经由连接分子将生物分子等离子体固定化到基材的改进方法

技术领域

本发明涉及等离子体技术，尤其涉及将生物分子包含到等离子体沉积层中。

背景技术

WO2017/136334A1公开了将生物分子、药剂和其他治疗活性剂沉积在表面上的方法。该方法包括等离子体装置，其具有暴露于环境压力的等离子体出口、一个或多个电极、供气入口、以及可操作地连接至电极以在等离子体室内提供非热平衡等离子体的点火系统。颗粒递送系统可用于将活性剂作为干粉引入等离子体中或等离子体的下游，并沉积等离子体处理的活性剂以在表面上产生涂层。所述涂层可保持活性剂的活性。该发明试图解决这样的问题，即消除任何湿法化学步骤，以使用非热的大气等离子体在基材上获得至少两层的生物涂层。但是，由于该生物分子要经受苛刻的等离子体条件，因此该方法不适用于基材和生物分子的许多组合。

WO2005/106477公开了通过产生和维持大气压等离子体将生物分子固定在表面上的方法。固定化通过在两个电极之间的空间中引入样品、向电极施加交流电压、产生等离子体、并沉积涂层来实现。该混合气氛包括包含反应性前体的气溶胶和包含生物分子的气溶胶，两者均在沉积步骤期间被沉积并固定化。该方法也不适用于基材和生物分子的许多组合。该方法的另一个缺点是生物分子固定化的效率。连接分子和生物分子的同时沉积会导致空间位阻，从而限制了沉积的生物分子的量。而且，第一连接层的沉积可以增加固定在表面上的生物分子的量。

文件US2007/118211A1公开了一种制备药物洗脱医疗器械的方法，该方法包括将具有能够与生物分子化学结合的官能团的聚合物施加到支架上，其特征在于，所述施加通过冷等离子体方法在单个步骤中进行。此外，该发明还涉及一种由此获得的医疗器械。

文件2017/136334A1公开了将生物分子、药剂和其他治疗活性剂沉积在表面上的等离子体系统。该系统包括等离子体装置，其具有暴露于环境压力的等离子体出口、一个或多个电极、供气入口、以及可操作地连接至电极以在等离子体室内提供非热平衡等离子体的点火系统。颗粒递送系统可用于将活性剂作为干粉引入等离子体中或等离子体的下游，并沉积等离子体处理的活性剂以在表面上产生涂层。所述涂层可保持活性剂的活性。

文件US2009/298251A1公开了一种气溶胶喷雾设备以及使用该气溶胶喷雾设备形成膜的方法。根据该发明的实施方式的气溶胶喷雾设备包括：载气注入单元，其通过汽化液化气形成载气并增加载气的压力；气溶胶形成单元，其通过混合载气和粉末形成气溶胶；以及膜形成单元，其在常压环境下喷雾气溶胶以使得膜形成于板的表面。所述设备能够进行涂覆工艺而不受粉末的类型和尺寸的限制，简化流程，因为膜可以在常温常压环境下形成，并且可以在短时间内控制大范围的膜厚。

文件US2008/118734A1公开了一种在基底上形成含活性物质的涂层的方法，该方法包括以下步骤：i)将在等离子体环境内经历化学键形成反应的一种或多种气态或雾化液体和/或固体涂层形成材料和在等离子体环境内基本上不会经历化学键形成反应的一种或多种活性材料引入大气压或低压非热平衡等离子体放电和/或由所述等离子体放电得到的受激气流中，和ii)让基材暴露在所得的雾化的涂层形成材料和至少一种活性材料的混合物中，将所述混合物沉积到所述基材表面上而形成涂层；其中，所述基材不是家用护理或脱毛护理或水溶性家用清洁单元剂量产品的擦拭物、布或海绵。

本发明旨在解决上述问题和缺点中的至少一些。本发明的目的在于提供一种消除那些缺点的方法。

发明概述

在第一方面，本发明提供一种根据权利要求1的两步骤方法，其通过产生并维持非热大气压等离子体，经由连接分子将生物分子固定在基材的样品表面。

根据本发明的方法允许基材和生物分子的组合的更广泛的选择。特别地，相对惰性的基材和被证明难以结合生物分子的基材与对等离子体敏感的生物分子的组合可以通过本发明有利地固定。这可以通过为两个步骤选择合适的连接层和相应的等离子体条件来完成。

连接层的存在允许对结合的生物分子的量、控制生物分子固定的方向的能力、或这两者而言更有效的生物分子固定。此外，通过使用等离子技术、通过连接层的固定获得了简单的两步骤方法，而无需耗时、复杂、多步骤的湿法化学过程。这也排除了使用昂贵且对环境有害的溶剂。

