聚合物复合微载体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种聚合物复合微载体及其制备方法，具体涉及一种胶原补丁结构聚合物微载体及其可控制备方法，属于细胞扩增技术领域。

背景技术

目前，MSCs属于贴壁型细胞，传统的二维培养扩增效率低下，已无法满足用于临床实验的细胞需求，并且，传统二维培养会导致细胞特异性外泌体改变、特异性形态和表型丧失。微载体是由天然大分子物质，如蛋白、多糖等或合成高分子聚合物组成的具有一定尺寸和比表面积的微粒，可以支持贴壁细胞的粘附和生长，高比表面积的微载体作为三维培养的平台受到了越来越多的关注与研究。但是目前，微载体的研发和市场化应用中仍然存在着很多问题，主要包括微载体的可控制备技术、微载体的修饰和应用拓展以及微载体结构的精确调控等。涂层是微载体常用的修饰方法，同时存在效率低、脱落、粘附、组分含量不可控等缺点。

微球的传统制备方法主要有乳化/溶剂挥发法、喷雾干燥法、超临界CO

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种聚合物复合微载体及其制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

聚合物复合微载体，其特征在于：由球形主体的合成高分子聚合物以及补丁区的天然大分子构成。

进一步地，上述的聚合物复合微载体，其中，以聚合物复合微载体的总质量百分比计算，补丁区天然大分子的质量百分比为5％～40％，球形主体合成高分子聚合物的质量百分比为60％～95％。

进一步地，上述的聚合物复合微载体，其中，合成高分子聚合物为聚乳酸PLA、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、聚乙醇酸PGA或者聚己内酯PCL。

进一步地，上述的聚合物复合微载体，其中，天然大分子为胶原、明胶、壳聚糖或者丝素蛋白。

本发明聚合物复合微载体的制备方法，利用水包油包水复合乳液和溶剂挥发原理，通过管道组合、管道尺寸控制初乳液和水相流动，通过两相微通道的尺寸调控聚合物复合微载体的尺寸，包括以下步骤：

步骤1)，取天然大分子溶于水中，所得溶液作为初乳液分散相W；

步骤2)，取合成高分子聚合物溶于易挥发有机溶剂中，所得溶液作为初乳液连续相O；

步骤3)，取步骤一与步骤二溶液进行机械均质，所得油包水初乳液作为内通道流体W/O；

步骤4)，取亲水性表面活性剂溶于去离子水，作为外通道流体W

步骤5)，使W/O与W

步骤6)，步骤5)得到的复合乳液被接收于单独的W

更进一步地，上述的聚合物复合微载体的制备方法，其中，通过调控初乳液W/O、外水相W

更进一步地，上述的聚合物复合微载体的制备方法，其中，内通道初乳液W/O的流量为1mL/h～15mL/h，外通道表面活性剂水溶液W

更进一步地，上述的聚合物复合微载体的制备方法，其中，管道组合为Y型、T型、同向流动型或者流动聚焦型。

更进一步地，上述的聚合物复合微载体的制备方法，其中，内通道直径为100μm～400μm，外通道直径为300μm～800μm。

更进一步地，上述的聚合物复合微载体的制备方法，其中，易挥发有机溶剂为甲醇、二氯甲烷、氯仿或者丙酮，合成高分子聚合物有机溶剂溶液中聚合物的浓度是2wt％～5wt％；天然大分子水溶液中大分子的浓度是1wt％～10wt％；合成高分子聚合物有机溶剂溶液与天然大分子水溶液的体积比为5：1～2：1。

更进一步地，上述的聚合物复合微载体的制备方法，其中，亲水性表面活性剂为聚丙烯酸钠ASAP、聚乙烯醇PVA或者聚乙烯吡咯烷酮PVP；表面活性剂水溶液的浓度为0.5wt％～4wt％。

本发明与现有技术相比具有显著的优点和有益效果，具体体现在以下方面：

①利用水包油包水复合乳液和溶剂挥发原理，通过不同管道组合、尺寸选择和流速控制，使聚合物复合微载体具备单一分散性、清晰分明的补丁结构；通过初乳液油水相浓度、体积比，调控聚合物复合微载体的内部结构和组成；

②利用微流体间的剪切力及表面张力，制备聚合物复合微乳液滴(W/O/W)粒径均一、组成一致；采用静置方式，使中间油相中的有机溶剂充分挥发，聚合物复合微乳液滴逐步皱缩为聚合物复合微载体；采用去离子水冲洗方式，去除残余在聚合物复合微载体表面的亲水性表面活性剂；采用冷冻干燥的方式，使聚合物复合微载体在溶液中与去离子水预冷冻形成固态，冷冻干燥后，即可收集得到干燥的聚合物复合微载体，制得的聚合物复合微载体大小均匀一致；

