导航：首页> 基本电气元件>特异性识别粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α的抗体及其用途

特异性识别粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α的抗体及其用途

文献发布时间：2023-06-19 12:25:57

以ASCII TEXT文本文件提交序列表

以下提交的ASCII TEXT文本文件的内容通过整体引用并入本文中：计算机可读形式(CRF)的序列表(文本名称：710262000140SEQLIST.txt，记录日期：2018.11.07，大小：248KB)

技术领域

本发明涉及特异性识别粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α(GM-CSFRα)的抗体，及其制备方法和用途，包括用其治疗自身免疫性疾病、炎症以及癌症的方法。

背景技术

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)也称为集落刺激因子2(CSF2)。GM-CSF是I型促炎细胞因子，其在加剧炎性、呼吸和自身免疫疾病方面起作用。GM-CSF受体是造血受体超家族成员之一，为异二聚体，由α和β亚单位组成。GM-CSF能够以相对低的亲和力与α亚单位单独结合(Kd 1-5nM)，但是完全不与β亚单位单独结合。而当α和β亚单位同时存在时，则会产生一个高亲和力的配体-受体复合物(Kd≈100pM)。因此，对GM-CSF与GM-CSFRα结合的中和作用，成为治疗GM-CSFRα介导的疾病和病症的治疗方法。专利申请WO2007110631中披露了抗人GM-CSFRα的抗体Mavrilimumab(Mab，在本专利实施例部分作为对照抗体)。

本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公开的专利申请中披露的内容，以引用方式全部并入本文中。

发明概述

一方面，本发明涉及一种分离的抗GM-CSFRα抗体，能够特异性地与人GM-CSFRα的表位结合，其中该表位包含选自由人GM-CSFRα的Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283和Ile284所组成的组中的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸残基。在一些实施例中，该表位进一步包含如下氨基酸残基：(i)Val51、Thr63和Ile196；(ii)Leu191和Ile196；或(iii)Arg49、Val51、Asn57和Ser61。在一些实施例中，分离的抗GM-CSFRα抗体与人GM-CSFRα的结合的Kd值为0.1pM至1nM。

在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗GM-CSFRα抗体，所述分离的抗GM-CSFRα抗体包括重链可变域(V

在一些实施例中，涉及一种分离的抗GM-CSFRα抗体，包括V

在一些实施例中，涉及一种分离的抗GM-CSFRα抗体，包括：(i)V

在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗GM-CSFRα抗体，所述分离的抗GM-CSFRα抗体包括氨基酸残基：(i)V

在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗GM-CSFRα抗体，所述分离的抗GM-CSFRα抗体包括：V

在一些实施例中，涉及一种分离的抗GM-CSFRα抗体，其与上述任一种分离的抗GM-CSFRα抗体竞争性地结合GM-CSFRα。在一些实施例中，涉及一种分离的抗GM-CSFRα抗体，其与上述任一种分离的抗GM-CSFRα抗体特异性地结合相同的表位。

在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗GM-CSFRα抗体，所述分离的抗GM-CSFRα抗体包含Fc片段。在一些实施例中，所述分离的抗GM-CSFRα抗体是全长的IgG抗体。在一些实施例中，所述分离的抗GM-CSFRα抗体是全长的IgG1或IgG4抗体。在一些实施例中，所述分离的抗GM-CSFRα抗体是嵌合的、人源或人源化的。在一些实施例中，所述分离的抗GM-CSFRα抗体是抗原结合片段，其选自由Fab、Fab’、F(ab)’2、Fab’-SH、单链抗体(scFv)、Fv片段、dAb、Fd、纳米抗体、双链抗体和线性抗体组成的组。

在一些实施例中，涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码如上所述任一种抗GM-CSFRα抗体。在一些实施例中，涉及一种载体，所述载体包含如上所述任一种核酸分子。在一些实施例中，涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述任一种抗GM-CSFRα抗体、如上所述任一种核酸分子或如上所述任一种载体。在一些实施例中，涉及一种制备抗GM-CSFRα抗体的方法，包括：a)培养上述任一种有效表达抗GM-CSFRα抗体的宿主细胞；并且b)从所述宿主细胞中获得所表达的抗GM-CSFRα抗体。

在一些实施例中，涉及一种治疗所需个体疾病或病症的方法，包括向所述个体施用有效量的如上所述的任一种抗GM-CSFRα抗体。在一些实施例中，所述疾病或病症为炎性、呼吸或自身免疫性疾病或病症。在一些实施例中，所述疾病或病症选自由类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、过敏反应、多发性硬化、骨髓性白血病和动脉粥样硬化组成的组。

同时还涉及包含如上所述的任一种抗GM-CSFRα抗体的药物组合物、试剂盒以及生产制品。

附图说明

图1A-1C所示为通过ELISA分析的示例性抗GM-CSFRα抗体与人GM-CSFRα的结合亲和力。图1A所示为T119、E9、E16、E27、E29、E30、E35、E36、E54和E34与人GM-CSFRα的结合曲线。图1B所示为T119、E108、E105、E113、E87、E85、E39、F40、EII55、E200a和EII81与人GM-CSFRα的结合曲线。图1C所示为T119、E61、E83、E88、E90、E84、E172、E164、E1和E31与人GM-CSFRα的结合曲线。

图2所示为通过ELISA分析的E35、E200a、T119、E87和E108与食蟹猴GM-CSFRα的结合亲和力。

图3所示为E35、E87和E108分别与IL3RA、IL5RA、GM-CSFR以及GM-CSFRα之间的结合亲和力对比。

图4所示为通过FACS分析，E35-IgG4与表达GM-CSFRα的WIL2S细胞的结合亲和力以及与不表达GM-CSFRα的对照WIL2S细胞的结合亲和力之间的对比。

图5A-5D所示为竞争性结合实验的结果，采用竞争性ELISA测定先导抗体T119以及先导优化抗体阻断GM-CSF与GM-CSFRα结合的能力。图5A所示为T119、E01、E09、E194、E27、E29、E34、E35、E40和E30的竞争性结合实验的结果。图5B所示为T119、E83、E87、EII81、E85、E54、EII55、E31、E105和E84的竞争性结合实验的结果。图5C所示为T119、E164、E172、E108、E16、E36、E61、E88和E39的竞争性结合实验的结果。图5D所示为T119、E90、EII33、E200a、E94、E113和EII52的竞争性结合实验的结果。

图6A和6B所示为通过UNcle分析的抗GM-CSFRα抗体Mab-IgG1、T119-IgG1、E35-IgG1和E35b-IgG1的熔解温度曲线图以及聚集温度曲线图。图6A所示为抗体的熔解温度曲线图。图6B所示为抗体的聚集温度曲线图。

图7所示为先导抗体T119以及先导优化抗体的TF-1细胞增殖实验结果。

图8所示为E35、E108和E87b抗体的人粒细胞变形实验结果。

图9所示为E35抗体的食蟹猴粒细胞变形实验结果。

图10所示为E35、E108和E87b抗体的粒细胞存活实验结果。

图11所示为E35、E87b与对照抗体Mab相比的CD11b表达实验的结果。

图12A和12B所示为E35、E87b与Mab相比的TNFα释放实验结果。图12A所示为通过Human Macrophage/Microglia Panel测量的E35、E87b与Mab相比的的TNFα释放实验结果。图12B所示为通过ELISA测量的E35、E87b与Mab相比的TNFα释放实验结果。

图13所示为E35、E87b与Mab相比的IL-1β释放实验结果。

图14A和14B所示为通过ELISA测量的Mab和E35在大鼠体内药物代谢动力学分析结果。图14A所示为分别静脉注射2mg/kg Mab或E35的抗体血清浓度。图14B所示为分别静脉注射20mg/kg Mab或E35的药物代谢动力学结果。

图15所示为通过ELISA测量的Mab和E35在食蟹猴体内药物代谢动力学分析结果。

图16A-16D所示为在给食蟹猴施用Mab-IgG4或E35-IgG4后的体内粒细胞变形分析的FACS图。图16A所示为抗体施用前粒细胞的FACS图。图16B所示为抗体施用后14天粒细胞变形分析的FACS图。图16C所示为抗体施用后21天粒细胞变形分析的FACS图。图16D所示为从抗体施用前至抗体施用后21天的体内粒细胞变形趋势分析的结果。

图17A-17G所示为E35-IgG4对GM-CSF诱导炎性细胞增殖的抑制作用的结果。图17A所示为E35-IgG4对GM-CSF诱导白细胞增殖的抑制作用的结果。图17B所示为E35-IgG4对GM-CSF诱导中性粒细胞增殖的抑制作用的结果。图17C所示为E35-IgG4对GM-CSF诱导淋巴细胞增殖的抑制作用的结果。图17D所示为E35-IgG4对GM-CSF诱导嗜碱性粒细胞增殖的抑制作用的结果。图17E所示为E35-IgG4对GM-CSF诱导嗜酸性粒细胞增殖的抑制作用的结果。图17F所示为E35-IgG4对GM-CSF诱导单核细胞细胞增殖的抑制作用的结果。图17G所示为E35-IgG4对GM-CSF诱导红细胞增殖的抑制作用的结果。

图18A-18C所示为通过ELISA测量的E35-IgG4、E87b-IgG4和T119-IgG4与野生型GMRαh以及包含示例性氨基酸残基突变的GMRαh的结合亲和力。图18A所示为E35-IgG4与野生型GMRαh以及突变的GMRαh的结合亲和力。图18B所示为E87b-IgG4与野生型GMRαh以及突变的GMRαh的结合亲和力。图18C所示为T119-IgG4与野生型GMRαh以及突变的GMRαh的结合亲和力。

图19A-19B所示为抗GM-CSFRα抗体可变区序列的序列比对图，其中已标示互补决定区。图19A所示为重链可变域序列的序列比对图。图19B所示为轻链可变域序列的序列比对图。

图20所示为GM-CSFRα中氨基酸残基16-296的编号。

本发明的详细描述

本发明一方面涉及抗GM-CSFRα抗体分子。通过天然scFv噬菌体库筛选、亲和力成熟以及适当设计的生物化学及生物学实验的组合，我们已经鉴定出能够结合人GM-CSFRα并抑制人GM-CSF对其受体作用的高效抗体分子。本文给出的结果表明，与已知抗GM-CSFRα抗体Mavrilimumab相比，我们的抗体结合GM-CSFRα的不同区域或表位，并且令人惊讶地是，在各种生物学实验中证明了我们的抗体甚至比Mavrilimumab更有效。

本发明所涉及的抗GM-CSFRα抗体包括，例如，全长抗GM-CSFRα抗体、抗GM-CSFRα单链抗体(scFvs)、抗GM-CSFRαFc融合蛋白、多特异性(如双特异性)抗GM-CSFRα抗体、抗GM-CSFRα免疫轭合物以及诸如此类的。

一方面，涉及能够特异性地与人GM-CSFRα上的表位结合的抗GM-CSFRα抗体，该表位包含人GM-CSFRα的氨基酸残基Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283和Ile284。

另一方面，本发明涉及抗GM-CSFRα抗体，其中抗GM-CSFRα抗体包括重链可变域(V

同时还涉及编码抗GM-CSFRα抗体的核酸，包含抗GM-CSFRα抗体的组合物，以及制备和使用抗GM-CSFRα抗体的方法。

定义

如本文所述，“处理”或“治疗”是一种获得有益的或期望的结果的方法，包括临床结果。鉴于本申请的目的，所述有益的或期望的临床结果，包括但不限于以下一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状，减轻疾病程度，稳定疾病(例如，预防或延迟疾病恶化)，预防或延迟疾病恶化(例如，转移)，预防或延迟疾病复发，延迟或减缓疾病进展，改善疾病状态，缓解疾病(部分或全部)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病进展，改善或提高生存质量，增加体重，和/或延长生存期。同时，“治疗”还包括疾病病理结果的减少(例如，对癌症而言，肿瘤体积)。本申请的方法考虑了这些治疗的任何一个或多个方面。

术语“抗体”包括全长抗体及其抗原结合片段。全长抗体包括两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原的结合。两条链中的可变区通常包括3个高变的环，被称为互补决定区(CDRs)(轻链(LC)CDRs包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重链(HC)CDRs包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文所披露的抗体或抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat，Chothia或Al-Lazikani惯例来定义或识别(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)。重链或轻链的3个CDR区插入到被称为框架区(FRs)的侧翼区段之间，所述框架区比CDR区具有更高的保守性，并形成支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区并不参与抗原结合，但展示出多种效应功能。抗体是基于它们重链恒定区的氨基酸序列进行分类的。抗体的五种主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征在于分别具有α、δ、ε、γ和μ型重链。几种主要的抗体类别被分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链n)或IgA2(α2重链)。

如本文所述，术语“抗原结合片段”是指一种抗体片段，包括，例如，双链抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)

如本文所述，术语“表位”是指抗体或抗体部分结合的抗原上特定的原子或氨基酸组。如果两种抗体或抗体部分表现出与某抗原竞争性结合，则它们可能结合抗原上相同表位。

如本文所述，当第一抗体在等摩尔浓度下抑制第二抗体与GM-CSFRα靶标结合至少50％(例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)时，第一抗体与第二抗体“竞争”结合GM-CSFRα靶标，反之亦然。PCT出版物WO 03/48731描述了基于交叉竞争的高通量抗体“表位归类”方法。

如本文所述，术语“特异性地结合”、“特异性地识别”或“对..来说是特异性的”是指可测量的和可再现的相互作用，例如抗体与靶标的结合可以确定在异质分子群，包括生物分子中存在该靶标。例如，抗体能够特异性地识别某靶标(可以是表位)是指，与其它靶标结合相比，该抗体与该靶标的结合具有更高的亲和力，亲合力，更容易和/或更持久。在一些实施例中，特异性地识别抗原的抗体与抗原的一个或多个抗原决定簇反应，其结合亲和力是其与其它靶标结合亲和力的至少10倍。

如本文所述，一种“分离的”抗GM-CSFRα抗体是指一种抗GM-CSFRα抗体，其(1)与天然存在的蛋白无关，(2)不含相同来源的其他蛋白，(3)由不同种属的细胞所表达，或(4)自然界中不存在。

如本文所述，术语“分离的核酸”，是指基因组、cDNA或合成来源的核酸或是其某些组合。根据其来源，所述“分离的核酸”(1)与自然界中发现的“分离的核酸”中的全部或部分多核苷酸无关，(2)可与其自然状态下不与之相连的多核苷酸可操作性地连接，或(3)在自然界中不作为较长序列的一部分而存在。