在第二方面，根据权利要求10或11，本发明提供了一种适合于经由连接分子将生物分子两步固定在基材的样品表面上的设备。

该设备有利地适于根据本发明的两步骤方法。该设备适用于常规大气非热等离子体。但是，该设备特别适用于等离子体敏感的生物分子。

该设备由于喷嘴而适于沿着基材表面产生相对均匀的等离子体。此外，喷嘴相对于环境产生轻微的过压，由此大大排除了环境氧气。在所述分子到达表面之前，如果没有氧使离子化的分子失活，就会产生更加均匀的等离子体。这还允许沿射流产生较温和的等离子体条件，同时仍保留足够的能量以将分子沉积到表面或连接层上。

在第三方面，根据权利要求13，本发明公开了使用经由连接分子将生物分子固定在基材的样品表面的两步固定化可获得的设备。

可以通过本发明的方法结合的基材和生物分子的更广泛的组合允许新颖或改进的应用或产品。这些应用可以在但不限于医学、化学、环境、食品、材料工业中找到。详细的产品包括但不限于生物传感器、芯片实验室、仿生材料、太阳能电池、无污垢表面、抗微生物涂层、用于功能组织的体外或体内生长或两者的模板、生物诱导的晶体形态、导电涂层或生物催化应用。

有利地，本发明提供了一种方案，其用于解决因在医疗器械、伤口护理产品、生物传感器、芯片实验室、无污垢表面和抗微生物涂层的生产中使用湿法化学步骤而引起的工业化限制。一个特定的例子包括将生物分子固定在玻璃、石英或硅晶片上以进行研究和诊断。另一个是将生物分子、特别是具有抗菌或抗真菌特性的生物分子固定在用于伤口敷料的纺织品上。

附图说明

图1显示了三明治ELISA中试剂之间的相互作用。

图2显示了等离子体沉积的抗体与通过传统湿法化学方法沉积的抗体的功能比较。

图3显示了空白样品与阳性样品(Ab+AA，未孵育，4slm，9秒)之间的关系。

图4显示空白与阳性样品之间的关系(仅Ab，未孵育，2slm，不同的暴露时间)，以及不含捕获抗体的对照样品与阳性样品之间的关系。

图5显示了空白样品与阳性样品(仅Ab，未孵育，不同的抽吸流量，9秒)之间的关系。

图6显示了使用大气等离子体(Ab+AA)固定后，不同孵育方法对抗体功能的影响的比较。

图7显示了使用大气等离子体(仅Ab)固定后，不同孵育方法对抗体功能的影响的比较。

图8示出了在有和没有同时进行丙烯酸的等离子体聚合的情况下固定的抗体的功能的比较。

图9显示了抽吸流量对ELISA终点的影响。

图10显示了暴露时间对ELISA终点的影响(未孵育)。

图11显示了暴露时间对ELISA终点的影响(湿孵育)。

图12显示了暴露时间对ELISA终点的影响(1slm，未孵育，Ab+AA)。

图13显示了暴露时间对ELISA终点的影响(4slm，未孵育，Ab+AA)。

图14示出了根据本发明的设备的实施方式的正视图。

图15a和15b分别示出了根据本发明的护罩的实施方式的纵向视图和侧视图。

发明详述

本发明涉及通过非热大气压等离子体、经由连接分子将生物分子固定在基材的样品表面上的两步骤方法和设备。在上面的相应部分中总结了本发明。在下文中，将详细描述本发明，讨论优选实施方式，并通过实施例说明本发明。

除非另有定义，否则用于公开本发明的所有术语，包括技术和科学术语，均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。通过进一步的指导、包括术语定义以更好地理解本发明的教导。

如本文所用，下列术语具有以下含义：

除非上下文另外明确指出，否则本文所用的“一个”、“一种”和“该”均指单数和复数指代物。举例来说，“一个隔室”是指一个或多个隔室。

如本文所用，“约”是指诸如参数、量、持续时间等的可测量值，意在涵盖与规定值相差+/-20％或更小，优选+/-10％或更小，更优选+/-5％或更小，甚至更优选+/-1％或更小，还更优选为+/-0.1％或更小的范围，到目前为止，这种变型适合于在所公开的发明中执行。然而，应当理解，修饰语“约”所指的值本身也被具体公开。

如本文所用，“包括”、“包含”、“涵盖”与“具有”、“有”、“含有”同义，是包含性或开放性的术语，其指定之后的内容(例如组件)的存在，并且不排除或排斥本领域已知的或其中公开的其他未引用的组件、特征、元件、构件、步骤的存在。

此外，除非另有说明，否则说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分相似的元件，而不一定用于描述次序或时间顺序。应理解，在合适的情况下，如此使用的术语可互换使用，本发明所述的实施方式能够按照除本文所述或说明的顺序以外的其它顺序进行操作。

