一种多孔水凝胶微球及其制备方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种多孔水凝胶微球及其制备方法。

背景技术

水凝胶是一种具有三维孔隙结构的高分子材料，其亲水性好、粘弹性高、生物相容性佳等特点使得水凝胶作为细胞载体、药物载体在组织工程及生物医学领域具有广泛的应用前景。

目前水凝胶作为细胞载体支架通常体积较大、较小体积的块状凝胶又不易操做，因此可操作的微型化支架是很好的解决方案之一。可注射水凝胶微球是一种非常可行的策略，利用特定方式将水凝胶做成球形，并且尺寸满足可注射的要求，与传统3D支架相比，可注射微球避免了手术移植，提供了微创治疗的可能性，并且可被注入任何缺陷内，无需考虑形状变化，将细胞与药物等运送到特定部位，因而受到了广泛关注。

然而，目前常用的水凝胶微球存在如下问题：(1)水凝胶缺少孔隙，导致营养物质无法渗透，内部细胞无法存活；(2)制备多孔微球的生物相容性差，步骤繁琐、无法实现一步实现制备微球，对微球负载的生物活性因子造成不利影响。文献：作为细胞微载体的明胶基缓释微球的制备，高等学校化学学报，2007年第9期1776-1780中，采取了将交联明胶微球用水二次溶胀后冻干的方式制备多孔结构，该方法操作较为复杂，冻干过程冰晶生长较难控制，未参与交联明胶溶出并在冻干后会产生大量絮状物，不利于大规模制备。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提出一种利用高分子溶液相分离原理，结合乳液法制备多孔水凝胶孔微球的工艺。主要通过在水凝胶前驱体溶液中加入可致相分离的另一种聚合物，水凝胶前驱体溶液发生相分离形成两相乳液。将该前驱体溶液与油性物质制备成油包水乳液后交联油中微球，再用水浸泡微球，使致孔相聚合物溶出，随后脱水干燥。用水再次溶胀即可得到多孔水凝胶微球。

本发明的目的在于提供一种制备多孔水凝胶微球的新思路。该方法制备的多孔水凝胶微球具有良好的生物相容性，能够促进细胞快速增殖与伸展，可作为良好的组织工程支架，在组织工程领域具有巨大的应用潜能。使用本方案制备的多孔水凝胶微球，无需进行二次致孔处理，简化了制备工艺。

一种多孔水凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)将乳化剂溶于油性溶剂中，制备油相；

(2)将可自由基交联水溶性聚合物、牺牲组分聚合物、引发剂溶于水中，制备前驱体溶液；

(3)将上述前驱体溶液加入到步骤(1)中制备的油相中，搅拌形成油包水乳液，后进行交联反应，反应结束后，后处理得所述多孔水凝胶微球。

上述技术方案中，步骤(1)中：

作为优选，所述乳化剂与油性溶剂的质量比为(0.1～2)：100。

作为优选，所述油性溶剂为植物油(如大豆油、花生油、蓖麻油等)、矿物油、液体石蜡中的一种或多种。作为进一步优选，所述油性溶剂为液体石蜡。

作为优选，所述乳化剂为亲油性乳化剂司班、亲水性乳化剂吐温中的一种或两种的混合。进一步优选为司班80。

作为优选，将乳化剂加入到油性溶剂中，加热搅拌溶解，加热温度为20℃～80℃。进一步优选为，加热温度为60℃。

上述技术方案中，步骤(2)中：

作为优选，所述可自由基交联水溶性聚合物为烯烃双键改性水溶性聚合物。

作为优选，所述可自由基交联水溶性聚合物为明胶、透明质酸、海藻酸、葡聚糖、丝素蛋白、葡聚糖、硫酸软骨素、羧甲基壳聚糖、羟丙甲纤维素、聚乙烯醇、聚谷氨酸、聚赖氨酸中的一种或多种的双键改性物。

