用于选择母鸡产蛋10天受精率的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于家畜繁殖性状的分子标记选择技术领域，具体涉及1个与母鸡产蛋10天受精率相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

小窝是位于细胞原生质膜(PM)上深度为50-75nm的凹陷，是膜脂筏(membranelipid rafts，MLR)的一种，其由三种小窝蛋白(caveolin,cav-1、cav-2和cav-3)组成，它们在小窝内通过棕榈酰化的半胱氨酸残基插入，固定于原生质膜的内小叶。Cav-1是小窝蛋白的主要结构蛋白，在人体中，已经对Cav-1基因的功能有了许多的研究，Cav-1基因rs3807989多态性与心房颤动(AF)易感性之间存在显着关联，Cav-1也与细胞极化和定向转移有着密切的关系,Cav-1在小鼠细胞损伤后肝内脂质代谢与增殖反应的协调机制中也起着至关重要的作用,已有文献表明Cav-1与胆固醇有着相当密切的联系,而某些性激素的合成原料就是胆固醇，如雌二醇，由此怀疑Cav-1基因的变异是否会引起母鸡的某些繁殖性能(如受精率)发生改变。

本发明在caveolin-1基因的外显子3上发现了一个SNP，利用限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP，restricted fragment length polymorphism)分析方法在大群体里对测序所得的SNP与母鸡产蛋10天受精率进行关联分析，可进一步确定SNP的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于选择母鸡产蛋10天受精率的SNP分子标记及其应用，通过限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP)分析发现1号染色体caveolin-1基因多态性与母鸡产蛋10天受精率相关联。

为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

用于选择母鸡产蛋10天受精率的SNP分子标记，位于1号染色体caveolin-1基因，多态性位点位于该染色体第25216421位碱基，其碱基为A或G，包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，第43位碱基R是A或G。

上述SNP分子标记通过下述方法筛选获得：

1)实验样品采集：采集试验鸡血样用于DNA提取；人工授精后收集试验鸡产蛋用于测定母鸡受精率性状；

2)母鸡产蛋10天受精率的测定：测量试验鸡一次人工授精10天后母鸡产受精蛋个数和总产蛋个数的百分比，重复测量三次，取三次所测结果的平均值，作为该试验鸡的储精期间受精率的表型值；

3)鸡基因组DNA的提取与检测：从试验鸡血样中提取鸡基因组DNA，制备母鸡全基因组DNA样品；

4)基因型判定及基因型与鸡产蛋10天受精率的关联分析：

对907只母鸡进行了产蛋10天受精率的测定，利用所提取的DNA样品进行PCR-RFLP分析，利用SPSS统计分析软件将PCR-RFLP分析结果与产蛋10天受精率表型值进行关联分析，证实了这个SNP位点的多态性与母鸡产蛋后期产蛋率显著关联(P<0.05)，SNP位点的等位基因均为G，则是母鸡受精率的有利标记，可以用于母鸡产蛋后期受精率的选择及改良。

上述SNP分子标记在母鸡受精率选择或改良中的应用，具体方法如下：

提取鸡基因组DNA，利用引物(SEQ ID NO.2和3)扩增产物，经Bst4CI酶切后，AA基因型显示1条带(124bp)，GG基因型显示1条带(146bp)，杂合子AG显示2条带(146bp+124bp)，等位基因均为G，是母鸡受精率的有利标记。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

采用限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP，restricted fragment lengthpolymorphism)分析方法在907只的群体里对这个SNP与母鸡产蛋10天受精率的相关性进行了关联分析。利用分子标记辅助育种，为对母鸡产蛋10天受精率进行选择和改良提供了1个新的SNP分子标记。

上述研究工作在国家重点研发计划(2017YFE0113700；2018YFD0501301)，国家基金(项目编号：31772585)，湖北省畜禽优质增效与绿色养殖科技创新行动(项目编号：2018skjcx05)，华中农业大学自主创新基金(2662018PY088)及现代农业技术教育部国际合作联合实验室的共同资助下完成。

附图说明

图1为caveolin-1基因的测序结果。

图2为caveolin-1基因PCR-RFLP酶切图谱。M：Marker I，第1、3、5、7、9、11、12、13、15、17、19泳道为AA型，第2、8、10、14、18、20、21、22、23、24泳道为AG型，第4、6、16泳道为GG型。