藉由端点对数值范围进行的叙述包括该范围内包括的所有数字和分数、以及所列举的端点。

尽管术语“一个或多个”或“至少一个”(如一组成员中的一个或多个或至少一个成员)本身是清楚的，通过进一步举例，该术语尤其包括对任何一个所述成员或任何两个或多个所述成员的引用，例如，任何≥3，≥4，≥5，≥6或≥7的所述成员，并直至所有所述成员。

如本文所用，“样品表面”表示基材的一部分或整个表面。样品表面优选具有至少1μm

如本文所用，“连接层”是指包含连接分子的层，在沉积时，该连接分子可以进行聚合，或可以作为单体保留在表面上。

如本文所用，“等离子体射流”是指等离子体射流和/或等离子体射流的余辉。例如，注入到护罩内部的“等离子体射流”中的涂层前体可以指注入到护罩内部的等离子体射流和/或等离子体射流的余辉中的涂层前体。

如本文所用，“部分”表示分子的一部分，该部分的名称也可以在其他种类的分子中找到。本文所定义的部分包含至少一个官能团或至少一个较小的部分或其组合。

如本文所用，“生物分子”表示存在于生物中的分子或离子，特别是对于某些典型的生物过程必不可少的分子或离子、以及所有的生物学和药学活性分子。这包括即使不是“自然”存在也显示出生物或药学活性的合成化学物质。

如本文所述，“生物学或药学活性分子”涉及对生物具有生物学活性或药理活性的分子。也就是说，该分子涉及对生物的有益或不利影响。

在第一方面，本发明提供一种两步骤方法，其在室温和60℃之间的温度下通过产生并维持非热大气压等离子体，经由连接分子将生物分子固定在基材的样品表面。优选的等离子体温度是室温。室温应理解为在5℃至25℃之间、更优选在15℃至25℃之间、最优选约20℃。该方法包括依次进行的第一步和第二步。在该方法的第一步中，通过将样品表面暴露于第一等离子体射流和连接分子，将连接分子沉积到样品表面上，从而在样品表面上生成连接层。在该方法的随后的第二步中，通过将连接层暴露于第二等离子体射流和生物分子，将生物分子沉积到连接层上。

通常需要连接层以改善基材表面与生物分子之间的粘附力。两步工艺是有利的，因为它允许使用不同的等离子体条件来生成连接层和固定生物分子。当使用需要苛刻的等离子体处理的表面或固定对等离子体敏感的生物分子时，这是特别有利的。

如本文所用，“大气压”表示压力大致或大约与周围环境的压力匹配。该术语将本发明的等离子体技术与低压和高压等离子体技术区分开来，低压和高压等离子体技术需要反应容器与环境保持较大的压差。因此，等离子体技术的普通技术人员将理解，本文所使用的“大气压”不应解释为定义为101 325Pa的压力单位“atm”。优选地，等离子体将维持在0.6巴与5.0巴之间的压力，更优选地，等离子体将维持在0.7至4.5巴之间的压力，更优选地，等离子体将维持在0.8至3.0巴之间的压力，更优选地，等离子体将维持在0.9到2.5巴之间的压力，更优选地，等离子体将保持在1.0巴和2.5巴之间的压力，最优选地，高于1.0巴且低于2.5巴的压力。最优选地，与环境压力相比，等离子体将维持稍高的压力。这是有利的，特别是与根据本发明的设备组合时是有利的，因为这大大减少了从环境向等离子体中的氧气流入。结果获得了更稳定、均匀的等离子体。由于等离子体射流与基材表面之间的均匀性增加，因此可以使用较温和的等离子体射流条件，同时保持足够的活性以产生连接层或固定生物分子。这对于等离子体敏感分子特别有利。大多数生物活性分子(例如蛋白质)对等离子体敏感。

在优选的实施方案中，用于产生两个所述等离子体射流的等离子体气体选自氦、氩、氮、空气、二氧化碳、铵或其组合。对于该过程的每个步骤，可以使用两种不同的等离子体气体。更优选地，将氩气用作等离子体气体以便产生第二等离子体射流。氩气产生的侵蚀性较小，并保持表位的完整性。这允许将等离子体敏感分子(如否则将在等离子体存在下变性的许多生物分子)固定在表面上，同时保留其生物学功能。更优选地，将氩气用作等离子体气体以便产生所述两个等离子体射流。这有利地允许使用相同的等离子体气体来产生两个等离子体射流。这还允许使用具有单个等离子体射流和多个释放前体通道的等离子体设备，这具有较低的投资成本和较低的运行成本。优选地，多个释放前体通道位于射流出口的上游，更优选地位于等离子体射流发生器中。在一个实施方式中，该设备包括2、3、4、5或更多个释放前体通道。取决于设备所预期的工艺，可以考虑该工艺中使用的不同前体的数量来选择释放前体通道的数量，更优选地，释放前体通道的数量至少是不同的前体的数量。

