO4·2H2O 3.0g，加超纯水溶解，Proclin-300 0.5～1mL，混匀后，加超纯水定容至1000mL，得到校准品稀释液，2～8℃储存备用；

配制校准品：用所述校准品稀释液将纯化抗体稀释至相应浓度，2～8℃储存备用。

优选地，所述生物素标记抗原固相包被物中生物素标记抗原通过如下方法制得：

将待标记的抗原用缓冲液稀释到1-2.5ml，制得抗原溶液，所述缓冲液为0.1mol/L的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L的硼酸缓冲液；将1mg的NHSB溶解于1ml的DMSO中，制得NHSB溶液；取1ml抗原溶液在其中加入120u1NHSB溶液，室温下搅拌，保温2-4小时，再向其中加入9.6μl浓度为1mol/L的NH

优选地，所述碳酸氢钠缓冲液的pH为8.0；所述硼酸缓冲液的pH为8.6。

优选地，所述生物素标记抗原固相包被物中固相载体为磁珠，并且通过如下方法制得：

取0.5ml商品化活性磁珠加入5ml反应杯中，放入专用试管架，用PH9.5的0.1mol/L的PB缓冲液，混匀洗涤，重复操作3次；将生物素标记抗原溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时后，用PH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液清洗包被磁珠3次，然后用磁珠保存液配置成0.05％的生物素磁分离试剂。

优选地，所述抗原包括但不限于寨卡病毒抗原；

所述生物素标记抗原固相包被物中固相载体选自微孔板、试管、样品杯、塑料微球、纤维素试验条、纸测试条、塑料试验条、胶乳粒子、聚合物粒子、二氧化硅粒子以及磁珠中的任意一种。

本发明第二方面提供一种基于上述试剂盒二步法检测抗体的方法，包括步骤：

S1：将校准品和样本25μl分别加入装有25μl生物素标记抗原包被固相载体的反应管中，震荡混匀，在37℃下孵育15min；

S2：洗涤：PH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液洗涤3次。

S3：在校准品和样本反应管中分别加入酶标记物25μl、发光标记物25μl，震荡混匀，在37℃条件下孵育10min；

S4：在校准品和样本反应管中分别加入辅助剂5μl，震荡混匀，静置1～2min，再加入触发剂75μl，立即检测，读取信号；

S5：检测校准品和样本的发光强度，与CUTOFF值比较，计算出COI，判断结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

本发明通过将标记有生物素的已知抗原固定在固相载体表面，当加入样本后，特异性的抗体与抗原结合形成生物素·抗原-抗体复合物(注·为标记的意思)，洗涤除去非特异性抗体，再依次加入标记有9,10-二氢吖啶的抗人免疫球蛋白单克隆抗体和亲和素/链霉亲和素HRP标记物，形成HRP·亲和素/链霉亲和素-生物素-抗原-抗体-抗人单克隆抗体(抗抗体)·二氢吖啶，使他们在空间上得以相互接近，加入触发剂辅助剂及触发剂后，产生闪光型化学发光。

本发明在检测体系中导入链霉亲和素/生物素系统，应用空间邻近化学发光技术能够完成许多需要二步法才能完成检测的临床项目，从而提高空间邻近化学发光技术临床应用范围和价值；同时引入生物素-亲和素/链霉亲和素系统，可以大大提高化学发光效率，提高检测灵敏度；该体系可用于自动免疫化学发光系统，POCT及微流控芯片等快速定量分析；解决了H·阿哈万-塔夫狄，“非分离式测定方法”则无法完成二步法检测的技术问题，并克服了空间邻近化学发光技术无法完成二步法检测的局限性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义；如无特殊说明，采用的实验方法均为常规方法，实验材料可以通过生化试剂商店购买得到。