③利用合成高分子聚合物和天然大分子材料，使微载体具有良好的机械性能、细胞粘附性能以及促进细胞成骨分化性能；同时，合成高分子聚合物作为微载体的主体，保证了微载体的成球性并使微载体降解周期达到几个月，使其适宜作为组织工程支架、作为可植入型细胞载体，并可成为多功能的细胞扩增与骨组织修复的平台；

④聚合物复合微载体可用于细胞扩增及组织再生支架材料，符合生产需求，同时具有生物相容性的合成高分子聚合物成分，且具有细胞结合位点的天然大分子材料，并通过合理的组分配比和结构调控，使聚合物复合微载体能促进细胞粘附/增殖、成骨分化，实现细胞扩增以及骨组织的修复。

本发明的其他特征和优点将在随后的说明书阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明具体实施方式了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1：两相微通道示意图；

图2：PLGA-Col复合微载体的扫描电镜图；

图3：PLGA-Col复合微载体的光学显微镜图；

图4：PLGA-Col复合微载体的尺寸分布图；

图5：PLGA-Col复合微载体上细胞的CCK-8测试图；

图6：PLGA-Col复合微载体上细胞的ALP活性图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。同时，在本发明的描述中，方位术语和次序术语等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

实施例1：

制备嵌入胶原的补丁式复合微载体PLGA-Col；

将150mg的Ⅰ型胶原加入到10mL的0.1M醋酸溶液中，作为初乳液内水相；将PLGA溶解于二氯甲烷中，制备3.6wt％的PLGA的二氯甲烷溶液，作为初乳液油相；将聚乙烯醇溶解于去离子水中，制备得到2wt％的聚乙烯醇溶液，作为制备复合微载体的外水相；将聚乙烯醇溶解于80℃的水，制备得到0.5wt％的聚乙烯醇溶液，作为复合微乳液滴的接收液；

胶原水乳液与PLGA的DCM溶液以1：5的体积比6000rpm均质2min；

初乳液注入两相微流控装置的内通道，如图1，内通道的直径设置为300μm，注射速率为10mL/h；2wt％的PVA水溶液注入微流体的外水相通道，外相通道的直径设置为780μm，注射速率为30mL/h；

利用流体的剪切作用，以0.5wt％的聚乙烯醇溶液为接收液，获得尺寸均一的内嵌胶原溶液的复合微乳液滴，静置48小时，用去离子水洗涤五次，冷冻干燥24小时后得到内嵌胶原的补丁式PLGA-Col复合微载体；

24孔板的每个孔中加入20mg微载体以覆盖底面，微载体通过浸入75％乙醇(1mL/孔)0.5h、UV照射12小时灭菌，然后将大鼠骨髓间充质干细胞以2×10

MSCs培养3天和5天后，通过Cell Counting Kit-8对细胞增殖水平进行量化，使用酶标仪在450nm处测量每个孔的吸光度(ABS)值；

为研究在微载体上培养的细胞的成骨潜力，细胞在微载体上于生长培养基中培养3天后更换为成骨培养基；细胞成骨诱导4天和7天后，分别用ALP试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒测定细胞的ALP活性和总蛋白含量；通过酶标仪在520nm处测量每个孔的OD值；对ALP活性测试值以总蛋白含量进行归一化处理，以排除细胞数量对测试结果的影响；

经扫描电子显微镜与光学显微镜观察，PLGA-Col补丁式微载体直径约为165μm，呈现光滑/多孔非对称结构，如图2)，胶原补丁集中于一侧如图3，尺寸呈现高度的单分散性，如图4；

通过CCK-8结果可说明，PLGA-Col补丁式微载体对细胞增殖具有显著的促进作用，如图5，培养5天后，细胞的数量是培养3天的2.58倍；

通过ALP结果可说明，PLGA-Col补丁式微载体对间充质干细胞成骨分化有明显的促进作用，如图6。

实施例2：

制备嵌入胶原的补丁式复合微载体PLGA-Col-2；

将800mg的Ⅰ型胶原加入到10mL的0.1M醋酸溶液中，作为初乳液内水相；将PLGA溶解于二氯甲烷中，制备3.6wt％的PLGA的二氯甲烷溶液，作为初乳液油相；将聚乙烯醇溶解于去离子水中，制备得到2wt％的聚乙烯醇溶液，作为制备复合微载体的外水相；将聚乙烯醇溶解于80℃的水，制备得到0.5wt％的聚乙烯醇溶液，作为复合微乳液滴的接收液；