如本文所述，术语“CDR”或“互补决定区”是指重链和轻链多肽的可变域内发现的非连续抗原结合位点。在文献Kabat et al.，J.Biol.Chem.252：6609-6616(1977)；Kabatet al.，U.S.Dept.of Health and Human Services，“Sequences of proteins ofimmunological interest”(1991)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Al-Lazikani B.et al.，J.Mol.Biol.，273：927-948(1997)；MacCallum et al.，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)；Abhinandan and Martin，Mol.Immunol.，45：3832-3839(2008)；Lefranc M.P.et al.，Dev.Comp.Immunol.，27：55-77(2003)；和Honegger and Plückthun，J.Mol.Biol.，309：657-670(2001)中已经描述这些特殊的区域，其中当彼此之间相对比较时，这些定义包括氨基酸残基的重合或子集。然而，本申请中提到的抗体或嫁接抗体或其变体的CDR的每一种定义方式，是指均在本文所定义和使用的术语范围之内。包含由上述引用的参考文献所定义的CDR的氨基酸残基列在表1中作比较。CDR预测的算法和结合界面在本领域是已知的，包括，例如Abhinandan and Martin，Mol.Immunol.，45：3832-3839(2008)；Ehrenmann F.et al.，Nucleic Acids Res.，38：D301-D307(2010)；和Adolf-Bryfogle J.et al.，Nucleic Acids Res.，43：D432-D438(2015)中均有描述。本段中所引用的参考文献的内容以其整体引用并入本文中，以用于本申请和可能包含在本文中的一个或多个权利要求中。

表1：CDR定义

术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分与来自特定种属或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列一致或具有同源性，而这个(些)链的剩余部分与来自另一种属或属于其它抗体种类或亚类的抗体中的相应序列一致或具有同源性的抗体，以及此类抗体的片段，只要其具有本申请中的生物学活性(见U.S.Patent No.4,816,567；andMorrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。

“Fv”是包含完整抗原识别及结合位点的最小抗体片段。该片段是由一个重链可变域和一个轻链可变域以紧密非共价连接而成的二聚体。通过这两个域的折叠衍生出6个高变环(轻链和重链每个各3个环)，所述高变环贡献抗原结合的氨基酸残基，并且赋予抗体与抗原结合的特异性。然而，即使单个可变域(或Fv片段的一半，其仅包含3个CDRs，对抗原有来说是特异性的)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整的结合位点。

“单链Fv”，也可简写成“sFv”或“scFv”，是包含被连接成单一多肽链的V

术语“双链抗体(diabodies)”是指，在V

非人源(如啮齿类)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其包括最少的来自非人源抗体的序列。大多数情况下，人源化抗体是人源免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的高变区(HVR)残基被来自非人源种属例如小鼠、大鼠、兔或非人类哺乳动物的且具有理想的抗体特异性，亲和力和性能的高变区残基所取代(供体抗体)。在某些情况下，人源免疫球蛋白框架区中的残基被相应的非人源残基所取代。另外，人源化抗体可以包括在受体抗体或供体抗体中均未发现的残基。这些修饰能够进一步改善抗体的性能。通常，人源化抗体会包含基本上所有，至少一个，通常两个可变域，其中所有或基本上所有的高变环均与非人源免疫球蛋白的高变环相对应，以及所有或基本上所有的框架区均是人源免疫球蛋白序列。人源抗体任选地也还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。具体细节可以参考Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992).

本文所鉴定的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”被定义为候选序列与待比较多肽序列中相同氨基酸残基所占的百分比，而在序列比对后，考虑将氨基酸残基的任何保守替换作序列同一性的一部分。可以通过本领域技术范围内的多种比对方式来确定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)、或MUSCLE软件等可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适的参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，氨基酸序列同一性百分比数值是使用序列比对电脑程序MUSCLE(Edgar，R.C.，Nucleic Acids Research 32(5)：1792-1797，2004；Edgar，R.C.，BMCBioinformatics 5(1)：113，2004)生成的。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在一些实施例中，本申请所述的FcR是结合IgG抗体(一种γ受体)的FcR，并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要在细胞质结构域有所不同。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(见M.in

术语“FcRn”指新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn与主要组织相容性复合体(MHC)结构上相似，由α链非共价结合到β2微球蛋白上组成。新生儿Fc受体FcRn的多种功能在Ghetie andWard(2000)Annu.Rev.Immunol.18，739-766.中进行了描述。FcRn在免疫球蛋白IgGs从母体向新生儿的被动转运和调控血清IgG水平中起到重要作用。FcRn作为一种救助受体，可以在细胞内和细胞间以完整的形式结合，并运输胞吞化的IgG，并且从默认的降解途径中将它们解救出来。

人IgG Fc区的“CH1结构域”通常是指从118位氨基酸延伸到215位氨基酸(EU编号系统)。

“铰链区”通常被定义为从人IgG1的216位Glu延伸到230位Pro(Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985))。通过将形成重链间二硫键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于与IgG1相同位置后，可以使得其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。

人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从231位氨基酸延伸到340位氨基酸。CH2结构域的独特之处在于，它没有与另一个区域紧密配对。而是两条N端连接的支链糖链插入到了完整形式天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，糖可以提供域与域间配对的取代物，有助于保持CH2结构域稳定。Burton，Molec Immunol.22：161-206(1985)。

“CH3”结构域包括在Fc区内从C末端残基延伸到CH2结构域(从341位氨基酸到抗体序列的C末端，通常为IgG的第446或447位氨基酸残基)。

“功能性Fc片段”具有天然Fc区序列所具有的“效应功能”。例如典型的“效应功能”包括C1q结合；补体依赖的细胞毒作用(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(如B细胞受体；BCR)等。这类效应功能通常需要Fc区与结合结构域(如抗体可变区)结合，并且可以使用本领域公知的多种实验方法进行评估。

具有“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性的IgG Fc变体的抗体，与亲本多肽或包含天然Fc序列的多肽相比，其FcR结合活性和/或ADCC活性增强或减弱。表现出与FcR“结合增强”的Fc变体与亲本多肽或包含天然IgG Fc序列的多肽相比，其至少与一种FcR具有更高的亲和力(例如更低的表观K

“抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用”或“ADCC”是一种细胞毒性形式，指分泌型的Ig与存在于某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤细胞(NK)、中性粒细胞、和巨噬细胞)上的Fc受体(FcRs)结合，使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后使用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞并且是这种杀伤所必需的。介导ADCC的主要细胞类型中，NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)第464页的Table 3中总结了在造血细胞上FcR的表达。评估目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC实验，在美国专利No.5,500,362或5,821,337种进行描述。适用于此类实验的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤性细胞(NK)。可选地，或者此外，目标分子的ADCC活性也可以在体内进行评估，例如在如Clynes et al.PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公开的动物模型中进行了描述。

包含Fc区变体的多肽与包含野生型IgG Fc多肽或亲本多肽相比，在人体效应细胞存在下表现出“增强的ADCC活性”或能够更有效的介导ADCC效应，所述包含Fc区变体的多肽在实验时与包含野生型IgG Fc多肽(或亲本多肽)数量上基本相同时，无论在体外或体内均能更有效的介导ADCC。通常采用本领域已知的任何体外ADCC实验方法来鉴定此类变体，例如用于鉴定ADCC活性的实验或方法，例如在动物模型中等。在一些实施例中，此类变体与野生型Fc(或亲代多肽)相比，能更有效地介导ADCC，提高约5到100倍，例如约25到约50倍。

“补体依赖的细胞毒作用”或“CDC”是指在补体存在的情况下裂解靶细胞。经典的补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)与结合同源抗原的抗体(具有适宜结构的亚类)相结合而启动的。为了评估补体激活，可以进行CDC实验，如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所描述的。在美国专利No.6,194,551B1和WO99/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列并增加或降低的C1q结合能力的多肽变体。这些专利出版物的内容通过引用明确地并入本文中。另见Idusogie et al.J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

除非另有说明，一种“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括其简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，例如编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中包含内含子。

术语“可操作性地连接”是指调控序列与异源核苷酸序列之间的功能性连接，从而使后者表达。例如，当第一个核苷酸序列与第二个核苷酸序列处于功能性关系时，第一个核苷酸序列与第二个核苷酸序列为可操作性地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，该启动子与编码序列为可操作性地连接。通常，可操作性连接的DNA序列是连续的，并且在必要时，可以在同一个阅读框中连接两个蛋白质编码区。

“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。如果两个比较序列的同一位置为相同的碱基或氨基酸单体亚基时，例如两个DNA分子的同一位置均为腺嘌呤，则这两个DNA分子在该位置是同源的。两个序列间的同源百分比是指两个序列中共有的匹配或同源位置的数量与位置总数之比再乘以100所得函数。例如，两个序列中如果10个位置中有6个位置是相匹配或同源的，则这两个序列的同源性为60％。举例来说，DNA序列ATFGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常来说，在比对两个序列时，以得到最大同源性为目的来进行对比。

本文所公开的抗GM-CSFRα抗体或组合物的“有效量”是指足以实现特定目的的量。“有效量”可以凭经验和通过已知的与所述目的相关的方法确定。

术语“治疗有效量”是指本文所公开的抗GM-CSFRα抗体或其组合物能够有效治疗个体的疾病或者症状的用量。例如在癌症的情况中，抗GM-CSFRα抗体或其组合物的治疗有效量是指能够减少癌细胞数量；减小肿瘤的大小或重量；抑制(即在一定程度上减缓或优选停止)肿瘤细胞对周边器官的浸润；抑制(即在一定程度上减缓或优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤的生长，和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。本文所公开的抗GM-CSFRα抗体或其组合物在某种程度上能够阻止和/或杀死现有的肿瘤细胞，它可以是细胞抑制性的或细胞毒性的。在一些实施例中，治疗有效量是指能够延长患者生存期的用量。在一些实施例中，治疗有效量是指能够改善患者无进展生存期的用量。

如本文所用的，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”是指无生物学活性或者其它无不期望性质的材料，例如该材料能够加入到给予患者的药物组合物中，而不会引起显著的不良生物反应，或者，不与组合物中包含的任何其它组分以有害的方式相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学或制造检测的所需标准和/或包含在美国食品和药品管理局编制的非活性成分指南中。

本文中描述的申请的实施例应理解为包含“由……组成”和/或“基本上由……组成”的实施例。

本文中提及“约”为一个数值或参数，包含(和描述)针对该值或参数本身的变体。例如，涉及“约X”的描述，包括“X”的描述。

如本文所用的，提及“不是”一个数值或参数，通常表示并描述“除了”某一数值或参数之外。例如，该方法不能用于治疗X型癌症，意味着该方法通常用于治疗除X型癌症之外的其他类型。

除非上下文另有明确说明，本文和所述权利要求中所采用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数对象。

抗GM-CSFRα抗体

一方面，本申请涉及特异性结合GM-CSFRα的抗GM-CSFRα抗体。所述抗GM-CSFRα抗体包括，但不限于，人源化抗体，嵌合抗体，小鼠抗体，人抗体，以及本文所述的包含重链和/或轻链CDRs的抗体分子。一方面，本申请涉及与GM-CSFRα结合的分离的抗体。预期的抗GM-CSFRα抗体包括，例如，全长抗GM-CSFRα抗体(如全长IgG1或IgG4)，抗GM-CSFRα单链抗体，抗GM-CSFRαFc融合蛋白，多特异性(如双特异性)抗GM-CSFRα抗体，抗GM-CSFRα免疫轭合物，以及诸如此类的。在一些实施例中，抗GM-CSFRα抗体是全长抗体(如全长IgG1或IgG4)或其抗原结合片段，其特异性结合GM-CSFRα。在一些实施例中，抗GM-CSFRα抗体是Fab、Fab’、F(ab)’2、Fab’-SH、单链抗体(scFv)、Fv片段、dAb、Fd、纳米抗体、双链抗体或线性抗体。在一些实施例中，特异性结合GM-CSFRα的抗体是指抗体与GM-CSFRα结合的亲和力至少是与非靶标结合的亲和力的10倍以上(包括例如10、10

尽管本文广泛地讨论了包含人序列的抗GM-CSFRα抗体(例如，包含人CDR序列的人重链和轻链可变域)，但同时也考虑了非人抗GM-CSFRα抗体。在一些实施例中，非人抗GM-CSFRα抗体包括本文所述的抗GM-CSFRα抗体的人CDR序列和非人框架区序列，在一些实施例中，非人框架区序列包括任何可用于使用如本文所述的一种或多种人CDR序列产生形成重链和/或轻链可变域的序列，包括例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔子、猪、牛(例如，牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类(例如，小猿，猕猴)等。在一些实施例中，非人抗GM-CSFRα抗体包括将一种或多种本文所述的人CDR序列移植到非人框架区中(例如，鼠或鸡的框架区序列)所产生的抗GM-CSFRα抗体。

示例性人GM-CSFRα的完整氨基酸序列包含SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列组成。

示例性人GM-CSFRα胞外区氨基酸序列包含SEQ ID NO：149所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：149所示的氨基酸序列组成。

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性识别人GM-CSFRα内的表位。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体与除人之外其它物种的GM-CSFRα发生交叉反应。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体对人GM-CSFRα是完全特异性的，并且不表现出与其它非人物种或类型的交叉反应性。

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合人GM-CSFRα内的线性表位。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合GM-CSFRα内的非线性表位。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合人GM-CSFRα上的表位，所述表位包含选自由人GM-CSFRα的Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283和Ile284组成的组中的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸残基。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合人GM-CSFRα上的表位，所述表位包含人GM-CSFRα的Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283和Ile284。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合人GM-CSFRα上的表位，所述表位包含由Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283、Ile284、Val51、Thr63和Ile196组成的组中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸残基。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合人GM-CSFRα上的表位，所述表位包含氨基酸残基Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283、Ile284、Val51、Thr63和Ile196。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合人GM-CSFRα上的表位，所述表位包含选自由Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283、Ile284、Leu191和Ile196组成的组中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸残基。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体能够特异性地与人GM-CSFRα的表位结合，所述表位包含人GM-CSFRαVal50，Glu59，Lys194，Lys195，Arg283，Ile284，Leu191和Ile196位氨基酸残基。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合人GM-CSFRα上的表位，所述表位包含由Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283、Ile284、Arg49、Val51、Asn57和Ser61组成的组中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸残基。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合人GM-CSFRα上的表位，所述表位包含氨基酸残基Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283、Ile284、Arg49、Val51、Asn57和Ser61。