作为进一步优选，所述可自由基交联水溶性聚合物为明胶、透明质酸中的一种或两种的双键改性物。

作为进一步优选，所述双键改性物为丙烯酰基或甲基丙烯酰基改性物；

所述前驱体溶液中，所述可自由基交联水溶性聚合物的浓度为0.5～15％g/mL；

所述牺牲组分聚合物与所述可自由基交联水溶性聚合物的质量比为(0.1～2.5)：1。

作为优选方案，所述双键改性物为甲基丙烯酰基改性物。

作为优选，所述可自由基交联水溶性聚合物为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)。

作为优选，所述牺牲组分聚合物为透明质酸、明胶、聚乙二醇、聚氧化乙烯(PEO)、葡聚糖、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、拉伯树胶、聚乙烯醇(PVA)、丝素蛋白或丝胶蛋白中的一种或多种。

作为进一步优选，所述可自由基交联水溶性聚合物为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)，所述牺牲组分聚合物为聚氧化乙烯(PEO)；

或者，所述可自由基交联水溶性聚合物为甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)，所述牺牲组分聚合物为聚乙烯醇(PVA)。

作为优选，所述引发剂为水溶自由基引发剂。

作为进一步优选，所述引发剂为水溶性光引发剂或水溶性热引发剂。

作为进一步优选，所述引发剂为热引发剂时，所述交联反应为热交联反应，反应过程在加热搅拌状态下进行；

所述引发剂为光引发剂时，所述交联反应为光交联反应，反应时将光源从搅拌器皿外侧进行照射。

更进一步优选为，所述水溶性光引发剂为I2959、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)、VA086中的一种或多种。进一步优选为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)。

更进一步优选为，所述水溶性热引发剂为过硫酸钠(SPS)、过硫酸铵(APS)、过硫酸钾(KPS)中的一种或多种。进一步优选为过硫酸钠(SPS)。

作为优选，所述可自由基交联水溶性聚合物为甲基丙烯酰化明胶，所述前驱体溶液中，所述甲基丙烯酰化明胶的浓度为1～15％g/mL；

所述牺牲组分聚合物与甲基丙烯酰化明胶的质量比为(0.5～10)：5。

作为优选，所述可自由基交联水溶性聚合物为甲基丙烯酰化透明质酸，所述前驱体溶液中，所述甲基丙烯酰化透明质酸的浓度为0.5～10％g/mL；

所述牺牲组分聚合物与甲基丙烯酰化透明质酸的质量比为(1～5)：2。

作为进一步优选，所述可自由基交联水溶性聚合物为甲基丙烯酰化明胶时，所述前驱体溶液中，所述甲基丙烯酰化明胶的浓度为4～6％g/mL；

所述可自由基交联水溶性聚合物为甲基丙烯酰化透明质酸时，所述前驱体溶液中，所述甲基丙烯酰化透明质酸的浓度为1～3％g/mL。

作为进一步优选，所述可自由基交联水溶性聚合物为甲基丙烯酰化明胶，所述牺牲组分聚合物为聚氧化乙烯时，聚氧化乙烯与甲基丙烯酰化明胶的质量比为(0.5～2)：5。

作为进一步优选，所述可自由基交联水溶性聚合物为甲基丙烯酰化透明质酸，所述牺牲组分聚合物为聚乙烯醇时，聚乙烯醇与甲基丙烯酰化透明质酸的质量比为(1～2)：1。

作为优选，所述可自由基交联水溶性聚合物、牺牲组分聚合物、引发剂在水中加热搅拌溶解，加热温度为20～80℃，加热时间为15～120min。进一步优选为45～55℃下加热20～30min。

上述制备方法中，步骤(3)中：

作为优选，所述前驱体溶液与油相的体积比为(0.1～10)：100。作为进一步优选，所述前驱体溶液与油相的体积比为(4～6)：100。

作为优选，搅拌形成油包水乳液时，搅拌速度为250～600r/min。进一步优选为450～550r/min。

作为优选，步骤(2)中，所述引发剂为光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)，所述前驱体溶液中，所述苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)的浓度为0.1～1％g/mL。