在优选实施方式中，以第一电极功率产生第一等离子体射流，并且以第二电极功率产生第二等离子体射流，其中第一电极功率高于第二电极功率。较低的第二电极功率允许产生较低能量的等离子体，这优选用于固定对等离子体敏感的生物分子，而较高能量的等离子体有利于连接层的沉积。

可以理解，使用电极以电极功率工作产生等离子射流。以第一电极功率产生第一等离子体射流。以第二电极功率产生第二等离子体射流。如本文所用，“电极功率”是根据喷嘴的等离子体出口的面积来定义的。这更准确地表示了每单位受影响的基材表面积的功率输入。

在一个优选的实施方式中，第一电极功率为至少1.0W/cm

在一个优选的实施方式中，第二电极功率为至多1.5W/cm

在一个优选的实施方式中，第一电极功率至少为1.0W/cm

在优选的实施方式中，基材选自生物材料、复合材料、结晶固体、纺织品、金属、塑料、聚合物、陶瓷、玻璃或其组合。优选地，样品表面选自玻璃、石英、塑料、聚合物、纺织品、硅、皮肤、组织或其组合。玻璃、石英和硅对于研究和诊断环境特别有利。它们是可重复使用的，相对便宜且惰性的，并且已经被用作行业标准。

组织、纺织品和皮肤对于诸如伤口敷料等用于生物的医疗和诊断产品特别有利。将生物活性固定在表面上可以使生物分子更有针对性地使用。可以防止生物分子在应用于生物后的分散或吸收。可以通过去除表面来去除生物分子。

在一个优选的实施方式中，连接分子是包含至少一个部分的分子。优选地，连接分子包含两个部分。在一个优选的实施方式中，至少一个部分适合于连接层与生物分子的连接。精心选择的部分可以使生物分子更好、更容易和更牢固地附着在连接层上。这有利地允许使用更多的生物分子，特别是敏感的分子。这也使得生物分子在连接层上的取向可以被靶向和操纵。有益的取向增加了生物对生物分子的利用度。在另一个优选的实施方式中，一个部分适合于将连接分子附着到样品上。这提高了连接层与基材表面之间的结合强度。在另一个优选的实施方式中，一个部分适合于连接分子的聚合。这允许连接层形成聚合物网络，该聚合物网络提高了基材表面与生物分子之间的结合强度。其还可以改善表面的化学和机械性能，例如增加硬度和降低反应性。在另一个优选的实施方式中，附着分子包含至少两个部分，其中一个适合于将连接分子连接至基材的表面，并且至少一个适合于将生物分子连接至连接层。在最优选的实施方式中，这些部分不彼此并排放置，以使空间位阻的发生最小化。

在一个优选的实施方式中，至少一个部分选自烷烃、烯烃、炔烃、苯衍生物、卤代烷烃、氟代烷烃、氯代烷烃、溴代烷烃、碘代烷烃、醇、酮、醛、酰卤、碳酸盐、羧酸盐、羧酸、酯、甲氧基、氢过氧化物、过氧化物、醚、半缩醛、半缩酮、缩醛、缩酮、原酸酯、杂环、原碳酸酯、酰胺、胺、亚胺、酰亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、氰酸盐、硝酸盐、腈、亚硝酸盐、硝基化合物、亚硝基化合物、肟、吡啶衍生物、硫醇、硫醚、二硫化物、亚砜、砜、亚磺酸、磺酸、磺酸酯、硫氰酸盐、硫代酮、硫代、硫代酯、膦、膦酸、磷酸盐、磷酸二酯、硼酸、硼酸酯、二羟基硼酸(borinicacid)、二羟基硼酸酯(borinic ester)或其组合。优选地，该部分选自羧酸、硫醇、羟基、胺或三烷氧基硅烷。这些部分特别适合附着对等离子体敏感的生物分子，特别是抗体。这允许将这些分子固定在否则难以粘附的基材上，例如玻璃、石英、塑料、聚合物、纺织品、硅、皮肤、组织或其组合。

在一个优选的实施方式中，生物分子是生物学或药学活性分子。

在一个优选的实施方式中，生物分子选自蛋白质、多核苷酸、糖、脂质、生长因子、激素和生理活性物质或其组合。优选地，所述生物分子是抗体或包括抗菌和/或抗真菌活性。固定生物学或药学活性分子对于需要受控环境的研究和诊断是有利的。对于药物的靶向应用也是有利的。可以以非常可控的方式在特定时间内在特定位置施加结合到表面的生物学或药学活性。这样，本发明特别适用于生产诊断装置或伤口护理产品。最优选地，生物分子是抗体。抗体通常对等离子体非常敏感。本发明对于固定对等离子体敏感的分子特别有利。