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体与GM-CSFRα蛋白(或其片段)的至少一种等位基因变体交叉反应。在一些实施例中，等位基因变体与天然存在的GM-CSFRα蛋白(或其片段)相比，具有至多30个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30中的任何一个)氨基酸取代(例如保守取代)。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体不与GM-CSFRα蛋白(或其片段)的任何等位基因变体发生交叉反应。

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体与GM-CSFRα蛋白的至少一种种间变体发生交叉反应。在一些实施例中，例如，GM-CSFRα蛋白(或其片段)是人GM-CSFRα，并且GM-CSFRα蛋白(或其片段)的种间变体是食蟹猴中的变体。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体不与GM-CSFRα蛋白的任何种间变体发生交叉反应。

在一些实施例中，如本文所述的任一抗GM-CSFRα抗体，所述抗GM-CSFRα抗体包括抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包括IgG1型重链恒定区。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包括IgG2型重链恒定区。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包括IgG3型重链恒定区。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包括IgG4型重链恒定区。在一些实施例中，所述重链恒定区包含(包括由...组成或基本上由...组成)氨基酸序列SEQ ID NO：145。在一些实施例中，所述重链恒定区包含(包括由...组成或基本上由...组成)氨基酸序列SEQ ID NO：146。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包含λ轻链恒定区。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包含κ轻链恒定区。在一些实施例中，所述轻链恒定区包含(包括由...组成或基本上由...组成)氨基酸序列SEQ ID NO：147。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包括抗体重链可变域和抗体轻链可变域。

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体，包括V

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包括V

在一些实施例中，所述抗GM-CSFR

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包括V

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包括述V

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包括V

在一些实施例中，功能性表位可通过组合丙氨酸扫描法来解析。在此过程中，组合丙氨酸扫描技术可用于鉴定GM-CSFRα蛋白中与抗GM-CSFRα抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施例中，该表位是构象的，同时可以采用与GM-CSFRα蛋白结合的抗GM-CSFRα抗体的晶体结构来鉴定表位。

在一些实施例中，本申请涉及与本文所述的任一种抗GM-CSFRα抗体竞争性地结合GM-CSFRα的抗体。在一些实施例中，涉及能够与本文所述的任一种抗GM-CSFRα抗体竞争性结合GM-CSFRα上的表位的抗体。在一些实施例中，涉及抗GM-CSFRα抗体，其与包含V

在一些实施例中，竞争实验可以用于鉴定与本文所述的抗GM-CSFRα抗体竞争性结合GM-CSFRα的单克隆抗体。竞争实验可以通过识别相同的或空间上重叠的表位或者通过一个抗体竞争性抑制另一抗体与抗原结合来确定两个抗体是否结合相同的表位。在某些实施例中，这种竞争性抗体与本文所述的抗体结合相同的表位。一些示例性的竞争实验包括，但不限于如Harlow and Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)中所提到的常规实验。用于解析抗体结合的表位的详细示例性方法如Morris(1996)″Epitope Mapping Protocols，″in Methods inMolecular Biology vol.66(Humana Press，Totowa，N.J.)中所述。在一些实施例中，如果每种抗体阻断另一种抗体结合的50％或更多，则称其结合相同的表位。在一些实施例中，与本文所述的抗GM-CSFRα抗体竞争的抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人源抗体。

示例性抗GM-CSFRα抗体序列如表2、表3和表18以及图19A、图19B所示。本领域技术人员将认识到有多种已知算法(kabat定义方式)来预测CDR的位置以及界定抗体轻、重链可变区。包含如本文所述抗体的CDRs、V

表2示例性抗GM-CSFRα抗体CDR序列

表3示例性序列

GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，也称为集落刺激因子2(CSF2)，由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞或成纤维细胞产生。GM-CSF是I型促炎细胞因子，其增强包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞在内的广泛的造血细胞类型的生存存活、增殖和/或分化，例如，促进骨髓细胞分化、单核细胞来源的树突细胞的募集和分化、中性粒细胞的启动和激活等。同时，其也参与促进血管的生成以及肿瘤细胞的生长。临床上，通常采用GM-CSF于促进辐射治疗后骨髓的恢复。

GM-CSF是存在于炎症部位的第一批促炎细胞因子之一，其对炎症过程的调节至关重要。例如，能够促进造血细胞类型分化为中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞以及巨噬细胞(Nature Reviews Rheumatology 2015；7(11)：415-430)。通过激活血管内皮细胞，GM-CSF促进单核细胞和巨噬细胞的募集。GM-CSF还促进单核细胞和巨噬细胞的增殖，例如类风湿性关节炎患者滑膜关节巨噬细胞；同时还促进巨噬细胞释放细胞因子，包括GM-CSF以及其它炎性细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1和趋化因子。GM-CSF还能进一步参与调节炎症组织中抗原呈递细胞，并促进巨噬细胞和树突状细胞产生IL-23，与IL-6和IL-1共同调节T细胞的分化；内源性的GM-CSF通过依赖疼痛信号和促进对疼痛的敏感性来调节感觉神经元。在GM-CSF基因敲除小鼠中，髓系细胞的发育并未受到影响，表明该因子在促进髓系细胞发育中的作用是有限的(Stanley et al.PNAS 1994；91(12)：5592-5594)。然而，由于缺少适当的炎症反应，GM-CSF基因敲除小鼠更容易被感染(Trapnell et al.N Engl J Med 2003；349：2527-2539；Dranoff et al.Science 1994；264：713-716)。GM-CSF的缺失降低了类风湿关节炎、脑脊髓炎和自免性心肌炎等的发病率，表明GM-CSF主要参与了炎性过程(Lawloret al.Arthritis&Rheumatism 2005；(52)3749-3754；McQualter et al.Journal ofExperimental Medicine 2001；194(7)：873-882；Sonderegger et al.Journal ofExperimental Medicine 2008；205(10)：2281-2294)。

GM-CSFR：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体

GM-CSF受体是造血受体超家族成员之一。其为异二聚体，由一个α亚单位和一个β亚单位组成。其中α亚基是GM-CSF高度特异性的，而β亚基与其他细胞因子受体如IL-3和IL-5共享。β受体亚单位在组织中的分布更为广泛反映了这点。α亚单位，即GM-CSFRα，主要表达于骨髓细胞和非造血细胞上，例如中性粒细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞，树突细胞，内皮细胞和呼吸道上皮细胞等。全长的人GM-CSFRα为400个氨基酸的I型膜糖蛋白，其属于I型细胞因子受体家族，由22个氨基酸的信号肽(1-22位)，298个氨基酸的胞外域(23-320位)、跨膜域(321-345位)以及55个氨基酸的短的胞内域组成。信号肽被切掉，产生378个氨基酸的GM-CSFRα成熟蛋白形式。可以获得人和鼠GM-CSFRα的cDNA克隆，且在蛋白水平上，其受体亚单位具有36％的同源性。GM-CSF能够以相对低的亲和力(Kd 1-5nM)单独结合α亚单位，但是完全不与β亚单位单独结合。然而，当α亚单位和β亚单位同时存在时，则会形成高亲和力的配体-受体复合物(Kd≈100pM)。GM-CSF信号传导通过其与GM-CSFRα链的初始结合发生，随后与较大的亚单位交联共同的β链，产生高亲和力相互作用，其磷酸化JAK-STAT通路。GM-CSFR与GM-CSF的结合在Haman et al.Journal of Biological Chemistry 1999；274(48)中进行了综述。这种相互作用还能通过酪氨酸磷酸化和激活MAPK通路传递信号。病理上，GM-CSF已经被证明在恶化炎症、呼吸道疾病和自身免疫疾病中发挥作用。因此，GM-CSF与GM-CSFRα结合的中和成为治疗由GM-CSFR介导的疾病和病症的一种治疗方法。

全长抗GM-CSFRα抗体

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体是全长抗GM-CSFRα抗体。在一些实施例中，所述全长抗GM-CSFRα抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施例中，所述全长抗GM-CSFRα抗体包含IgG恒定区域，例如任一IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的恒定区域。在一些实施例中，所述全长抗GM-CSFRα抗体包含λ轻链恒定区。在一些实施例中，所述全长抗GM-CSFRα抗体包含κ轻链恒定区。在一些实施例中，所述全长抗GM-CSFRα抗体是全长的人源抗GM-CSFRα抗体。在一些实施例中，所述全长抗GM-CSFRα抗体包含小鼠免疫球蛋白Fc序列。在一些实施例中，所述全长抗GM-CSFRα抗体包含已经改变的或以其他方式改变的Fc序列，使得其具有增强的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)的效应功能。

因此，例如，在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，所述抗GM-CSFRα抗体与GM-CSFRα特异性结合。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG2恒定区，所述抗GM-CSFRα抗体与GM-CSFRα特异性结合。在一些实施例中，所述IgG2是人IgG2。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG3恒定区，所述抗GM-CSFRα抗体与GM-CSFRα特异性结合。在一些实施例中，所述IgG3是人IgG3。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，所述抗GM-CSFRα抗体与GM-CSFRα特异性结合。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个HC-CDR1，其包含SEQ IDNOs：1-4任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，一个HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs：5-16任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，和一个HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs：17-50任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：51或者包含至多3个(例如约1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，一个LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：52或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，和一个LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs：53-75任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG2恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个HC-CDR1，其包含SEQ ID NOs：1-4任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，一个HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs：5-16任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，和一个HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs：17-50任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：51或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，一个LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：52或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，一个LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs：53-75任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，所述IgG2是人IgG2。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG3恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个HC-CDR1，其包含SEQ ID NOs：1-4任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，一个HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs：5-16任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，和一个HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs：17-50任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：51或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，一个LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：52或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，和一个LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs：53-75任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，所述IgG3是人IgG3。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含一个HC-CDR1，其包含SEQ ID NOs：1-4任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如约1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，一个HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs：5-16任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，和一个HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs：17-50任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：51或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，一个LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：52或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体，和一个LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs：53-75任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含SEQ ID NOs：1-4任一氨基酸序列的HC-CDR1，一个包含SEQ ID NOs：5-16任一氨基酸序列的HC-CDR2，和一个包含SEQ ID NOs：17-50任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如约1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQID NO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含SEQ IDNOs：53-75任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如约1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含SEQ ID NOs：1-4任一氨基酸序列的HC-CDR1，一个包含SEQ ID NOs：5-16任一氨基酸序列的HC-CDR2，和一个包含SEQ ID NOs：17-50任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，其所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQID NO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含SEQ IDNOs：53-75任一氨基酸序列或者包含至多3个(例如1、2或3中的任一个)氨基酸取代的变体的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含SEQ ID NOs：1-4任一氨基酸序列的HC-CDR1，一个包含SEQ ID NOs：5-16任一氨基酸序列的HC-CDR2，和一个包含SEQ ID NOs：17-50任一氨基酸序列的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：52的LC-CDR2，和一个包含SEQ ID NOs：53-75任一氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含SEQ ID NOs：1-4任一氨基酸序列的HC-CDR1，一个包含SEQ ID NOs：5-16任一氨基酸序列的HC-CDR2，和一个包含SEQ ID NOs：17-50任一氨基酸序列的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：51的LC-CDR1一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含SEQ ID NOs：53-75任一氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：17的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：54的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：22的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，其中轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：56的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：23的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：57的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：27的HC-CDR3以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：57的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：35的HC-CDR3以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：53的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：37的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：57的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：39的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：54的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：35的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQID NO：57的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：50的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：57的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：17的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和包含氨基酸序列SEQ IDNO：54的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：22的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：56的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：23的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：57的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：27的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：57的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：35的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：53的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：37的HC-CDR3以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：57的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：39的HC-CDR3；以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：54的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：35的HC-CDR3以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：57的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中所述抗GM-CSFRα抗体包含：a)重链可变域，所述重链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的HC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的HC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：50的HC-CDR3以及b)轻链可变域，所述轻链可变域包含：一个包含氨基酸序列SEQ IDNO：51的LC-CDR1，一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的LC-CDR2，和一个包含氨基酸序列SEQ ID NO：57的LC-CDR3。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括重链可变域V

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG2恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括重链可变域V

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG3恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括重链可变域V

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括重链可变域V

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括包含SEQ ID NOs：80-121和246-287中的任一氨基酸序列的重链可变域，以及包含SEQ ID NOs：122-144、150-245和288-289中的任一氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括包含SEQ ID NOs：80-121和246-287中的任一氨基酸序列的重链可变域，以及包含SEQ ID NOs：122-144、150-245和288-289中的任一氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：80的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：123的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：85的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：125的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：86的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：126的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：91的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：126的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：99的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：122的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：101的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：126的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：103的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：123的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：99的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：126的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG1恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：121的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：126的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：80的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：123的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：85的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：125的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：86的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：126的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：91的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：126的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：99的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：122的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：101的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：126的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：103的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：123的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：99的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：126的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种全长抗GM-CSFRα抗体，其包含IgG4恒定区，其中抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：121的重链可变域，以及包含SEQ ID NO：126的轻链可变域。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO：147组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

结合亲和力

结合亲和力可以采用K

平衡解离常数(Kd)可以作为反应抗体部分与抗原亲和力的指标。例如，可以通过Scatchard方法使用标记了各种标记物的抗体，和Biacore仪器(由Amersham Biosciences制造)进行简单分析，根据用户手册或附带试剂盒，通过表面等离子体共振来分析生物分子间的相互作用。使用这些方法得到的Kd值，用单位M来表示。与靶标特异性结合的抗体可能具有，例如≤10

抗体的结合特异性可以通过本领域已知的方法进行实验测定。这些方法包括，但不限于Western blots、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore测试和肽扫描等。

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合GM-CSFα靶标，其K

在一些实施例中，抗GM-CSFRα抗体与非靶标之间结合的Kd值高于抗GM-CSFRα抗体与GM-CSFRα靶标的Kd值，并且本文中引用的一些实施例中，抗GM-CSFRα抗体与靶标(例如，GM-CSFRα)的结合亲和力高于GM-CSFRα抗体与非靶标的结合亲和力。一些实施例中，非靶标是指非GM-CSFRα抗原。在一些实施例中，抗GM-CSFRα抗体(针对GM-CSFRα)与非GM-CSFRα靶标结合的Kd值间至少相差10倍，例如10-100倍、100-1000倍、10