步骤(4)中，所述交联反应的反应光源为365～450nm波段光源，光源光强为20～200mW/cm

作为进一步优选，所述前驱体溶液中，所述苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)的浓度为0.2～0.3％g/mL；

所述光源波长为390～420nm，光源强度为80～120mW/cm

作为优选，步骤(2)中，所述引发剂为热引发剂过硫酸钠(SPS)，所述前驱体溶液中，所述过硫酸钠(SPS)的浓度为1～5％g/mL。

步骤(4)中，所述交联反应的反应温度为50～80℃，反应时间为0.5～3h。

作为进一步优选，所述前驱体溶液中，所述过硫酸钠(SPS)的浓度为3～4％g/mL；

所述反应温度为55～65℃，反应时间为0.5～2h。

作为优选，反应结束后，进行如下后处理：

将反应液降温，静置后去除上层油相，依次经洗涤、浸泡、脱水、干燥即得所述多孔水凝胶微球。

作为进一步优选，将反应液静置并冷却至室温，待微球沉降后，去除上层油相，得微球乳液。

作为进一步优选，洗涤过程为：

上述微球乳液中加入其2倍体积的有机溶剂，搅拌洗涤后静置，倒去上清液。此过程重复三次以洗去油相和残留乳化剂。随后使用等体积乙醇洗涤以除去有机溶剂，得洗涤微球。

作为更进一步优选，所述有机溶剂为乙醚、正己烷、石油醚、乙醇、甲醇中的一种；进一步优选为乙醚。

作为进一步优选，浸泡过程为：

将上述洗涤微球用0.01mol/L的PBS溶液浸泡后，用去离子水浸泡，后倒去上清液，得浸泡微球。

作为优选，所述PBS溶液与洗涤微球的体积比为(1～10)：1；进一步优选为(4～6)：1。

作为优选，采用PBS溶液浸泡洗涤微球的浸泡时间为0.5～2h；进一步优选为50～70min。

作为优选，采用PBS溶液浸泡时，重复浸泡2～5次；进一步优选为2～3次。

作为优选，去离子水浸泡的浸泡时间为0.5～2h；进一步优选为50～70min。

作为优选，采用去离子水浸泡时，重复浸泡2～5次；进一步优选为2～3次。

作为优选，脱水过程为：

1、向上述所得浸泡微球中加入等体积的50％乙醇，浸泡后倒去上清液；

2、加入与上述处理后的浸泡微球等体积的无水乙醇浸泡后倒去上清，重叠两次，即得脱水微球。

作为优选，干燥过程为：将上述脱水微球自然晾干、烘干或冻干，得干燥微球；进一步优选为冻干。

上述制得的多孔水凝胶微球使用时直接接触水溶液溶胀即可。

一种多孔水凝胶微球，由上述任一项所述的多孔水凝胶微球的制备方法制备得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的多孔水凝胶微球的制备方法，通过在水凝胶前驱体溶液中加入致相分离的另一种聚合物(致孔聚合物)，利用乳液聚合，形成油包水乳液，并在形成微球的过程中成孔，成孔完成后溶出致孔聚合物即能得到多孔水凝胶微球。该制备过程无需二次致孔处理，简化了制备工艺，过程简单，易控制；采用该制备方法制得的多孔水凝胶微球具有良好的生物相容性，能够促进细胞快速增值与伸展，可作为良好的组织工程支架，在组织工程领域具有巨大的应用潜能。

本发明提供了一种制备多孔水凝胶微球的新思路，适用于光固化水凝胶、甚至其它交联方式如离子、温度、交联剂交联的水凝胶，只需满足可以形成相分离乳液墨水即可，具有广泛的意义。使用多孔水凝胶制备的多孔微球，在成球的同时即可成孔，制备方法简便高效。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1多孔水凝胶微球制备流程图；