在一个优选的实施方式中，生物分子以溶解状态施用。在一个更优选的实施方式中，将生物分子溶解在水性溶剂中。在另一个优选的实施方式中，将生物分子作为气溶胶嵌入等离子体射流中。在另一个优选的实施方式中，将生物分子作为水性气溶胶嵌入等离子体射流中。不受理论的束缚，据信这允许生物分子在嵌入等离子体射流中时被水状外壳保护，这有助于保持其生物活性。由于水溶胶限制聚集，通过水性气溶胶施用生物分子还促进了生物分子的均匀分布。这提高了基材表面上的生物分子的利用度。

在一个实施方式中，提供连接层的步骤包括创建多个用作连接层的层的多个步骤。例如，第一接头可以改善接头对基材表面的粘附力。第二接头可以与第一接头连接，并改善生物分子的固定化。

在另一个实施方式中，将生物分子固定在连接层上的步骤包括多个步骤。例如，几层生物分子可以沉积为多层。或者，不同的生物分子可以分布在基材表面上。这对于提供多种作用或协同作用可能是有利的。

在一个实施方式中，连接层与基材表面之间的结合不是永久的。在令一个实施方式中，连接层与生物分子之间的结合不是永久的。生物分子的非永久固定允许生物分子在目标位置的受控释放。

在第二方面，本发明提供了一种适合于经由连接分子将生物分子两步固定在基材的样品表面上的设备。该设备包括具有射流出口的等离子体射流发生器。该设备还包括一个适配器和一个可更换的护罩。护罩包括射流入口、喷嘴出口和从射流入口延伸至喷嘴出口的侧壁。适配器被构造成用于将护罩可拆卸地附接到等离子体射流发生器上、并由此以连通地联接射流出口和射流入口。

如本文所用，“连通地联接”是指质量流，即流体、气体和/或等离子体流。因此，等离子体射流发生器的连通地联接的射流出口和护罩的射流入口被配置为使等离子体射流离开所述射流出口以经由射流入口进入护罩。

在优选的实施方式中，等离子体射流发生器的射流出口包括开口，并且护罩的射流入口包括开口，由此射流入口的开口大于射流出口的开口。这是有利的，因为增大导致速度降低和压力升高，从而有助于相对于环境在护罩内部产生过压。这进一步是有利的，因为急剧增大会引起湍流和/或回流，并因此导致存在于护罩的相应部分中的组分的混合。优选地，护罩包括在射流入口和喷嘴出口之间的长度，并且所述至少一个前体入口在射流入口的距离等于所述长度的至多50％、优选为所述长度的至多40％、更优选为所述长度的至多30％的范围内与护罩的内部连通地联接。这是有利的，因为前体的流入发生在也会发生回流的区域中。这是进一步有利的，因为前体的流入发生在基本上不平行于、优选基本上垂直于射流入口处的等离子体射流流入的方向、优选基本上平行于长度方向上，从而进一步增加了湍流。

在优选的实施方式中，喷嘴包括均质装置。优选地，护罩包括所述均质装置，优选地在内部。均质装置可以包括扰流元件。扰流元件可包括多个倾斜表面。扰流元件可以包括多个层，每个层包括多个倾斜表面。扰流元件可包括与护罩的长度方向成至少20°且至多70°的角度的表面。

优选地，护罩是一体式的。护罩可以通过注射成型来制造。护罩可以通过3D打印来制造。优选地，护罩包括绝缘材料，更优选地为塑料。护罩的喷嘴出口包括边缘。护罩的喷嘴出口可以包括平坦的边缘，即喷嘴出口是平坦的。护罩的喷嘴出口可以包括非平坦的边缘，即喷嘴出口是非平坦的。这允许非平坦表面的在线涂覆，从而在边缘和表面的每个部分之间保持很小的距离。

在优选的实施方式中，喷嘴适于冷却。优选地，护罩的侧壁包括用于冷却流体通过的通道。通道优选地位于距喷嘴出口的距离为护罩的长度的至多60％，更优选地至多50％，甚至更优选地至多45％的位置上。

在一优选实施方式中，护罩的侧壁包括至少一个前体入口，优选地至少两个前体入口，例如两个、三个、四个或更多个前体入口。前体入口可以包括管状空心体，该管状中空体包括与护罩的内部连通地联接的第一外端和用于与前体源连通地联接的第二外端。管状体可以是圆柱形的。管状体可包括一个或多个弯曲部。可以通过所述至少一个前体入口将涂层前体注入到护罩中的等离子体射流中。