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体与非靶标结合的Kd值为10

在一些实施例中，当提及抗GM-CSFRα抗体以高结合亲和力特异性地识别GM-CSFRα靶标，并以低结合亲和力结合非靶标时，所述抗GM-CSFRα抗体与GM-CSFRα靶标结合的Kd值为10

在一些实施例中，当提及抗GM-CSFRα抗体特异性地识别GM-CSFRα时，将所述抗GM-CSFRα抗体的结合亲和力与对照抗GM-CSFRα抗体(例如Mavrilimumab)的结合亲和力进行比较。在一些实施例中，对照抗GM-CSFRα抗体与GM-CSFRα之间结合的Kd值是本申请所述的抗GM-CSFRα抗体与GM-CSFRα之间结合的Kd值的至少2倍，例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、10-100倍、100-1000倍、10

核酸

编码抗GM-CSFRα抗体的核酸分子也被考虑在内。在一些实施例中，涉及一种(或一组)编码全长抗GM-CSFRα抗体的核酸，包括本文所述的任一种全长抗GM-CSFRα抗体。在一些实施例中，本文所述的抗GM-CSFRα抗体的核酸(或一组核酸)还可以包括编码多肽标签的核酸序列(例如蛋白纯化标签，His-标签、HA标签)。

同时本文还考虑了包含抗GM-CSFRα抗体的分离的宿主细胞，编码抗GM-CSFRα抗体多肽组分的分离的核酸，或者包含编码本文所述的抗GM-CSFRα抗体多肽组分的核酸的载体。

本申请还包括这些核酸序列的变体。例如，变体包括至少在中等严格杂交条件下与编码本申请的抗GM-CSFRα抗体的核酸序列杂交的核苷酸序列。

本申请同时还涉及可将本申请中核酸序列插入到其中的载体。

简言之，将编码抗GM-CSFRα抗体的天然的或合成的核酸插入到合适的表达载体中，使得核酸可操作性的连接到5’和3’端调控元件，例如包括启动子(例如淋巴细胞特异性启动子)和3’非翻译区(UTR)，可表达抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)。所述载体可适用于真核宿主细胞中复制和整合。典型的克隆与表达载体包含转录和翻译终止子、起始序列和启动子来调控目标核酸序列的表达。

本申请所述的核酸也可以通过使用标准的基因递送方案，用于核酸免疫和基因治疗。核酸递送方法是本领域已知的。例如参见U.S.Pat.Nos.5,399,346、5,580,859、5,589,466，通过引用其全部内容并入本文。在一些实施例中，本申请还涉及基因治疗载体。

可以将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，所述载体包括，但不限于，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和柯斯质粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如Green and Sambrook(2013，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)，以及其它病毒学或分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括，但不限于，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包括一个在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点以及一个或多个选择标记物(参见例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和U.S.Pat.No.6,326,193)

已经开发了许多基于病毒的系统，使用其将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以应用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后分离重组病毒，在体内或体外递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。衍生自逆转录病毒的载体，例如慢病毒，是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定的整合以及在子代细胞中繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤的逆转录病毒例如小鼠白血病病毒具有额外的优势，因为它们可以转导非分裂细胞，例如肝细胞。同时，其还具有额外优势低免疫原性。

其它的启动子元件，例如，增强子，调控转录起始频率。通常它们位于起始位点上游30-110bp处，虽然最近发现很多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，所以当元件彼此之间位置互换或移动时仍保持启动子的功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔增加到50bp，活性才会开始下降。

一个例子中，合适启动子的是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是一个很强的组成型启动子序列，可以使任何与其可操作性连接的多核苷酸序列高水平表达。另一个例子中，合适启动子的是延伸生长因子1α(EF-1α)启动子。然而，也可以使用其它组成型启动子，包括但不限于，猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免病缺陷病毒长末端重复序列(HIV-LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，例如包括但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，不应将本申请局限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也是本申请考虑的部分。诱导型启动子的使用提供了一种能启动多核苷酸序列表达的分子开关，当需要这种表达时，其与多核苷酸序列可操作性连接，或者在不需要这种表达时，则关闭表达。诱导型启动子，包含但不局限于，金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

在一些实施例中，抗GM-CSFRα抗体的表达是可诱导的。在一些实施例中，编码抗GM-CSFRα抗体的核酸序列可操作的连接到诱导型启动子上，包括本文所述的任一诱导型启动子。

诱导型启动子

诱导型启动子的使用提供了一种能启动多核苷酸序列表达的分子开关，当需要这种表达时，其与多核苷酸序列可操作性连接，或在不需要这种表达时时，则关闭表达。真核细胞中适用的示例性诱导型启动子，包括但不限于，激素调节元件(例如，参见Mader，S.andWhite，J.H.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5603-5607)、合成配体调节元件(参见Spencer，D.M.et al(1993)Science 262：1019-1024)以及电离辐射调控元件(参见Manome，Y.et al.(1993)Biochemistry 32：10607-10613；Datta，R.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1014-10153)。其它适用于体内或体外哺乳动物系统的示例性诱导型启动子参见Gingrich et al.(1998)Annual Rev.Neurosci 21：377-405。在一些实施例中，表达抗GM-CSFRα抗体的诱导型启动子系统为Tet系统。在一些实施例中，表达抗GM-CSFRα抗体的诱导型启动子系统为大肠杆菌lac抑制系统。

本申请所采用的示例性诱导型启动子系统为Tet系统。该系统是基于Gossen等(1993)描述的Tet系统。在一个示例性实施例中，目标多核苷酸由包含一个或多个Tet操纵子(TetO)位点的启动子控制。在非激活状态，Tet阻遏物(TetR)与TetO位点结合并抑制启动子的转录。在激活状态，例如，在存在诱导剂如四环素(Tc)、无水四环素、多西环素(Dox)或其活性类似物的情况下，诱导剂会使TetR从TetO上释放，从而允许转录发生。多西环素是四环素抗生素家族中的一员，其化学名为1-二甲氨基-2，4a，5，7-五羟基-11-甲基-4，6-二氧基-1，4a，11，11a，12，12a-六氢四烯-3-甲酰胺。

在一个实施例中，TetR经密码子优化适用于在哺乳动物细胞中表达，例如小鼠或人类细胞。由于遗传密码的简并性，大多数氨基酸由不止一个密码子编码，从而允许给定核酸序列发生大量变化，而该核酸编码的氨基酸序列没有任何改变。然而，许多生物体在密码子使用方面存在差异，也称为“密码子偏爱”(即，对给定氨基酸使用特定密码子的偏爱)。密码子偏爱通常与特定密码子的主要tRNA种类的存在有关，反过又提高了mRNA翻译的效率。因此可以通过密码子优化来定制源自特定物种的编码序列(例如，原核生物)，以提高其在不同物种(例如，真核生物)中的表达。

Tet系统的其它具体变体，包括以下的“Tet-Off”和“Tet-On”系统。在Tet-off系统中，转录在Tc或Dox存在下是非激活的。在该系统中，由TetR与单纯疱疹病毒VP16强转录激活结构域融合组成的四环素调控的转录激活蛋白(tTA)，在四环素反应启动子元件(TRE)转录控制下调控靶核酸的表达。TRE元件由TetO序列串联与启动子(通常是来源于人巨细胞病毒即刻早期启动子的最小启动子序列)融合组成。在不存在Tc或Dox的情况下，tTA结合TRE并激活靶基因的转录。在存在Tc或Dox的情况下，tTA不能结合TRE，靶基因不能表达。

相反，在Tet-On系统中，转录在Tc或Dox存在下是激活的。Tet-On系统是基于反向四环素调控的转录激活因子rtTA。与tTA一样，rtTA是由TetR阻遏物与VP16反式激活域组成的融合蛋白。然而，TetR D NA结合区中4个氨基酸的变化改变了rtTA的结合特性，使其在存在Dox的情况下只能识别靶转基因TRE上的tetO序列。所以在Tet-On系统中，只有在存在Dox的情况下，rtTA才能激活TRE调控的靶基因的转录。

另一种诱导型启动子系统是大肠杆菌的lac阻遏物系统(参见Brown et al.，Cell49：603-612(1987))。Lac阻遏物系统通过调控与包含lac操纵子(lacO)的启动子可操作性连接的目标多核苷酸的转录发挥功能。Lac阻遏物(lacR)与LacO结合，进而阻止目标多核苷酸的转录。目标多核苷酸通过合适的诱导剂进行诱导表达，例如，异丙基-β-D硫代半乳糖吡喃苷(IPTG)。

为了评估多肽或其部分的表达，待导入细胞的表达载体还可包含选择标记基因或报告基因或二者都有，以便于从病毒载体转染或感染的细胞群体中识别和选择表达细胞。在其他方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并在共转染实验中使用。选择标记基因或报告基因都可侧接于合适的调控序列，使其在宿主细胞中能够表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素耐药基因，如neo以及类似基因。

报告基因可用于鉴定潜在转染的细胞和评价调控序列的功能。通常，报告基因是不存在与受体生物体或组织中或由其表达的基因，并且其编码一种多肽，其表达表现为一些易于检测的特性，例如酶活性。当DNA导入受体细胞后，在合适的时间检测报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白的基因(e.g.，Ui-Tel et al.，2000 FEBS Letters 479：79-82)。合适的表达系统是公知的，可以通过已知的技术制备或通过商业途径获得。通常，把具有显示报告基因最高表达水平的最小5′侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评估某些物质在调节启动子驱动的转录中能力。

在一些实施例中，涉及编码本文所述的任一种全长抗GM-CSFRα抗体的全长抗GM-CSFRα抗体的核酸。在一些实施例中，所述核酸包括编码全长抗GM-CSFRα抗体重链和轻链的一个或多个核酸序列。在一些实施例中，所述一个或多个核酸序列中的每一个包含在单独的载体中。在一些实施例中，至少有一些核酸序列包含在同一载体中。在一些实施例中，所有核酸序列包含在同一载体中。载体可以选自，例如，哺乳动物表达载体和病毒载体(如源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒的载体)。

将基因导入细胞并表达的方法在本领域是已知的。在表达载体的上下文中，通过本领域的任何方法载体可以很容易地导入宿主细胞中，如哺乳动物细胞、细菌、酵母或昆虫细胞。例如表达载体可以通过物理、化学或生物方法导入宿主细胞。

将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、基因枪法、显微注射、电穿孔法以及诸如此类。制备包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域是熟知的。参见例如Green and Sambrook(2013，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。在一些实施例中，通过磷酸钙转染法将多核苷酸导入宿主细胞。

将目标多核苷酸导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物细胞，例如人类细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1型、腺病毒和腺相关病毒等。参见如U.S.Pat.Nos.5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸导入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如高分子复合物、纳米胶囊、微球、磁珠和以脂质为基础的系统，其包括水包油乳剂、胶团、混合胶团和脂质体。一种在体内和体外被用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊)。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性的递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸导入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，所述核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可被包裹进脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸结合的连接分子连接在脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体形成复合物，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质结合，悬浮在脂质中，包含在胶束中或与胶束混合，或以其它方式与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物在溶液中不限于任何特定结构。例如，它们可能以双分子层结构、以胶束或以“塌陷”结构存在。它们也可以简单的分散在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或是合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃及其衍生物的一类化合物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。

无论用于将外源核酸导入宿主细胞中还是以其他方式将细胞暴露于本申请的抑制剂中的方法，为了确认重组DNA序列存在于宿主细胞中，可以进行多种实验。这类实验包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”实验。例如Southern和Northern blotting，RT-PCR和PCR；“生物化学”实验，例如检测某一特定多肽的存在或缺失，例如通过免疫学方法(ELISAs和Western blots)或者通过本文所述的实验来进行鉴定均落入本申请范围内。

抗GM-CSFRα抗体的制备

在一些实施例中，所述抗-GM-CSFRα抗体是单克隆抗体或源于单克隆抗体。在一些实施例中，所述抗-GM-CSFRα抗体包括来自单克隆抗体的V

在杂交瘤细胞法中，通常应用免疫剂免疫仓鼠、小鼠或其他适合的宿主动物，以引发产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫剂可包括目标蛋白的多肽或融合蛋白。通常，如果需要人源细胞，应用外周血淋巴细胞(PBLs)，而如果需要非人哺乳动物来源细胞，则会使用脾细胞或淋巴结细胞。使用适当的融合剂将淋巴细胞与永生细胞系进行融合，例如聚乙二醇，以形成杂交瘤细胞。永生细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿类、牛科和人源的骨髓瘤细胞。通常应用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中进行培养，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合永生细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT or HPRT)，则杂交瘤细胞培养基通常包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培养基)，该培养基能阻止HGPRT缺陷细胞生长。

在一些实施例中，永生化细胞系有效融合，通过所选择的抗体生产细胞支持抗体的稳定高水平的表达，并且对某些培养基敏感，例如HAT培养基。在一些实施例中，永生细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，可以从例如，加利福尼亚圣地亚哥的索尔克细胞保藏中心和弗吉尼亚马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心获得。同时还描述了人骨髓瘤和鼠-人杂交骨髓瘤细胞系用于制备人源单克隆抗体。

然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对多肽的单克隆抗体。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀法或体外结合实验确定，如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)。此类技术或分析方法在本领域是已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以通过例如Munson and Pollard，Anal.Biochem.，107：220(1980)中所述的斯卡查德(Scatchard)分析确定。

在鉴定出所需的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释法对目标克隆进行亚克隆，并通过标准方法进行培养。基于此目的适合的培养基包括，例如改良Eagle培养基(DMEM)和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内以腹水的形式生长。

亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基或腹水中分离或纯化，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

在一些实施例中，根据本文所述的任一抗GM-CSFRα抗体，所述抗GM-CSFRα抗体包含选自抗体文库(例如展示scFv或Fab片段的噬菌体文库)的克隆的序列。所述克隆可以通过筛选具有所需活性的抗体片段组合文库的方法进行鉴定。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库以及筛选这些文库来获得所需结合特性的抗体。这些方法在例如Hoogenboom et al.，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O′Brien et al.，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，2001)中进行了综述，并且在例如McCafferty et al.，Nature348：552-554；Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks and Bradbury，Methods in Molecular Biology248：161-175(Lo，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，2003)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；and Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中进行了进一步描述。