本发明实施例提供一种空间邻近化学发光二步法检测抗体的试剂盒，该试剂盒包括：

发光标记物、酶标记物、生物素标记抗原固相包被物、辅助剂、触发剂和校准品；

发光标记物原料组分包括9,10-二氢吖啶标记的抗人免疫球蛋白单克隆抗体和0.05M Tris缓冲液；

酶标记物原料组分包括HRP标记的亲和素/链霉亲和素和0.05M磷酸盐缓冲液；

触发剂选用0.05M pH 8.0 Tris-HCl缓冲液；

辅助剂包括发光辅助剂和pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液，发光辅助剂为对羟基苯基丙烯酸。

一、校准品的制备

配制校准品稀释液：称取磷酸二氢钾14.1g，NaH

配制校准品：用所述校准品稀释液将纯化抗体稀释至相应浓度，2～8℃储存备用。

二、HRP标记的亲和素/链霉亲和素的制备

在1mg HRP中加入60mmol/L NaIO

三、9,10-二氢吖啶标记的抗人免疫球蛋白单克隆抗体的制备

将发光底物Acridan用500μL的DMF溶解；

吸取溶解的Acridan 41.3μL，加入0.05M硼酸钠缓冲液708.7μL，再加入250μL抗人免疫球蛋白单克隆抗体，翻转混匀4～5次，室温静置30min；

将标记反应管置于摇床上，于2～8℃下混合过夜，取出加入适量甘油后置于-20℃冰箱保存。

四、辅助剂的制备

称取枸橼酸1.82g，枸橼酸钠10.45g，加纯水溶解并定容至1000mL，在枸橼酸盐缓冲液中加入发光辅助剂，混匀后分装，置于4℃冰箱保存备用；其中，更优选每瓶装10mL。

五、触发剂的制备

称取Tris 6.06g，氯化钠9g，加适量纯水溶解，再加入浓HCl 2.1mL混匀；之后加入吐温-20 2mL，混匀后定容至1000mL，分装，置于4℃冰箱保存备用；其中，更优选每瓶装200mL。

六、生物素标记抗原固相包被物的制备

1、生物素标记抗原的制备

将待标记的抗原用缓冲液稀释到1-2.5ml，制得抗原溶液，所述缓冲液为0.1mol/L的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L的硼酸缓冲液；将1mg的NHSB溶解于1ml的DMSO中，制得NHSB溶液；取1ml抗原溶液在其中加入120u1NHSB溶液，室温下搅拌，保温2-4小时，再向其中加入9.6μl浓度为1mol/L的NH

优选地，碳酸氢钠缓冲液的pH为8.0；硼酸缓冲液的pH为8.6。

2、生物素标记抗原包被固相载体中固相载体为磁珠，并且通过如下方法制得：

取0.5ml商品化活性磁珠加入5ml反应杯中，放入专用试管架，用PH9.5的0.1mol/L的PB缓冲液，混匀洗涤，重复操作3次；将生物素标记抗原溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时后，用PH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液清洗包被磁珠3次，然后用磁珠保存液配置成0.05％的生物素磁分离试剂。

在本发明中对抗原和固相载体的种类不作严格限制，例如，抗原可以为寨卡病毒抗原；固相载体可以选自微孔板、试管、样品杯、塑料微球、纤维素试验条、纸测试条、塑料试验条、胶乳粒子、聚合物粒子、二氧化硅粒子以及磁珠中的任意一种。

本发明实施例还提供一种基于上述试剂盒二步法检测抗体的方法，包括步骤：

S1：将校准品和样本25μl分别加入装有25μl生物素标记抗原包被固相载体的反应管中，震荡混匀，在37℃下孵育15min；

S2：洗涤：PH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液洗涤3次。

S3：在校准品和样本反应管中分别加入酶标记物25μl、发光标记物25μl，震荡混匀，在37℃条件下孵育10min；

S4：在校准品和样本反应管中分别加入辅助剂5μl，震荡混匀，静置1～2min，再加入触发剂75μl，立即检测，读取信号；

S5：检测校准品和样本的发光强度，与CUTOFF值比较，计算出COI，判断结果。

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实施例1

本发明实施例为空间邻近化学发光二步法检测寨卡病毒抗体的试剂盒，包括：

发光标记物、酶标记物、生物素标记寨卡病毒抗原包被磁珠、辅助剂、触发剂和校准品；

发光标记物原料组分包括9,10-二氢吖啶标记的抗人免疫球蛋白单克隆抗体和0.05M Tris缓冲液；

酶标记物原料组分包括HRP标记的亲和素/链霉亲和素和0.05M磷酸盐缓冲液；

触发剂选用0.05M pH 8.0Tris-HCl缓冲液；

辅助剂包括发光辅助剂和pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液，发光辅助剂为对羟基苯基丙烯酸；