在另一个优选的实施方式中，一个前体入口是连接分子前体入口，另一个前体入口是生物分子前体入口。在另一个优选的实施方式中，所述生物分子前体入口适合于气溶胶化所述生物分子前体，所述生物分子前体优选是在水性介质中的溶解的生物分子。该设备是特别有利的，因为单一的等离子体射流可用于两步骤方法的两个步骤。该设备可用于两步骤方法，其中使用相同的等离子体气体。与使用两个单独的等离子体射流相比，这可以更快、更低成本地执行该工艺。

在一个优选的实施方式中，该设备包括具有连接射流出口的连接等离子体射流发生器。而且，该设备包括具有生物分子射流出口的生物分子等离子体射流发生器。而且，该设备包括一个适配器和一个可更换的护罩。适配器构造成用于将护罩可拆卸地附接到连接的等离子体射流发生器、生物分子等离子体射流发生器或两者上。由此，适配器选择性地并且连通地联接连接射流出口、生物分子射流出口、或两者与射流入口。

在第三方面，本发明公开了使用经由连接分子将生物分子固定在基材的样品表面的两步固定化可获得的设备。

在一个优选的实施方式中，产品是固定在玻璃、石英或硅晶片上的用于诊断目的的接头辅助抗体。

在一个优选的实施方式中，该产品是用于伤口敷料的贴剂，其包括用具有抗菌特性、抗真菌特性或两者的生物分子官能化的织物贴剂。

通过以下非限制性实施例进一步描述本发明，所述非限制性实施例进一步举例说明本发明，并且无意于也不应解释为限制本发明的范围。

现在参考非限制性实施例更详细地描述本发明。

实施例

在这些实验中使用了以下缓冲液。创建了一个由25ml(毫升)PBS(Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水，Gibco(吉布可公司))和0.25g(克)BSA(牛血清白蛋白，Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))组成的封闭缓冲液，摇动以确保每个都已溶解。包含25ml I型超纯水(Synergy UV Milli-Q水，Millipore(密理博公司))，2.5g甘露醇(D-甘露醇≥98％，西格玛-奥德里奇公司)和0.5g蔗糖(D(+)-蔗糖99.7％，Acros Organics(阿科斯有机品公司))的存储缓冲液。包含150ml PBS和3μl Tween80(西格玛-奥德里奇公司)的洗涤缓冲液。由于吐温80的粘度，需要小心。包含150ml PBS、0.15g BSA和3μl Tween80的PTA缓冲液。使用分析天平确定组分的质量。

所有喷嘴均专门为此实验进行3D打印。通过向玻璃瓶

将冰袋用胶带固定在装有溶液的瓶子上，以在沉积过程中将溶液温度保持在4℃，然后将其保存在冰箱中。通过运行“清洁雾化器”程序5分钟，使用4slm的抽吸流量将两个清洁的注射器润湿。去离子(DI)水用于抗体注射器(Ab注射器)，丙烯酸(CAS 79-10-7，abcr(abcr公司))(AA)用于丙烯酸注射器(AA注射器)。通过用蘸有乙醇的无纺布(TX609，

然后使用

确定了无关的变量：抽吸气体、稀释气体、电极功率、电极频率、等离子体用气体、抗体溶液浓度、喷嘴形状、喷嘴-基材分离、用作反应前体的化学物质、接头单层、基材、基材预沉积蚀刻处理。这些变量在此试验中均保持不变。

在此调查中更改的变量是：抽吸流量、稀释流量、暴露时间、孵育的存在和类型、AA共沉积的存在/不存在。

测试了抽吸流量和稀释流量的四种不同组合。第一个组合包括1slm抽吸流量和4slm稀释流量。第二个组合包括2slm抽吸流量和3slm稀释流量。第三个组合包括3slm抽吸流量和2slm稀释流量。第四个组合包括4slm抽吸流量和1slm稀释流量。

电极功率设置为60W，频率保持恒定在38kHz，氩等离子体气体流量设置为80slm。对于仅Ab的条件，仅使用Ab注射器，并且禁用了AA注射器，在Ab+AA的条件下，两个注射器均被激活。将喷嘴插入要处理的孔2mm。暴露时间为5–40秒，以5秒为增量增加。每次沉积后，移动头以从孔中移出喷嘴，然后将其插入下一个。每种条件在三个孔中重复。一旦处理完所有孔后，将板移出，并遵循适当的孵育步骤。