在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆V

所述抗GM-CSFRα抗体可以应用噬菌体展示来筛选文库中能够特异性结合靶标GM-CSFRα的抗GM-CSFRα抗体部分的方法制备。该文库可以是人scFv噬菌体展示文库，具有至少1×10

与靶标GM-CSFRα具有高亲和力的噬菌体克隆可以通过噬菌体与靶标GM-CSFRα的迭代结合进行筛选，所述靶标GM-CSFRα与固相支持物结合(例如用于溶液淘选的珠子或用于细胞淘选的哺乳动物细胞)，接下来去除未结合的噬菌体，并将特异性结合噬菌体进行洗脱。随后，洗脱结合的噬菌体克隆并用于感染合适的宿主细胞，例如E.coli XL1-Blue，进行表达和纯化。可以通过多轮淘选(例如，约2、3、4、5、6或更多个中的任何一轮)，例如溶液淘选、细胞淘选或两者结合以富集特异性结合GM-CSFRα的噬菌体克隆。富集的噬菌体克隆与靶标GM-CSFRα的特异性结合可以通过本领域已知的任何方法进行检测，包括例如ELISA和FACS。

单克隆抗体也可以通过重组DNA方法进行制备，例如U.S.Patent No.4,816,567中所述。编码本申请中所述单克隆抗体的DNA可以通过常规方法(例如通过能特异性结合编码鼠源抗体轻链和重链基因的寡聚核苷酸探针)轻易的分离和测序。如上所述的杂交瘤细胞或本申请的GM-CSFRα特异性噬菌体克隆可以作为这种DNA的来源。分离后，可将DNA置于表达载体中，然后该载体转染入宿主细胞，例如猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢癌(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，获得在重组宿主细胞中合成的单克隆抗体。所述DNA也可以被修饰，例如用编码序列取代人重链和轻链恒定区和/或用框架区替换同源非人序列(U.S.Patent No.4,816,567；Morrison et al.，supra)，或通过共价键连接免疫球蛋白的编码序列的全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本申请中抗体的恒定区，或可以取代本申请中抗体可变域中的一个抗原结合位点，形成嵌合的二价抗体。

所述抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域已知的。例如，一种涉及免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达方法。通常在Fc区的任意位置截短重链，以阻止重链相互交联。或者，相关的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基取代或被删除以防止交联。

体外方法也适用于制备单价抗体。消化抗体产生抗体片段，特别是Fab片段，可以使用任何本领域已知的方法完成。

具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域可以与免疫球蛋白恒定区融合。融合体优选与免疫球蛋白重链恒定区进行融合，其包括至少部分铰链，CH2和CH3区。在一些实施例中，包含轻链结合必要位点的第一重链恒定区(CH1)至少出现在一种融合体中。编码免疫球蛋白重链融合体的DNAs和如果需要，还可以包括编码免疫球蛋白轻链的DNAs，插入到单独的表达载体中，并共转染至合适的宿主生物中。

全人和人源化抗体

所述抗GM-CSFRα抗体(如全长的抗GM-CSFRα抗体)可以是人源化抗体或全人抗体。非人源(如鼠源)抗体部分的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)

通常，人源化抗体含有一个或多个从非人源引入的氨基酸残基。那些非人源氨基酸残基通常被称为“移入”残基，通常来自“移入”可变域。根据一些实施例，人源化可以基本上按照Winter和其同事的如下方法进行(Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536(1988))，通过将啮齿动物CDRs或CDR序列取代人源抗体的相应序列。因此，这种“人源化”抗体部分(U.S.Patent No.4,816,567)，其基本上少于完整的人源抗体，其可变域已被来自非人源的相应序列所取代。在实际中，人源化抗体部分是典型的人源抗体部分，其中一些CDR残基和可能的一些框架区残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基所取代。

全人抗体是人源化的一种替代方式。例如，目前通常会制备转基因动物(例如，小鼠)，通过免疫后，来产生完整的全人抗体文库，而不产生内源性免疫球蛋白。例如，已有报道，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合子缺失，完全抑制了内源性抗体的产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系突变小鼠体内，可在抗原刺激下产生全人抗体，参见，例如akobovits et al.，PNAS USA，90：2551(1993)；Jakobovits etal.，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immunol.，7：33(1993)；U.S.Patent Nos.5,545,806，5,569,825，5,591,669；5,545,807；和WO 97/17852。或者，可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物中，例如内源性免疫球蛋白基因已经被部分或全部沉默的小鼠，来制备全人抗体。一旦刺激中，可以发现全人抗体的产生在各个方面都与其在人类中的产生非常相似，包括基因重排、组装和抗体文库。这种方法在例如U.S.Patent Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；and 5,661,016，and Marks et al.，Bio/Technology，10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature，368：856-859(1994)；Morrison，Nature，368：812-813(1994)；Fishwild et al.，NatureBiotechnology，14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14：826(1996)；Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.，13：65-93(1995)中进行了描述。

全人抗体也以通过体外活化B细胞(见U.S.Patents 5,567,610和5,229,275)或通过使用本领域已知的各种技术来产生，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581(1991).Cole et al.和Boerner et al.等人的技术也可以用于制备全人单克隆抗体。见Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)and Boerner etal.，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991).

抗GM-CSFRα抗体变体

在一些实施例中，本文涉及的抗GM-CSFRα抗体(例如，全长的抗GM-CSFRα抗体)的氨基酸序列变体也在考虑中。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学活性。抗体的氨基酸序列变体可以通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如，抗体氨基酸序列中残基的缺失和/或插入和/或取代。可以通过氨基酸残基缺失、插入和取代的任一组合来完成最终的构建，使其具有所需的特征。例如，抗原结合性。

在一些实施例中，涉及具有一个或多个氨基酸取代的抗GM-CSFRα抗体变体。取代突变的目标位点包括高变区(HVRs)和框架区(FRs)。可以在目标抗体中引入氨基酸取代，筛选所需活性的产物，例如，改善的生物活性，保留/改善抗原结合能力，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

保守取代如下表4所示

表4保守取代

根据侧链性质将氨基酸分为不同类别：

疏水氨基酸：去甲亮氨酸Norleucine、蛋氨酸Met、丙氨酸Ala、缬氨酸Val、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile；

中性亲水性氨基酸：半胱氨酸Cys、丝氨酸Ser、苏氨酸Thr、天冬酰胺Asn、谷氨酰胺Gln；

酸性氨基酸：天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu；

碱性氨基酸：组氨酸His、赖氨酸Lys、精氨酸Arg；

影响链方向的氨基酸：甘氨酸Gly、脯氨酸Pro；

芳香族氨基酸：色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe。

非保守氨基酸的取代包含从以上一种类别取代为另一种类别。

一种示例性的取代变体是容易产生的亲和力成熟的抗体，例如采用以噬菌体展示为基础的亲和力成熟技术而产生。简言之，将一个或多个CDR残基进行突变，变体抗体部分展示在噬菌体上，并筛选具有特定生物活性(例如，基于TF-1细胞增殖实验的生物学活性或结合亲和力)的变体。可以在HVRs区进行改变(例如，取代)来获得改善的基于TF-1细胞增殖实验的生物学活性或抗体亲和力。可以在HVR的“热点区”产生改变，即在体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见，例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))，和/或在特异的决定性残基(SDRs)，检测所得变体V

在一些亲和力成熟的实施例中，通过多种方法中的任一种(例如易错PCR，链改组或寡核苷酸定向突变)，将多样性引入选择的用于亲和力成熟的可变基因中。然后创建二级文库。对该文库进行筛选，鉴定出具有所需亲和力的抗体变体。另一种方法是涉及HVR介导的引入多样性的方式，其中几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。涉及抗原结合的HVR残基被特异性地识别，例如，采用丙氨酸扫描诱变或建模。通常CDR-H3和CDR-L3区域尤其是重点靶标。

在一些实施例中，取代、插入或缺失可能发生在一个或多个HVRs内，只要这种改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，本文中涉及的保守性取代)在HVRs中产生。这些改变可能发生在HVR“热点区”或SDRs区域之外。在一些实施例中上文涉及的变体VH和VL序列，每一个HVR或者是未发生改变，或者包含不超过1个、2个或3个氨基酸取代。

一种有用的可以鉴定出抗体中能被靶向性突变的氨基酸残基或区域方法称为“丙氨酸扫描突变”，如Cunningham and Wells(1989)Science，244：1081-1085中所述。在该方法中，靶向残基中的一个或一组残基(例如，带电残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)被中性或带负电荷氨基酸(例如，丙氨酸或天冬氨酸、谷氨酸)取代来确定抗体与抗原相互作用是否受到影响。可以在氨基酸的位置进一步引入取代，来证明该位置对初始取代具有功能敏感性。或者/另外，通过抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触位点。这些接触位点残基和邻近残基可作为取代候选物而被靶向或消除。筛选变体被确定它们是否具有所需要的性质。

氨基酸序列的插入，包括在氨基端和/或羧基末端，融合长度范围从1个残基到包含100个或更多个残基的多肽，还包括，在序列内插入1个或多个氨基酸残基。末端插入的例子，包括一种抗体，其N末端具有甲硫氨酰残基。其它抗体分子的插入变体，包括在抗体分子N-末端或C-末端融合酶(例如，ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽。

在一些实施例中，涉及抗GM-CSFRα抗体，其包含V

在一些实施例中，表15所示的任一氨基酸取代或其组合均在考虑范围之内。

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体包含V

Fc区变体

在一些实施例中，将一个或多个氨基酸修饰引入本文所述的抗体(例如，全长抗GM-CSFRα抗体或抗GM-CSFRα抗体融合蛋白)的Fc区，从而产生Fc区变体。在一些实施例中，Fc区变体具有增强的ADCC效能，通常与结合Fc的受体(FcRs)有关。在一些实施例中，Fc区变体具有降低的ADCC效能。有很多关于Fc序列的改变或突变影响其效能的例子，例如，WO 00/42072和Shields et al.J Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)描述了关于增强或减弱与FcRs结合的抗体变体。这些出版物的内容通过引用并入本文。

抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)是治疗性抗体针对肿瘤细胞的作用机制。ADCC是细胞介导的免疫防御，当靶细胞膜表面的抗原被特异性抗体(例如，抗GM-CSFRα抗体)结合，免疫系统的效应细胞主动裂解靶细胞(例如，癌细胞)。通常ADCC效应涉及由抗体激活的NK细胞。NK细胞表达Fc受体CD16。该受体识别并结合与靶细胞表面相结合的抗体分子的Fc部分。NK细胞表面最常见的Fc受体为CD16或FcγRIII。Fc受体与抗体Fc区的结合导致NK细胞的活化，释放细胞裂解颗粒，随后靶细胞凋亡。ADCC对肿瘤细胞的杀伤作用可以通过转染高亲和力FcR的NK-92细胞的特异性实验来测定。其结果与不表达FcR的野生型NK-92进行比较。

在一些实施例中，本申请还涉及抗GM-CSFRα抗体变体(例如全长抗GM-CSFRα抗体变体)，其包含Fc区，该Fc区域具有部分但不是全部的效应功能，使得其在体内具有延长的半衰期，然而特定的效应功能(例如CDC或ADCC)的是非必需的或有害的，这种抗GM-CSFRα抗体成为本申请理想的候选。通过在体外和/或体内进行细胞毒性检测来确认CDC和/或ADCC活性的减少/消耗。例如，通过Fc受体(FcR)结合试验来确认抗体缺乏FcγR结合能力(因此可能缺乏ADCC活性)但依然保留FcRn的结合能力。介导ADCC的主要细胞中，NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and KinetAnnu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464页的表3中总结了FcR在造血细胞上的表达。在体外评估目标分子的ADCC活性的非限制性实例在U.S.Pat.No.5,500,362中进行了描述(参见例如Hellstrom，I.et al.Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))andHellstrom，I et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；U.S.Pat.No.5,821,337(see Bruggemann，M.et al.，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性检测方法(参见，例如ACTI

具有降低的效应功能的抗体，包括在Fc区残基238、265、269、270、297、327和329位进行一个或多个残基的取代(U.S.Pat.No.6,737,056)。这些Fc变体包括在265、269、270、297和327位进行两个或多个残基的取代的Fc变体，包括被称为“DANA”的Fc变体，其在265和297位残基取代为丙氨酸(U.S.Pat.No.7,332,581)。

这类与FcRs结合能力提高或降低的抗体变体已有描述(参见例如U.S.Pat.No.6,737,056；WO 2004/056312，和Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。

在一些实施例中，涉及一种抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)变体，其包含具有一个或多个能够增强ADCC效应的氨基酸取代的Fc区变体。在一些实施例中，Fc区变体包含一个或多个能够增强ADCC效应的氨基取代，这些取代的位置在Fc区的298、333和/或334位(EU残基编号)。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体(例如，全长的抗GM-CSFRα抗体)变体包括在Fc区的S298A，E333A和K334A位氨基酸取代。

在一些实施例中，Fc区的改变导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒作用(CDC)的改变(即增强或减弱)，参见U.S.Pat.No.6,194,551，WO 99/51642，和Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。

在一些实施例中，涉及一种抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)变体，其包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc区变体，能够延长半衰期或增强与Fc受体(FcRn)的结合。具有延长半衰期和改善FcRn结合的抗体在US2005/0014934A1(Hinton等)中有所描述。这些抗体Fc区包含一个或多个氨基酸取代，增强了Fc区与FcRn的结合。这些Fc变体包含在Fc区238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434位的残基具有一个或多个取代，例如Fc区434位残基的取代(U.S.Pat.No.7,371,826)。

同时参见Duncan&Winter，Nature 322：738-40(1988)；U.S.Pat.No.5,648,260；U.S.Pat.No.5,624,821和WO 94/29351中涉及其它Fc区变体的例子。

本申请考虑了包括本文所述的任一种Fc变体或其组合的抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)。

糖基化变体

在一些实施例中，本文所涉及的抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)被改变，以增加或降低抗GM-CSFRα抗体糖基化的程度。添加或删除抗GM-CSFRα抗体上的糖基化位点，可通过改变抗GM-CSFRα抗体或其多肽部分的氨基酸序列以此来增加或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。

其中抗GM-CSFRα抗体包含Fc区，可以改变与其连接的糖。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，该寡糖通常通过N-连接与Fc区CH2结构域Asn297连接，参见例如Wright et al.，TIBTECH 15：26-32(1997)。所述寡糖可包含多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖苷(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双触角寡糖结构“茎”部的GlcNAc相连接的海藻糖。在一些实施例中，可对本申请的抗GM-CSFRα抗体进行寡糖修饰，从而产生具有某些改进特性的抗GM-CSFRα抗体变体。