具体实施方式

与母鸡产蛋10天受精率相关的SNP分子标记的筛选与验证

本发明发现caveolin-1基因外显子3序列中有一个位于1号染色体第25216421位碱基的SNP位点，其碱基为A或G，导致了Bst4CI酶切位点的改变，进一步利用PCR-RFLP技术检测发现SNP位点在母鸡群体中的分布，以验证该SNP位点的多态性与母鸡产蛋10天受精率的相关性。

1)实验样品采集：

试验群体为907只健康母鸡，来源于“京红1号”蛋鸡核心育种鸡场父母代群体(400日龄)，所有母鸡同批次孵化而来。饲养于荆州峪口禽业有限公司，执行单笼饲养，14小时光照制度，自由采食及饮水。在饲养期间，温度、湿度、通风、光照等条件均相同，为常规方法。

2)鸡产蛋10天受精率的测定：

以10天为一个周期，对公鸡一次采精，精液中要求无粪便、羽屑、血液污染，否则一律废弃。利用混合精液对母鸡进行输精(25微升/只)，输精时避免输精器械的刺激，同时为避免发生输精感染，做到每输精一次后，更换一次输精器头。具体操作按照《鸡人工授精技术规程》(DB12/T290—2006)执行。收集种蛋并标记笼号。同批次种蛋恒温孵化(37.8℃，相对湿度50％)7天后照蛋，记录受精与未受精的种蛋。

测量试验鸡一次人工授精后记录鸡产蛋10天受精蛋个数与此期间母鸡产蛋的百分比作为母鸡储精期间受精率的表型，重复测量三次，取三次所测结果的平均值，作为该试验鸡的母鸡储精期间受精率表型值。

母鸡储精期间受精率性状测定实验结束后，对试验鸡群翅下静脉采血0.5mL，置于1.5mL事先加入0.3mL抗凝剂的EP管中，混匀后-20℃保存以备DNA提取。

3)鸡基因组DNA的提取与检测：

采用苯酚-氯仿法从试验鸡血样中提取鸡基因组DNA，再用凝胶电泳判断DNA的完整性；对提取后的DNA进行质量检测；调整浓度至50ng/μL，制备母鸡全基因组DNA样品。

4)基因型判定及基因型数据与母鸡产蛋10天受精率的关联分析：

引物序列：

CAV-E3-F206:AAAATACTGGTTTTATCGCT(SEQ ID NO.2)

CAV-E3-R332:TGCACTGGATCTCAATCAGG(SEQ ID NO.3)

反应体系：2×PCR缓冲液(含Taq酶等)5μL；CAV-E3-F206：0.12μL(10μM)；CAV-E3-R332：0.12μL(10μM)；DNA模板：1.2μL；ddH

扩增条件：95℃5min；(95℃30s；51.5℃30s；72℃30s)35个循环；72℃5min；25℃1min。

酶切及电泳：PCR产物5.0μL，10×酶切缓冲液1.0μL，ddH

扩增产物经Bst4CI酶切后可被切为22bp和124bp两个片段，其中AA基因型显示1条带(124bp)，GG基因型显示1条带(146bp)，杂合子AG显示2条带(146bp+124bp)，各种基因型见图2。

5)分析结果

我们利用已测定母鸡产蛋10天受精率的群体共907只母鸡，对该SNP进行限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)，比较不同基因型个体的母鸡产蛋10天受精率，从表1结果可以看出，这个SNP位点的多态性与母鸡产蛋10天受精率显著关联(P<0.05)，GG基因型是母鸡受精率的有利标记。

表1 SNP位点与母鸡产蛋10天受精率关联分析结果

注：10天受精率：母鸡人工授精后10天内所产鸡蛋中受精蛋的比例；性状中具有不同肩标的SNP基因型之间表示差异显著(P<0.05)。*表示差异显著，P<0.05，表中性状值(10天受精率)为平均数±标准差。

序列表

<110> 湖北欣华生态畜禽开发有限公司

<120> 用于选择母鸡产蛋10天受精率的SNP分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttttaccact ttcactgtaa caaaatactg gttttatcgc ttrctgtcag caatctttgg 60

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaatactgg ttttatcgct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcactggat ctcaatcagg 20