校准品包括不同浓度抗体的校准品和0.1M校准品稀释液；

校准品的制备

配制校准品稀释液：称取磷酸二氢钾14.1g，NaH2PO

配制校准品：用校准品稀释液将寨卡病毒抗体稀释成CAL1和CAL2，2-8℃储存备用。

HRP标记的亲和素/链霉亲和素的制备

在1mg HRP中加入60mmol/L NaIO

生物素标记寨卡病毒抗原的制备

将待标记的抗原(寨卡病毒抗原)用缓冲液稀释到1-2.5ml，制得抗原溶液，所述缓冲液为0.1mol/L的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L的硼酸缓冲液；将1mg的NHSB溶解于1ml的DMSO中，制得NHSB溶液；取1ml抗原溶液在其中加入120u1NHSB溶液，室温下搅拌，保温2-4小时，再向其中加入9.6μl浓度为1mol/L的NH

其中，碳酸氢钠缓冲液的pH为8.0；硼酸缓冲液的pH为8.6。

生物素标记寨卡病毒抗原包被磁珠的制备

取0.5ml商品化活性磁珠加入5ml反应杯中，放入专用试管架，用PH9.5的0.1mol/L的PB缓冲液，混匀洗涤，重复操作3次；将生物素标记寨卡病毒抗原溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时后，用PH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液清洗包被磁珠3次，然后用磁珠保存液配置成0.05％的生物素磁分离试剂；

9,10-二氢吖啶标记的抗人免疫球蛋白单克隆抗体的制备

将发光底物Acridan用500μL的DMF溶解；

吸取溶解的Acridan 41.3μL，加入0.05M硼酸钠缓冲液708.7μL，再加入250μL抗人免疫球蛋白单克隆抗体，翻转混匀5次，室温静置30min；

将标记反应管置于摇床上，于2～8℃下混合过夜，取出加入适量甘油后置于-20℃冰箱保存。

辅助剂的制备

称取枸橼酸1.82g，枸橼酸钠10.45g，加纯水溶解并定容至1000mL，在枸橼酸盐缓冲液中加入对羟基苯基丙烯酸，混匀后分装，置于4℃冰箱保存备用；其中，更优选每瓶装10mL。

触发剂的制备

称取Tris 6.06g，氯化钠9g，加适量纯水溶解，再加入浓HCl 2.1mL混匀；之后加入吐温-20 2mL，混匀后定容至1000mL，分装，置于4℃冰箱保存备用；其中，更优选每瓶装200mL。

实施例2

本实施例为一种采用实施例1中试剂盒检测寨卡病毒抗体的方法，包括步骤：

S1：将校准品和样本25μl分别加入反应管中，再加入生物素标记寨卡病毒抗原包被磁珠25μl，震荡混匀，在37℃下孵育15min；

S2：洗涤，PH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液洗涤3次；

S3：在校准品和样本中分别加入酶标记物25μl、发光标记物25μl，震荡混匀，在37℃条件下孵育10min；

S4：在校准品和样本中分别加入辅助剂5μl，震荡混匀，静置1～2min，再加入触发剂75μl，立即检测，读取信号；

S5：：检测校准品和样本的发光强度，与CUTOFF值比较，计算出COI，判断结果；

当COI≧1.0时，检测结果判断为阳性；

当COI<1.0时，检测结果判断为阴性。

本发明采用空间邻近化学发光二步法检测寨卡病毒抗体，阳性检测率达99％，阴性符合率达100％；批内精密度CV<7％；批间精密度CV<12％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。