与Fc区的CH2结构域连接的N-聚糖是异质的。CHO细胞中产生的抗体或Fc融合蛋白通过岩藻糖基转移酶活性被岩藻糖基化，参见Shoji-Hosaka et al.，J.Biochem.2006，140：777-83。通常，可以在人血清中检测出一小部分天然存在的非岩藻糖基化IgGs。Fc区的N-糖基化对于其与Fc R结合很重要；而非岩藻糖基化的N-聚糖增强了Fc与Fc RIIIa的结合能力。与FcRIIIa结合能力的增强，增强ADCC效应，这在需要细胞毒性的某些抗体治疗应用中是有利的。

在一些实施例中，当不需要Fc介导的细胞毒作用时，增强的效应功能可能是有害的。在一些实施例中，Fc片段或CH2结构域是非糖基化的。在一些实施例中，通过对CH2结构域中的N-糖基化位点进行突变以阻止其糖基化。

在一些实施例中，涉及抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)变体，其包含Fc区，其中连接于Fc区的糖类结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，这可能会增强ADCC功能。具体地，本文涉及抗GM-CSFRα抗体，其相对于野生型CHO细胞产生的相同抗GM-CSFRα抗体具有减少的岩藻糖。也就是说，它们的特征在于，与天然CHO细胞(例如，产生天然糖基化形式的CHO细胞，含有天然FUT8基因的CHO细胞)产生的抗体相比，具有更少量的岩藻糖。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体的N-连接聚糖具有少于50％、40％、30％、20％、10％或5％的岩藻糖。例如，该抗GM-CSFRα抗体的岩藻糖含量可能是1％-80％、1％-65％、5％-65％或20％-40％。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体的N-连接聚糖不包含岩藻糖，即，其中抗GM-CSFRα抗体完全不含岩藻糖，或没有岩藻糖或是去岩藻糖基化。岩藻糖的含量是通过计算连接到Asn297的上的糖链内岩藻糖平均含量相对于通过MALDI-TOF质谱测量的所有连接在Asn297上的糖结构(如复合、杂交或甘露糖结构)的总量来确定的，如WO 2008/077546所述。Asn297是指位于Fc区297位的天冬酰胺残基(EU Fc区残基编号体系)。然而，由于抗体的微小序列变化，Asn297也可位于297位的上游或下游约±3个氨基酸，即在294和300位之间。这些岩藻糖基化变体可能具有增强的ADCC功能。参见例如US PatentPublication Nos.US 2003/0157108(Presta，L.)，US 2004/0093621(Kyowa Hakko KogyoCo.，Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体相关的出版物的实例，包括US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki etal.Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系包括缺乏蛋白岩藻糖基化功能的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；US Pat Appl No US 2003/0157108 A1，Presta，L；和WO 2004/056312 A1，Adamset al.，尤其是实施例11)，和基因敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8基因敲除的CHO细胞(参见Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.etal.，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；和WO2003/085107)。

抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)变体进一步涉及二等分寡糖，例如，其中连接于抗GM-CSFRα抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc等分。这种抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)变体可能具有减少的岩藻糖基化和/或增强的ADCC功能。这类抗体变体的实例在WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.)；U.S.Pat.No.6,602,684(Umana etal.)；US 2005/0123546(Umana et al.)，和Ferrara et al.，Biotechnology andBioengineering，93(5)：851-861(2006)中有所描述。还涉及抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)变体，其在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基。这类抗GM-CSFRα抗体变体可能具有增强的CDC功能。这类变体在例如WO 1997/30087(Patel et al.)；WO 1998/58964(Raju，S.)；和WO 1999/22764(Raju，S.)中有所描述。

在一些实施例中，包含Fc区的所述抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)变体能与FcγRIII相结合。在一些实施例中，包含Fc区的所述抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)变体在人效应细胞(例如T细胞)存在下具有ADCC活性，或者与具有人野生型IgG1Fc区的其他相同的抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)相比，在人效应细胞存在下，具有比增强的ADCC活性。

半胱氨酸工程变体

在一些实施例中，需要制备半胱氨酸工程化的抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)，在该抗体中一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代。在一些实施例中，取代残基出现在抗GM-CSFRα抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，具有活性的巯基基团位于抗GM-CSFRα抗体的可及位点，可以用于将该抗GM-CSFRα抗体与其它部分偶联，例如药物部分或接头-药物部分，来制备如本文中进一步描述的抗GM-CSFRα免疫偶联物。半胱氨酸工程化的抗GM-CSFRα抗体(例如，全长抗GM-CSFRα抗体)可以按照例如U.S.Pat.No.7,521,541所述进行制备。

衍生物

在一些实施例中，本文所涉及的抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)可进一步修饰以包含本领域已知并且容易获得的其它非蛋白部分。适用于衍生化抗GM-CSFRα抗体的部分，包括但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例，包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊烷、聚-1，3，6-三氧杂环已烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、右旋糖酐或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性，在制造中具有优势。聚合物可以是任何分子量，可以是支链或非支链的。连接在抗GM-CSFRα抗体上的聚合物数量可以变化，并且如果连接多于一个多聚物，它们可以是相同的或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑因素来确定，包括但不限于，需要改进抗GM-CSFRα抗体的特性或功能，抗GM-CSFRα抗体衍生物是否用于特定条件下的治疗等。

药物组合物

本文还涉及包含任一种抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)、编码抗体的核酸、包含编码抗体的核酸的载体或者包含本文所述的核酸或载体的宿主细胞的组合物(例如药物组合物，在这里也称为制剂)。在一些实施例中，涉及一种药物组合物，包含本文所述的任一种抗GM-CSFRα抗体和药学上可接受的载体。

可通过混合具有所需纯度的抗GM-CSFRα抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))获得合适的抗GM-CSFRα抗体制剂，制备成冻干制剂或液体制剂形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓冲剂如：磷酸盐、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属复合物(如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN

本文所述的制剂除包含抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)之外，还可以包含一种或多种治疗特定病症所必要的其它活性物质，优选具有活性互补且彼此无不良反应的物质。例如，除了抗GM-CSFRα抗体之外，可能需要进一步包含抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒剂或化学治疗试剂。这些分子以对预期目的有效的量组合存在。其它物质的有效量取决于制剂中的抗GM-CSFRα抗体的含量，疾病或病症或治疗的类型，以及如上所述的其它因素。这些药物通常以与本文描述的相同剂量和给药途径使用，或者以目前应用剂量的约1％至99％使用。

所述抗GM-CSFRα抗体(例如，全长抗GM-CSFRα抗体)也可以包埋在例如通过凝聚技术和界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。可以制备缓释制剂。

可以制备抗GM-CSFRα抗体(例如，全长抗GM-CSFRα抗体)的缓释制剂。缓释制剂的适合的实例包括含有抗体(或其片段)的固体疏水聚合物半透性基质，这些基质是成型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(U.S.Pat.No.3,773,919)，L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT

在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)配制在含有柠檬酸盐、氯化钠、乙酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸、聚山梨酯80(吐温80)或上述任何组合的缓冲液中。

用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过例如应用无菌过滤膜过滤而容易地实现。

使用抗GM-CSFRα抗体的治疗方法

抗GM-CSFRα抗体(例如，全长的抗GM-CSFRα抗体)和/或本发明所述的组合物可以施用于个体(例如，哺乳动物，如人类)来治疗与GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达相关的疾病和/或病症，以及GM-CSF和/或GM-CSFRα失调导致的疾病和/或病症，例如以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎症疾病或癌症，例如，类风湿性关节炎、哮喘和骨髓性白血病肺病。因此，本申请在一些实施例中提供一种治疗以高表达GM-CSF和/或GM-CSFRα和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎性病症或癌症(例如，类风湿性关节炎、哮喘、骨髓性白血病)的方法，包括向个体施用有效量的包含抗GM-CSFRα抗体(例如，全长的抗GM-CSFRα抗体)的组合物(例如，药物组合物)，例如本文所述的任一种抗GM-CSFRα抗体(例如，全长的抗GM-CSFRα抗体)。

在一些实施例中，所述疾病或病症选自，例如，类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、过敏反应、多发性硬化症、骨髓性白血病或动脉粥样硬化。在一些实施例中，所述个体是人类。

例如，在一些实施例中，涉及一种治疗患有以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎性病症或癌症(例如，类风湿性关节炎、哮喘或骨髓性白血病)的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的包含特异性结合人GM-CSFRα上表位的GM-CSFRα抗体(例如，全长抗GM-CSFRα抗体)的药物组合物，其中所述表位包含人GM-CSFRα的Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283和Ile284位氨基酸残基。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合人GM-CSFRα上的表位，所述表位包含人GM-CSFRα的Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283、Ile284、Val51、Thr63和Ile196位氨基酸残基。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合人GM-CSFRα上的表位，所述表位包含人GM-CSFRα的Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283、Ile284、Leu191和Ile196位氨基酸残基。在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体特异性结合人GM-CSFRα上的表位，所述表位包含人GM-CSFRα的Val50、Glu59、Lys194、Lys195、Arg283、Ile284、Arg49、Val51、Asn57和Ser61位氨基酸残基。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体是全长抗体。在一些实施例中，所述全长抗GM-CSFRα抗体是IgG1或IgG4抗体。在一些实施例中，所述疾病或病症选自类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、过敏反应、多发性硬化、骨髓性白血病或动脉粥样硬化。在一些实施例中，所述个体是人类。

在一些实施例中，涉及一种治疗患有以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎症疾病或癌症(例如，类风湿性关节炎、哮喘或骨髓性白血病)的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗GM-CSFRα抗体(例如，全长抗GM-CSFRα抗体)的药物组合物，其中所述抗GM-CSFRα抗体包括V

在一些实施例中，涉及一种治疗患有以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎性病症或癌症(例如，类风湿性关节炎、哮喘或骨髓性白血病)的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗GM-CSFRα抗体的组合物，其中所述抗体包括V

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗GM-CSFRα抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：145组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：146组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：147组成。

在一些实施例中，涉及一种治疗患有以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎性病症或癌症(例如，类风性关节炎，哮喘或骨髓性白血病)的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗GM-CSFRα抗体的组合物，其中所述抗体包括V

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：80的V

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：85的V

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：86的V

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：91的V

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：99的V

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：101的V

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：103的V

在一些实施例中，涉及一种治疗患有以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎症疾病或癌症(例如，类风湿性关节炎、哮喘或骨髓性白血病)的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗GM-CSFRα抗体的组合物，其中所述抗体包括V

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：99的V

在一些实施例中，本文所述抗GM-CSFRα抗体包括：包含氨基酸序列SEQ ID NO：121的V

在一些实施例中，所述个体是哺乳动物(例如人、非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在一些实施例中，所述个体是人类。在一些实施例中，所述个体是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在一些实施例中，所述个体年龄小于约60岁(包括例如小于约50、40、30、25、20、15或10岁中任一个)。在一些实施例中，所述个体年龄大于约60岁(包括例如大于约70、80、90或100岁中任一个)。在一些实施例中，所述个体是被诊断为或在遗传角度上易患本文所描述的一种或多种疾病或病症(例如类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、过敏反应、多发性硬化、骨髓性白血病或动脉粥样硬化)。在一些实施例中，所述个体具有一种或多种与本文所述的一种或多种疾病或病症相关的风险因子。

在一些实施例中，本申请涉及一种向个体中向在其表面表达GM-CSFRα的细胞递送抗GM-CSFR抗体(例如本文所述的任一种抗GM-CSFRα抗体，例如分离的抗GM-CSFRα抗体)的方法，所述方法包括向该个体施用包含抗GM-CSFRα抗体的组合物。

任何表现出GM-CSF和/或GM-CSFRα异常表达的其他疾病或癌症的许多诊断方法和这些疾病的临床描述在本领域是已知的。这类方法包括，但不限于，例如免疫组化、PCR以及荧光原位杂交(FISH)。

在一些实施例中，本申请所述抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)和/或组合物与第二、第三或第四药剂(包括例如抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒素剂或化学治疗剂)联合使用来治疗与GM-CSF和/或GM-CSFRα异常表达的疾病或病症。

采用例如肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸的减少、进展时间、生存期、无进展生存期、总体响应率、响应持续时间、生存质量、蛋白表达水平和/或活性来评估癌症治疗。可以采用确定治疗效果的方法，包括例如，通过放射成像来检测是否响应。

在一些实施例中，治疗的效果以肿瘤生长抑制百分率(％TGI)来评估，使用等式100-(T/C×100)来计算，其中T是已治疗肿瘤的相对平均肿瘤体积，C是未治疗肿瘤的相对平均肿瘤体积。在一些实施例中，％TGI约为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或超过95％。在一些实施例中，治疗效果通过粒细胞形态变化和/或粒细胞存活数量的增加来评估。在一些实施例中，治疗效果通过单核细胞分泌细胞因子的增加来评估。

抗GM-CSFRα抗体的给药剂量和方法。

施用于个体(例如人)的抗GM-CSFRα抗体(例如分离的抗GM-CSFRα抗体)组合物的剂量可能因特定组合物、给药方式和治疗疾病类型的不同而不同。在一些实施例中，组合物(例如，包含抗GM-CSFRα抗体的组合物)的量可在癌症治疗中有效产生客观响应(例如，部分响应或完全响应)。在一些实施例中，抗GM-CSFRα抗体组合物的量足以在个体中产生完全响应。在一些实施例中，抗GM-CSFRα抗体组合物的量足以在个体中产生部分响应。在一些实施例中，抗GM-CSFRα抗体组合物的给药剂量(例如当单独施用时)足以在使用抗GM-CSFRα抗体组合物治疗的个体群体中产生高于约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、64％、65％、70％、75％、80％、85％或90％中任一个的总响应率。个体对本文所述治疗方法的响应可通过，例如，RECIST的水平来确定。

在一些实施例中，组合物(例如包含分离的抗GM-CSFRα抗体的组合物)的量足以延长个体的无进展生存期。在一些实施例中，组合物的量足以延长个体的总体生存期。在一些实施例中，在使用抗GM-CSFRα抗体组合物治疗的个体群体中，组合物的量(例如当单独施用时)足以产生一个高于约50％、60％、70％或77％中的临床益处。