测试了三种不同的孵育条件：湿孵育，干孵育和未孵育。通过使用移液器(Multipipette M4 1μl–10mL，Eppendorf(Eppendorf公司))和吸头(Combitips Advanced2,5mL PCR clean，Eppendorf公司)向每个孔中添加175μl PBS缓冲液来准备湿孵育，并将该板在4℃下保存24小时。然后通过在NwW上轻敲将孔排空，直到不再出现残留物为止。将175μl PBS和1％BSA封闭缓冲液吸移到每个孔中。然后将板在室温(RT)下孵育2小时，然后通过在NwW上轻敲将孔排空。通过将板在4℃下保存24小时来准备干孵育。将175μl PBS和1％BSA封闭缓冲液吸移到每个孔中。然后将板在RT下孵育2小时，并且通过在NwW上轻敲将孔排空。通过将175μl PBS和1％BSA封闭缓冲液吸移到每个孔中来准备未孵育条件。将板在RT下孵育2小时。然后通过在NwW上轻敲将孔排空。

孵育后，通过向其中吸移175μl PBS和0.002％Tween 80溶液并将其在NwW上排空来洗涤这些孔。该过程重复4次。将175μL/孔的D-甘露醇(100g/L)和蔗糖(20g/L)的存储缓冲液添加到每个孔中，并将板在RT下孵育3分钟。然后通过在NwW上轻敲将孔排空。最后，将板包裹在锡箔中，并在-20℃下保存在冰箱中。

将板从冰箱中移出。通过将150μlPBS和0.002％Tween 80移入孔中，将板洗涤4次，然后通过在NwW上轻敲将其排空。加入175μL/孔的PTA中的10ng/ml的IgE溶液(免疫球蛋白E骨髓瘤kappa，Athens Research&Technology(雅典研究与技术公司))，并将板在RT下孵育1小时。一式三份的孔之一总是留着空，作为空白。每个孔用PBS+0.002％Tween 80洗涤4次，然后通过在NwW上轻敲将其排空。向每孔中加入175μL/孔的检测抗体、1μg/ml的生物素-抗IgE偶联物(山羊抗人IgE抗体，生物素偶联，交叉吸附，英杰公司)。将板在RT下孵育2小时。将每个孔用PBS和0.002％Tween 80洗涤4次，然后通过在NwW上轻敲将其排空。将175μL/孔的分辨酶(100ng/ml链霉亲和素-HRP(链霉亲和素辣根过氧化物酶偶联物，Thermo Fisher(赛默飞世尔公司))的PTA溶液)添加到每个孔中。将板在RT下放置1小时。将每个孔用PBS和0.002％Tween 80洗涤4次，然后通过在NwW上轻敲将其排空。加入100μL/孔的四甲基联苯胺(TMB)(1-Step Ultra TMB-ELISA，Thermo Scientific(赛默飞世尔科技公司))。注意：在第二个实验的情况下，每孔添加150μl TMB。加入底物后，立即将板插入分光光度计。分光光度计在开始之前摇动板，标准液被设定为“costar康宁板黑色透明底”。加入TMB后，每5分钟测量370nm和652nm波长的光的吸光度，持续1小时。

下表中显示了实施例及其参考编号。实施例7和8没有任何抽吸或孵育时间，因为暴露时间为0秒。

结果

利用MPG的常压等离子体技术，通过控制暴露时间、抽吸流量和稀释流量、孵育程序和沉积方法来确定最佳的抗体沉积条件，以优化通过三明治ELISA证明的功能(图1)。可以通过如下所示的吸收曲线推导反应的动力学。这些显示了捕获抗体对靶抗体的亲和力，并提供了捕获抗体保留的功能的量度。因为反应稳定并在约40分钟后达到吸光度平稳期，所以在60分钟时测量所有终点。

捕获抗体(山羊IgG抗人IgE)显示出保留其功能，如图2所示。该图显示了与KULeuven提供的参比曲线相比的试验的最佳结果，该参比曲线是使用其标准物从聚苯乙烯微量滴定板上的传统湿法化学沉积方法获得的。每个反应的动力学都不同，只有一个试验产生的信号表明反应比参比更快(实施例2：“仅Ab，4slm，10秒，湿孵育”)。还应注意，第二次试验(“仅Ab，4slm，10秒，湿孵育”，“仅Ab，4slm，10秒，未孵育”和“仅Ab，2slm，20秒，未孵育”)产生的反应产生了更强的信号，信号较早饱和。这可以通过在第二次试验中添加的TMB体积增加(150μl而不是100μl)来解释。由于所有终点都落在3-4个任意单位(arb.u.)之间，因此它们都可以视为与参比值相当。这表明在功能保持性方面，大气等离子体沉积方法可与当前方法相当，并且低能等离子体暴露不会由于结构变化而导致变性。