图2实施例1多孔GelMA微球；

图3实施例6多孔HAMA微球。

具体实施方式

为了使得本发明更容易理解，本发明结合说明书附图和以下实施例对本发明的技术方案做进一步说明。其中，实施例1～8的水凝胶微球的制备均按照图1的流程制备。

实施例1：

如图1所示：

1)将0.1g司班80加入100g液体石蜡中(乳化剂：油性溶剂＝0.1:100)，60℃搅拌溶解，制备油相；

2)向10mL去离子水中加入0.5g GelMA(5％)、0.025g引发剂LAP(0.25％)和0.1gPEO(1％)于50℃避光加热搅拌溶解，得到水凝胶前驱体溶液；

3)将上述步骤2)中的1mL前驱体溶液加入到20mL步骤1)制备的油相中以速度500r/min加热搅拌20min，形成油包水乳液；

4)以光强为100mW/cm

5)反应结束后，停止加热及搅拌，使体系温度降至室温，倒去上层油相；

6)加入与剩余产物(去除油相后的下层)2倍体积的乙醚洗涤，此过程重复三次，倒去洗涤液。

7)向上述洗涤后的产物中加入5倍体积0.01mol/LPBS溶液，浸泡1h，重复2次，倒去上清液；

8)向上一步中PBS溶液浸泡过的产物中加入5倍体积的去离子水，浸泡1h，重复2次，倒去上清液；

9)向上一步中去离子水浸泡过的产物中加入等体积50％乙醇，浸泡后倒去上清；

10)向上一步中50％乙醇浸泡过的产物中加入等体积无水乙醇，浸泡后倒去上清，重复2次；

11)将上述经无水乙醇脱水后的产物冻干，得到如图2所示的多孔GelMA微球。

实施例2～4：

按照下表1中对应的添加物料及添加量，以实施例1相同的操作步骤，制备实施例2～4的多孔水凝胶微球。

表1 实施例2～4的添加物料及添加量

实施例5：

如图1所示：

1)将0.1g司班80加入100g液体石蜡中(乳化剂：油性溶剂＝0.1:100)，60℃搅拌溶解，制备油相。

2)向10mL去离子水中加入0.5g GelMA(5％)、0.2g引发剂过硫酸钠(SPS)(2％)和0.1g PEO(1％)于50℃避光加热搅拌溶解，得到水凝胶前驱体溶液；

3)将上述步骤2)中的1mL前驱体溶液加入到20mL步骤1)制备的油相中以速度500r/min加热搅拌20min，形成油包水乳液；

4)将上述油包水乳液在60℃加热搅拌1h，使微球发生交联反应；

5)反应结束后，停止加热及搅拌，使体系温度降至室温，倒去上层油相；

6)加入与剩余产物(去除油相后的下层)2倍体积的乙醚洗涤，此过程重复三次，倒去洗涤液。

7)向上述洗涤后的产物中加入5倍体积0.01mol/LPBS溶液，浸泡1h，重复2次，倒去上清液；

8)向上一步中PBS溶液浸泡过的产物中加入5倍体积的去离子水，浸泡1h，重复2次，倒去上清液；

9)向上一步中去离子水浸泡过的产物中加入等体积50％乙醇，浸泡后倒去上清；

10)向上一步中50％乙醇浸泡过的产物中加入等体积无水乙醇，浸泡后倒去上清，重复2次；

10)将上述经无水乙醇脱水后的产物冻干，得到的冻干产物即多孔水凝胶微球。

实施例6～8：

按照下表2中对应的添加物料及添加量，以实施例5相同的操作步骤，制备实施例6～8的多孔水凝胶微球。图3为实施例6中制得的多孔HAMA水凝胶孔结构图。

表2 实施例6～8的添加物料及添加量

上述实施例1～8中制得的多孔水凝胶微球在0.01mol/L PBS溶液中溶胀平衡后的尺寸和孔隙率如下表3所示。

表3 不同多孔水凝胶微球溶胀平衡后尺寸及孔隙率

由表3可知，利用本发明方法，通过参数的合理调整，可以得到不同直径，不同孔隙率的微球产品。