在一些实施例中，组合物(例如包含分离的抗GM-CSFRα抗体的组合物)的量，单独使用或与第二，第三、和/或第四药剂联合使用时，与同一受试者治疗前的相应肿瘤尺寸、癌症细胞数量或肿瘤生长速度相比或与未接受治疗的其它受试者的相应活性相比，其足以减小肿瘤尺寸，癌症细胞数量，或降低肿瘤生长速度至少为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。可以采用标准方法来测量该疗效的大小，例如纯化酶的体外检测、基于细胞的检测、动物模型或人体试验。

在一些实施例中，组合物中抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)的量低于引起毒性效应(即，一种高于临床可接受毒性水平的效应)的水平，或者当将组合物施用于个体时，处于潜在副作用可以控制或耐受的水平。

在一些实施例中，遵循相同的给药方案，组合物的量接近的组合物的最大耐受剂量(MTD)。在一些实施例中，组合物的量高于MTD的80％、90％、95％或98％。

在一些实施例中，组合物中抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)的含量在0.001μg到1000μg的范围之内。

在如上所述任一个实施例中，组合物中的GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)的有效量，按照体重计算，为0.1μg/kg到100mg/kg的范围之内。

抗GM-CSFRα抗体组合物可通过多种途径施用于个体(如人类)，包括，例如静脉注射、动脉内给药、腹腔注射、肺内给药，口服给药、吸入给药、血管内给药、肌肉注射，气管内给药，皮下注射，眼内给药，鞘内给药，粘膜给药或经皮给药。在一些实施例中，使用组合物的缓释制剂。在一些实施例中，组合物通过静脉给药。在一些实施例中，组合物通过动脉给药。在一些实施例中，组合物通过腹膜内给药。在一些实施例中，组合物通过肝内给药。在一些实施例中，组合物通过肝动脉输注给药。在一些实施例中，组合物施用于远离第一病灶的部位。

制品及试剂盒

在本申请的一些实施例中，涉及一种制品，所述制品包含一种物质，所述物质能够用于治疗以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎性病症或癌症(例如，类风湿性关节炎、哮喘或骨髓性白血病)，或者用于递送抗GM-CSFRα抗体(例如一种全长抗GM-CSFRα抗体)到表面表达GM-CSFRα的细胞。所述制品可以包括一种容器以及在容器上或随该容器附带的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。通常，该容器内装有能够有效治疗本文所述疾病或病症的组合物，并且具有一个无菌端口(例如该容器可以是一个静脉输液袋或是一个具有皮下注射针头可刺穿盖子的小瓶)。组合物中至少包含一种活性物质即为本申请所述的抗GM-CSFRα抗体。标签或包装说明书标示了该组合物可以用于治疗的特定病症。标签或包装说明书进一步包含给患者施用抗GM-CSFRα抗体组合物的说明书。包括联合治疗的制品和试剂盒均在本文的考虑范围之内。

包装说明书是指通常包含在治疗产品的商业包装内的说明书，其包含关于使用这些治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告信息。在一些实施例中，包装说明书标明该组合物可以用于治疗自身免疫性疾病和/或炎性病症(例如类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、过敏反应，多发性硬化、骨髓性白血病或动脉粥样硬化)。在一些实施例中，包装说明书标明该组合物可用于治疗癌症(例如骨髓性白血病)。

此外，所述制品还可以包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲液、格林氏溶液或葡萄糖溶液。还可以包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、过滤器、针头和注射器。

同时还涉及可用于各种目的的试剂盒，例如用于治疗以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎性病症或癌症(例如类风湿性关节炎、哮喘或骨髓性白血病)，或者用于递送抗GM-CSFRα抗体(例如全长抗GM-CSFRα抗体)到表面表达GM-CSFRα的细胞中，任选的制品组合。本申请的试剂盒包括一个或多个容器，其包含抗GM-CSFRα抗体组合物(或单剂量形式和/或制品)，并且在一些实施例中，进一步包含另一种药剂(例如本文所述的药剂)和/或与本文所述任一方法相一致的使用说明书。该试剂盒可进一步包括选择适合治疗个体的描述。本申请中试剂盒中所附带的使用说明书通常是标签或包装说明书上的书面说明(例如包含在试剂盒内的纸页)，机器可读的说明(例如，磁性或光学储存光盘上的说明)也是可以接受的。

例如，在一些实施例中，试剂盒包括一种包含抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)的组合物。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包含本文所述的任一种抗GM-CSFRα抗体的组合物，和b)至少一种有效量的其它药剂，其能够增强抗GM-CSFRα抗体的效果(如治疗效果、检测效果)。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包含本文所述的任一种抗GM-CSFRα抗体的组合物，和b)向个体施用抗GM-CSFRα抗体组合物用于治疗以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎性病症或癌症(例如类风湿性关节炎、哮喘或骨髓性白血病)的使用说明书。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包含本文所述的任一种抗GM-CSFRα抗体的组合物，和b)至少一种有效量的其它药剂，其能够增强抗GM-CSFRα抗体的效果(如治疗效果、检测效果)和c)向个体施用抗GM-CSFRα抗体组合物和其它物质用于治疗以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫疾病和/或炎症疾病或癌症(例如类风湿性关节炎、哮喘或骨髓性白血病)的使用说明书。所述抗GM-CSFRα抗体和其他物质可以存在于独立的容器或同一个容器中。例如，该试剂盒可以包括一种特定组合物或两种或更多种组合物，其中一种组合物包括抗GM-CSFRα抗体，另一种组合物包括另一种药剂。

在一些实施例中，试剂盒包含一种编码抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)的核酸(或核酸组)。在一些实施例中，试剂盒包含：a)一种编码抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)的核酸(或一组核酸)，和b)一种表达核酸(或一组核酸)的宿主细胞。在一些实施例中，试剂盒包含：a)一种编码抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)的核酸(或一组核酸)，和b)使用说明书，适用于：i)在宿主细胞中表达抗GM-CSFRα抗体，ii)制备包含抗GM-CSFRα抗体的组合物，和iii)向个体施用包含抗GM-CSFRα抗体的组合物来治疗以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎性病症或癌症(例如类风湿性关节炎、哮喘或骨髓性白血病)。在一些实施例中，试剂盒包括：a)一种(或一组)编码抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)的核酸(，b)一种表达核酸(或核酸组)的宿主细胞，和c)使用说明书，适用于：i)在宿主细胞中表达抗GM-CSFRα抗体，ii)制备包含抗GM-CSFRα抗体的组合物，和iii)向个体施用包含抗GM-CSFRα抗体的组合物来治疗以GM-CSF和/或GM-CSFRα高表达和/或GM-CSF/GM-CSFRα功能异常为特征的自身免疫性疾病和/或炎性病症或癌症(例如类风湿性关节炎、哮喘或骨髓性白血病)。

本申请所述的试剂盒以合适的形式进行包装。合适的包装包括，但不限于，小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供其它的组分，例如缓冲液和说明信息。因此，本申请还提供制品，其包括小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等等。

关于抗GM-CSFRα抗体组合物的使用说明书，通常包括一些信息，诸如，剂量，给药周期和给药途径的。容器可以是单位剂量的，大包装的(如，多剂量包装)或亚单位剂量的。例如，提供一种包含足够剂量的如本文所述的抗GM-CSFRα抗体(例如全长的抗GM-CSFRα抗体)的试剂盒以对个体进行长期有效的治疗，例如一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周，8周，3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月或更长时间。试剂盒还可包含多单位剂量的抗GM-CSFRα抗体、药物组合物和使用说明书，并且以足够的量进行包装，用于在药房中储存和使用，例如，医院药房和复方药房。

本领域的技术人员将认识到在本申请的范围和宗旨内可能的若干实施例。现在将通过参考以下非限制性实施例来更详细地描述本申请。以下实施例进一步阐明本申请，但不应解释为以任何方式进行限制其范围。

具体实施方式

在下述公开的实施例中，适用如下缩写：GMF(human GM-CSF)；GMRα(human GM-CSFRα)；GMRb(human GM-CSFRβ)；Mab(Mavrilimumab)；GMRαh(human GM-CSFRα-6His)；BGMRα(Biotin-Avi-GM-CSFRα)；mGMRα(cynomolgus monkey GM-CSFRα)；mGMRαh(cynomolgusmonkey GM-CSFRα-6His)。

实施例1：制备重组人GM-CSFRα并且筛选抗GM-CSFRα的单链抗体(scFv)

制备重组GM-CSFRα抗原

通过使用限制性内切酶的酶切位点HindIII和XhoI，将编码人GM-CSFRα(此处简称为GMRα)的全长基因从载体pSC-GM-CSFRα(上海捷瑞)亚克隆到真核表达载体pTT5上，并在GMRα上添加His标签或其它的本领域技术人员常用标签。分别构建如下表达载体：pTT5-GMRα-6his(ECD)，pTT5-Avi-10His-GMRα(ECD)和pTT5-GMRα(400aa)。其中“ECD”代表胞外区，“his或His”代表His标签，“Avi”代表亲和素标签。

另外，重组食蟹猴GM-CSFRα构建体也被克隆。根据NCBI数据库中食蟹猴GM-CSFRα的序列(XM_024791666.1)设计相应引物，并从食蟹猴外周血单核细胞(PBMC)中提取RNA，逆转录获得cDNA，利用食蟹猴GM-CSFRα胞外段的引物扩增胞外区编码序列，并克隆到真核载体pTT5中，完成pTT5-mGMRα-6his(ECD)载体的构建。

按照仪器厂商及试剂盒操作说明书，对重组人GM-CSFRα，包括GMRα-6his(ECD)、Avi-10His-GMRα(ECD)和mGMRα-6his(ECD)进行表达和纯化。简而言之，将表达载体转染293F细胞，并将上述细胞在37℃、8％CO

制备生物素化标记的GM-CSFRα抗原

按照操作说明书，采用生物素化连接酶B0101A(GeneCopoeia)对Avi-10His-GMRα进行生物素化标记。简言之，向Avi-10His-GMRα抗原中分别加入相应的BufferA/B和BirA连接酶后在30℃下孵育2小时。生物素化的GMRα被命名为Bavih-GMRα。通过ELISA方法检测生物素化效率。简言之，将Bavih-GMRα起始浓度设置为500ng/ml，按1∶2的比例进行倍比稀释，稀释之后包被ELISA板。采用SA-HRP来检测，用生物素化标准品做对照。Bavih-GMRα生物素化标记效率为70％。使用TF-1细胞增殖实验证实了Bavih-GMRα的生物活性。

筛选抗GM-CSFRα单链抗体(scFv)

构建scFv抗体酵母展示文库：从2000份人血液样本中提取RNA，经逆转录获得cDNA，采用V

筛选抗GM-CSFRα单链抗体(scFv)：从酵母展示文库中分离识别GM-CSFRα的scFvs。简言之，采用MACS磁珠分选对表达GM-CSFRα scFV的酵母细胞进行富集。将1000OD的酵母细胞，在2500g下离心5分钟。获得的细胞沉淀，按照OD600＝1的起始浓度，用1L SGCAA培养基进行重悬，并于20℃，250rpm培养条件下诱导表达40-48小时。将细胞培养液离心，并用PBSM溶液清洗后，用5-10倍体积含有1μM Bavih-GMRα的PBSM溶液重悬细胞沉淀，4℃孵育1小时。经过离心和PBSM洗涤后，未结合的抗原被PBSM溶液洗去。加入磁珠后，充分混匀，随后被置于4℃悬转仪上孵育30分钟。2500g离心5分钟，弃去上清，用5-10倍体积的PBSM溶液重悬沉淀。每次取7ml细胞悬液加入到柱子上，直到所有的细胞悬液流穿柱子。收集结合到柱子上的细胞，并进一步培养以提取质粒。

制备噬菌体展示文库并筛选scFv抗体：采用scFv-F和scFv-R引物对从酵母库中获得的质粒进行PCR扩增，将获得的scFvs抗体片段经SfiI克隆到噬菌体展示载体pDAN5中，连接后转化TG1噬菌体展示电穿孔感受态细胞，以获得scFv抗体噬菌体展示文库。经过一系列重复筛选步骤，从噬菌体展示库中分离获得特异性结合GM-CSFRα的scFv抗体。简言之，取2x10

进行配体结合实验并筛选scFv单克隆抗体。设计第一个实验以验证scFv抗体能够结合人GM-CSFRα和/或食蟹猴GM-CSFRα。简言之，将GMRαh(人GM-CSFRα)或mGMRαh(食蟹猴GM-CSFRα)抗原溶解在PBS溶液中，按照0.2μg/孔包被96孔板，4℃过夜。在加入scFv抗体之前，用TBST溶液洗涤该孔板，用5％牛奶37℃封闭1-2小时，再用TBST溶液洗涤。首先将每个scFv样品稀释至40μg/mL，取150μL加入到第一排的孔中，随后将40μg/mL的scFv样品按照1∶3比例倍比稀释，稀释后加入到剩余孔中。37℃孵育1小时后，用TBST溶液洗涤6次。将100μl一抗和二抗混合物(小鼠抗-flag(1∶2500)和抗-小鼠FC-AP(1∶2000))加入每个孔中，37℃孵育1小时，用TBST溶液洗涤3次。每孔加入50μL PNPP，37℃孵育10-20分钟。用3M NaOH终止反应。分析ELISA结果(OD410)，并通过PRISM生成结合曲线。

设计第二个实验，通过ELISA竞争实验来验证scFv抗体能够阻断GM-CSF与GM-CSFRα的结合。简言之，用0.5μg/孔GM-CSF和5％牛奶包被96孔板，37℃孵育1-2小时，用TBST溶液洗涤。首先将每个scFv抗体样品稀释至40μg/mL，向第一排加入100μL，随后将40μg/mL的scFv抗体样品按照1∶2比例倍比稀释，稀释后加入到剩余的孔中。将50μL包含2.5μg/mLBavih-GMRa的PBS溶液加入每孔中。37℃孵育1小时后，TBST溶液洗涤6次。每孔加入100μLSA-HRP(1∶20000)，37℃孵育1小时。TBST溶液洗涤6次后，每孔加入50μL TMB，37℃孵育5-10分钟。加入2M H