抗体的特异性通过针对每种测试条件的空白样品测试来确定。通过在ELISA方案中不添加靶IgE来创建空白，除了其中没有捕获抗体沉积。图3至图5显示了空白样品与阳性样品之间的比较，表明未发生非选择性结合，因此产生的信号归因于捕获抗体与靶抗体的结合。

当Ab和AA共沉积时(图3)以及当Ab单独沉积时(图4)，空白产生的信号都比相应的阳性样品产生的信号要低得多。如图4所示，当没有捕获抗体沉积时也是这种情况。在该试验中，不存在捕获抗体，因此靶IgE只能与聚丙烯酸连接层的羧基相互作用。由于产生的信号非常低，并且与缺乏靶IgE的试验所产生的信号相当，因此我们可以得出结论，在聚丙烯酸层与靶IgE或测定的其他元素之间没有发生交叉反应。图5显示，如果抽吸流量从1slm增加到4slm，交叉反应也不会增加，这表明该因素不会影响所测抗体的特异性。

这说明大气等离子体沉积可以产生特异性的生物测定，并且该过程不干扰抗体的构象，因此不影响其特异性。

通过遵循三种不同的孵育方案，同时保持所有其他参数相同，并比较反应对动力学的影响，来测量孵育的效果。孵育期对于湿法化学方法至关重要，因此，确定其在大气等离子体沉积方面的必要性表明了另一种可以节省时间的方式，从而可以简化该工艺的工业化过程。

如图6和7所示，为进行有和没有共沉积AA的试验而完成了不同的孵育步骤。在这两种情况下，数据均显示孵育步骤不会显著增加吸收的终点值，这表明当使用大气等离子体沉积抗体时，孵育步骤不是必需的。图6中的曲线表明所有反应的动力学都相似，但是如图7所示，湿孵育试验的动力学更快。这可以通过以下事实来解释：在第二次试验中完成了“仅Ab，4slm，10秒，湿孵育”(图7)，因此，更多的TBM会使HRP更快地饱和，从而使吸光度变化更快并且更早地饱和。

Heyse等在2011年认为共沉积(定义为化学物质同时进行等离子体聚合和蛋白质沉积)会导致蛋白质被困在聚合物网中，从而增加沉积强度。为了检验该理论，在保留所有其他参数相同的情况下，在有和没有AA的情况下沉积Ab。

如图8所示，由于没有共沉积AA的试验的吸收率和反应速率较高，因此数据与Heyse等人的理论相矛盾。这表明在不添加共前体的情况下抗体固定仍然是成功的，或者共沉积导致抗体结合位点的空间位阻，从而降低了IgE靶标的结合。

这使得沉积条件会影响固定在孔中的捕获抗体的数量是合理的。反过来，这将反过来影响与捕获抗体结合的IgE的量，从而影响所测量的吸光度。为了对此进行研究，更改了几个沉积参数以尝试确定理想的沉积条件。

图9显示了针对仅在10秒暴露时间仅进行AB沉积且未孵育的样品绘制的、沉积所用的抽吸流量对反应终点的图。原先认为抽吸流量越高，沉积的抗体越多，因此ELISA中产生的信号越强，但是事实并非如此。终点仅增加到3slm，然后减小。这可能是由于过量抗体引起的空间位阻。

图10显示了作为以秒为单位的暴露时间的函数的、在60分钟后的吸光度，恒定抽吸为2slm，未孵育。图11显示了作为以秒为单位的暴露时间的函数的、在60分钟后的吸光度，恒定抽吸为2slm，湿孵育。原先还认为暴露时间与沉积的抗体量相关，因此ELISA中产生的信号越强。再次发现，事实并非如此，如图10和11所示。在这里，终点信号显示增加，但在10秒和20秒之间达到平稳期(分别为图11和10)，这表明存在更多抗体并不一定会导致更有效的测试。图12和13示出了在特定的点，随着暴露时间的延长，信号开始减小(图13中的23秒和图12中的40秒)。由此我们可以确定，可以使用短时间的暴露而产生相似的效果，从而进一步减少了固定抗体所需的时间。

使用大气等离子体技术固定抗体已被证明是一种可行的方法，因为抗体功能保持在与传统湿法化学方法相同的水平上。还显示了抗体活性位点的特异性得以保持，因为在空白样品中未观察到发生交叉反应或非特异性结合。结论是，在此抗体固定方法中，孵育步骤已过时，因为湿孵育或干孵育均不会显著增加ELISA信号。此外，发现由于在共沉积中形成的AA网产生的空间位阻，没有AA的Ab的沉积增加了ELISA的信号。还研究了最佳的沉积参数并得出结论，如果抽吸流量和暴露时间过高，抗体的功能将受到阻碍。