TF-1细胞增殖实验：在TF-1细胞增殖实验中，通过检测scFv抗体对GM-CSF刺激TF-1细胞增殖的抑制作用，来评估其抑制GM-CSF与GM-CSFRα结合的生物学活性。TF-1细胞是从患有红白血病的患者中建立的人类前髓细胞系。该细胞系的存活和增殖是因子依赖性的，通常需要人GM-CSF来维持其增殖。简言之，将TF-1细胞在RPMI1640，10％FBS，10ng/mL GM-CSF培养基中培养，每周传代两次。用不含GM-CSF的培养液(RPMI1640，10％FBS)洗涤细胞3次，重悬于相同的培养液中。向96孔板中加入大约每孔10,000个细胞，过夜培养。第二天，将scFv抗体以1∶10比例倍比稀释(从10μg/mL to 0.0001μg/mL)，稀释后加入96孔板中。37℃孵育1小时，加入GM-CSF(Peprotech)，终浓度为200pg/mL。次日用Celltiter-glo检测试剂盒(Promega)检测细胞存活率。用PRISM计算IC

实施例2：制备和表征全长的人源GM-CSFRα抗体

制备全长的抗GM-CSFRα抗体

将最有潜力的scFv抗体构建成具有人IgG1或IgG4的重链恒定区和人kappa轻链恒定区的人IgG1或IgG4抗体分子。从原核表达载体中扩增V

抗GM-CSFRα抗体的亲和力

采用ELISA实验评价先导亲本抗体T119及先导优化抗体(重构建成人IgG1形式)与人GM-CSFRα的亲和力，如图1A-1C所示，与T119相比，先导优化抗体均表现出改善的结合亲和力。接下来，采用ELISA实验评价先导亲本抗体T119及先导优化抗体E35、E200a、E87和E108(重构建成IgG4形式)与食蟹猴GM-CSFRα(mGMRαh)的亲和力，如图2所示，抗GM-CSFRα抗体与食蟹猴GM-CSFRα存在交叉反应。

抗GM-CSFRα抗体的特异性

与同源蛋白的交叉反应性：采用ELSIA实验检测E35、E87和E108(重构建成IgG4形式)与GM-CSFRα同源蛋白IL3RA、IL5RA和G-CSFR的交叉反应，如图3所示，与已检测的其它同源蛋白相比，抗体特异性地与GMRαh结合，表明所制备的抗GM-CSFRα抗体对GM-CSFRα是具有特异性的。

与表达GM-CSFRα的WIL2S细胞结合的特异性：进一步评估抗GM-CSFRα的抗体E35-IgG4与表达GM-CSFRα的WIL2S细胞结合的特异性。按照说明书操作步骤，采用GLY-650(Dylight Amine-Reactive Dyes，Thermo Fisher)对抗GM-CSFRα抗体E35-IgG4进行荧光标记。采用包含全长GM-CSFRα的表达载体电转染WIL2S细胞，采用未转染的WIL2S细胞作为对照。电转染48小时后，分别收集转染和未转染细胞至15mL离心管中，1000rpm离心5分钟，重悬于DPBS溶液。取1x10

抗GM-CSFRα抗体结合亲和力以及解离常数(Kd)表征

采用Biacore T200(GE)检测抗GM-CSFRα抗体E35和E87b(重构建成人IgG4形式)的结合亲和力。将E35和E87b固定于传感器芯片CM5上。检测不同浓度下的抗体与GMRαh的亲和力，浓度范围包括10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195和0nM，其中0.625和0nM分别重复一次。用SPR技术测量抗体的结合和解离速率并确定结合亲和力，表5列出了E35和E87b抗体的kon、koff、以及Kd值。

表5

抗GM-CSFRα抗体与GM-CSF竞争结合GM-CSFRα

采用竞争ELISA实验(如实施例1所述方法)来评估GM-CSFRα抗体识别GM-CSFRα配体结合位点，并与GM-CSF竞争结合GM-CSFRα的能力。如图5A-5D所示，先导亲本抗体T119以及先导优化抗体(重构建成人IgG4形式)能够阻断GM-CSF与人GM-CSFRα的结合，表明抗体与GM-CSF竞争性地结合人GM-CSFRα。

抗GM-CSFRα抗体稳定性实验

热稳定性分析：采用UNcle平台分析T119-IgG1、E35-IgG1、E35b-IgG1以及Mab-IgG1的热稳定性，分别测量每个抗体的熔解温度(T

表6

TF-1细胞增殖实验

采用TF-1细胞增殖实验(如实施例1所述方法)检测先导抗体T119以及先导优化抗体(重构建成人IgG4形式)抑制TF-1细胞增殖的能力。结果如图7所示，与先导抗体T119相比，先导优化抗体具有相当或更优的抑制TF-1细胞增殖的能力。

粒细胞变形实验

采用人粒细胞变形实验进一步评估抗GM-CSFRα抗体。简言之，取10mL人外周血，采用Ficoll密度梯度离心法去除单个核细胞。去除单个核细胞层以及Ficoll溶液后，使用细胞裂解液裂解红细胞。采用PBS溶液及细胞培养液洗涤剩余细胞，向96孔板中每孔加入100,000个细胞，37℃孵育30分钟。然后使用100pg/mL GM-CSF处理细胞，并加入按1∶10梯度稀释的GM-CSFRα抗体(10μg/mL至0.0001μg/mL)，37℃孵育3小时，细胞进行FACS检测，并基于Forward Scatter GEO平均值评估粒细胞变形。如图8所示，E35、E108和E87b(重构建成人IgG4形式)均能够阻止粒细胞变形，抗体IC50值如下表7所示。

表7

使用食蟹猴粒细胞变形实验进一步评估抗GM-CSFRα抗体E35(重构建成人IgG4形式)。从食蟹猴全血中纯化获得粒细胞，使用100pg/mL GM-CSF处理细胞，并加入按1∶10梯度稀释的E35抗体(10μg/mL至0.0001μg/mL)。对细胞进行FACS分析，并基于Forward ScatterGEO平均值评估粒细胞变形。结果显示E35-IgG4抗体能够阻止食蟹猴粒细胞变形(图9)，其IC50值为0.002527μg/mL。

人粒细胞存活实验

在GM-CSF存在下，粒细胞能存活更长时间。在人粒细胞存活实验中，评估抗GM-CSFRα抗体对该效应的抑制能力。简言之，从人外周血中分离获得粒细胞，并使用100pg/mL的GM-CSF处理细胞。将抗体按1∶10梯度稀释(10μg/mL至0.0001μg/mL)，加入细胞中。孵育48小时后，使用Celltiter-glo检测试剂盒(Promega)分析细胞存活率。如图10所示，E35，E108和E87b有效地抑制了粒细胞存活。表8显示了不同抗体抑制粒细胞存活的IC50值。

表8

细胞因子释放的抑制活性

对CD11b表达的抑制效果：评估抗GM-CSFRα抗体E35、E87b以及对照抗体Mab对CD11b在人外周血细胞中表达的抑制作用。简言之，向96孔板中每孔加入50μL人外周血，并加入按1∶10比例梯度稀释的抗体(10μg/mL to 0.0001μg/mL)一起孵育。37℃孵育1小时，加入10ng/mL的GM-CSF继续孵育1小时，随后采用FITC偶联的抗CD11b抗体(BD53310)4℃孵育30分钟，以标记CD11b。采用1mL细胞裂解液(BD349202)裂解红细胞，PBS溶液洗涤2次，采用FACS分析CD11b的表达。如图11和表9所示，与对照抗体Mab-IgG4相比，E35和E87b对CD11b的表达具有更强的抑制能力。抗体的IC50值如表9所示。

表9

对细胞因子产生的抑制效果：为评价抗GM-CSFRα抗体对细胞因子产生的抑制效果，取10mL人外周血，使用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，PBS溶液洗涤2次，用细胞培养液重悬，向96孔板中每孔加入1,000,000个细胞(100μL)，以及50μL梯度稀释的GM-CSFRα抗体(100μg/mL至0.001μg/mL)，37℃孵育1小时。然后分别加入LPS以及GM-CSF至终浓度分别为100ng/mL和50ng/mL。37℃孵育48小时，收集上清液，使用Human Macrophage/Microglia Panel(Biolegend，740503)分析TNFα和IL-1β的水平。如图12A和表10所示，与对照抗体Mab-IgG4相比，E35-IgG4和E87b-IgG4显示出更强的TNFα抑制活性。如图13和表11所示，与对照抗体Mab-IgG4相比，E35-IgG4和E87b-IgG4显示出更强的IL-1β抑制活性。

表10

表11

同时采用ELSIA方法进一步分析上清液中TNFα的水平。ELISA的结果证实：与对照抗体Mab-IgG4相比，E35-IgG4和E87b-IgG4对TNFα分泌具有更强的抑制活性(图12B和表12)。

表12

抗GM-CSFRα抗体药物代谢动力学

大鼠体内的PK值：10只健康成年大鼠(体重约0.2kg/只)，根据体重分成2组，每组5只。第1组大鼠静脉注射20mg/kg的Mab-IgG4或E35-IgG4，第2组大鼠静脉注射2mg/kg的Mab-IgG4或E35-IgG4。首先在注射后1小时取血，随后依次在注射后2天、3天、5天、9天和15天取血。血液离心后，取血浆用ELISA法分析抗体浓度。简言之，在96孔板中包被合成的GM-CSFRα，第2天，用PBST溶液洗涤后，再用200μL PBS-牛奶封闭1小时，随后再用TBST洗涤，加入血浆并在37℃孵育1小时。将板用0.1％TBST溶液洗涤6次后，加入100μL Goat-anti-human Fcantibody-AP(用PBS进行1∶3000稀释)，孵育1小时。用0.1％TBST溶液洗涤6次，加入50μLpNPP溶液，37℃显色10-20分钟。酶标仪410nm读取结果，结果显示E35-IgG4的半衰期长于Mab-IgG4的半衰期(图14A-14B和表13)

表13

食蟹猴体内PK和PD研究：4只健康成年食蟹猴(体重约3kg/只)被注射浓度为10mg/kg的E35-IgG4或对照抗体Mab-IgG4。其中#1和#2动物注射Mab-IgG4，#3和#4动物注射E35-IgG4。分别在注射前一天(D-1)、注射后1小时(D1)，随后依次在2天(D2)、4天(D4)、8天(D8)、15天(D15)、22天(D22)和36天(D36)时从每只动物取6mL血样。为评估抗体的药代动力学，分别取其中1mL每个取样点的血样，5000g离心15分钟获得血浆，分成50μL等分，储存在-80℃。采用如上所述的用于大鼠药代动力学研究的ELISA方法来分析血浆中E35-IgG4和Mab-IgG4的浓度。结果如图15和表14所示，E35-IgG4的半衰期长于Mab-IgG4的半衰期。为了评估抗体的药效学，从每个取样点剩余的5mL血样中分离获得粒细胞，然后进行粒细胞变形实验。简言之，在96孔板的每孔中加入100μL粒细胞(2x10

表14

抗GM-CSFRα抗体对GM-CSF诱导的炎性细胞增殖的抑制活性

为了检测抗GM-CSFRα抗体对GM-CSF诱导的炎性细胞增殖的抑制作用，将GM-CSF施用于事先已注射过E35-IgG4或对照NaCl溶液的食蟹猴中，在施用GM-CSF后评估白细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和红细胞的水平。简言之，将4只食蟹猴分为2组，每组2只。一组食蟹猴在Day1和Day3通过腹膜内注射E35-IgG4，另一组作为对照注射NaCl溶液。在Day3、4和Day5时，分别给两组食蟹猴注射剂量为5.0μg/kg的GM-CSF(每天2次，每次注射间隔8小时左右)。在第一次注射GM-CSF前，以及随后在第一次注射GM-CSF后的0.5h、4.0h、28.0h、52.0h、76.0h、24.0h和176.0h收集血样，分析不同时间点不同类型细胞的水平。

结果表明，与对照组相比，E35-IgG4完全抑制了GM-CSF诱导的白细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞的增殖。相反，两组中红细胞的水平在GM-CSF治疗前后均保持恒定(图17A-17G)。

实施例3：鉴定保留生物学活性的E35变体

将his标记的E35-scFv序列克隆到原核表达载体中，对CDR区域中选定的氨基酸进行饱和突变后筛选。将突变体插入原核表达载体中并用于转染BL21细胞。铺板后，随机挑选60个克隆进行测序，获得每个位置14-19个不同的突变。生产和纯化包含这些突变的scFv，并采用TF-1细胞增殖实验来评估其生物学活性。减弱TF-1细胞增殖的突变体及其相应的IC50值如下表15所示(编号方式为EU kabat编号体系)：

表15：IC50的单位为μg/mL

根据上述结果，通过TF-1细胞增殖实验评价，源自E35scFv且具有下述氨基酸序列的scFv抗体仍具有生物学活性：

选自V

同时，还制备了包含组合突变的E35变体。分析包含组合突变的全长IgG4形式的E35变体在减弱TF-1细胞增殖实验中的IC50值，其数据如下表16所示。结果表明，含有组合突变的E35变体对减弱TF-1细胞增殖表现出更强的作用。

表16

示例性的E35变体的轻、重链可变域序列如下表17所示。

表17

实施例4：抗GM-CSFRα抗体表位解析

根据GM-CSF与GM-CSFRα的晶体结构，鉴定二者结合位点附近的氨基酸残基，其中GM-CSFRα是依据其晶体结构(PDB id：4RS1)进行编号，如图20所示。采用Discovery Studio软件，预测E35的结合位点，选择结合位点以及其附近的氨基酸残基进行丙氨酸扫描。表达具有所选突变的GM-CSFRα蛋白。采用ELISA实验，分析E35-IgG4、E87b-IgG4和T119-IgG4与每种GM-CSFRα蛋白突变体的结合亲和力。图18A-18C展示了抗体与GM-CSFRα突变体的ELISA结合曲线。如本文所述，GMRαh代表具有His标签的野生型人GM-CSFRα(GM-CSFRα-6His)。野生型GM-CSFRα的氨基酸序列上的各个位置处的突变是采用如上所述丙氨酸扫描技术制备获得。如图18A-18C所示，C60位置处的突变显著影响了与E35、E87b和T119的结合亲和力，并且被确定为影响GM-CSFRα蛋白结构的突变。基于这些结果，抗体E35、E87b和T119的示例性表位被鉴定为包含表18所示的氨基酸残基。GM-CSFRα(SEQ ID NO：292)中氨基酸残基的编号如图20所示。

表18

完整全部详细技术资料下载

该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：朱萍霞;吴然;张晴爽;黄群;
专利申请人：舒泰神(北京)生物制药股份有限公司;