胶原水乳液与PLGA的DCM溶液以2：5的体积比6000rpm均质2min；

初乳液注入两相微流控装置的内通道，如图1，内通道的直径设置为300μm，注射速率为10mL/h；2wt％的PVA水溶液注入微流体的外水相通道，外相通道的直径设置为780μm，注射速率为30mL/h；

利用流体的剪切作用，以0.5wt％的聚乙烯醇溶液为接收液，获得尺寸均一的内嵌胶原溶液的复合微乳液滴，静置48小时，用去离子水洗涤五次，冷冻干燥24小时后得到内嵌胶原的补丁式PLGA-Col复合微载体；

24孔板的每个孔中加入20mg微载体以覆盖底面，微载体通过浸入75％乙醇(1mL/孔)0.5h、UV照射12小时灭菌，然后将大鼠骨髓间充质干细胞以2×10

MSCs培养3天和5天后，通过Cell Counting Kit-8对细胞增殖水平进行量化，使用酶标仪在450nm处测量每个孔的吸光度(ABS)值；

为研究在微载体上培养的细胞的成骨潜力，细胞在微载体上于生长培养基中培养3天后更换为成骨培养基；细胞成骨诱导4天和7天后，分别用ALP试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒测定细胞的ALP活性和总蛋白含量；通过酶标仪在520nm处测量每个孔的OD值；对ALP活性测试值以总蛋白含量进行归一化处理，以排除细胞数量对测试结果的影响；

经扫描电子显微镜与光学显微镜观察，PLGA-Col-2补丁式微载体直径约为165μm，呈现光滑/多孔非对称结构，胶原补丁集中于一侧，且胶原补丁区比实施例1中呈现的更大，微载体的尺寸仍呈现高度的单分散性；

通过CCK-8结果表明，PLGA-Col-2补丁式微载体对细胞增殖具有显著的促进作用，对细胞增殖的促进作用和实施例1一样，没有显著性差异；

通过ALP结果可说明，PLGA-Col-2补丁式微载体对间充质干细胞成骨分化有明显的促进作用，在同样的时间点，可以达到实施例1的1.3倍。

对比例1：

制备单纯微载体PLGA；

将PLGA溶解于二氯甲烷中，制备3.6wt％的PLGA的二氯甲烷溶液，作为油相；将聚乙烯醇溶解于去离子水中，制备得到2wt％的聚乙烯醇溶液，作为制备复合微载体的外水相；将聚乙烯醇溶解于80℃的水，制备得到0.5wt％的聚乙烯醇溶液，作为微乳液滴的接收液；

PLGA油相注入两相微流控装置的内通道，如图1，内通道的直径设置为300μm，注射速率为10mL/h；2wt％的PVA水溶液注入微流体的外水相通道，外相通道的直径设置为780μm，注射速率为30mL/h；

利用流体的剪切作用，以0.5wt％的聚乙烯醇溶液为接收液，获得尺寸均一的微乳液滴，静置48小时，用去离子水洗涤五次，冷冻干燥24小时后得到单纯PLGA微载体；

24孔板的每个孔中加入20mg微载体以覆盖底面，微载体通过浸入75％乙醇(1mL/孔)0.5h、UV照射12小时灭菌，然后将大鼠骨髓间充质干细胞以2×10

MSCs培养3天和5天后，通过Cell Counting Kit-8对细胞增殖水平进行量化，使用酶标仪在450nm处测量每个孔的吸光度(ABS)值；

为研究在微载体上培养的细胞的成骨潜力，细胞在微载体上于生长培养基中培养3天后更换为成骨培养基；细胞成骨诱导4天和7天后，分别用ALP试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒测定细胞的ALP活性和总蛋白含量；通过酶标仪在520nm处测量每个孔的OD值；对ALP活性测试值以总蛋白含量进行归一化处理，以排除细胞数量对测试结果的影响；

经扫描电子显微镜与光学显微镜观察，PLGA微载体直径约为165μm，呈现光滑对称结构，微载体的尺寸呈现高度的单分散性；

通过CCK-8结果表明，PLGA微载体也可以支持细胞增殖，对细胞增殖的促进作用在第三天仅达到实施例1的45％，而在第五天仅达到实施例1的27％；

通过ALP结果可说明，PLGA微载体对间充质干细胞成骨分化的促进作用较弱，在同样的时间点，仅达到实施例1的66％。

具有生物相容性和可生物降解的合成高分子聚合物成分，且具有细胞附着位点的天然大分子，并通过合理的成分配比和结构调控，使复合微载体能用于细胞扩增与组织修复，实现到对复合微载体组成与结构的精准调控。与常规的微载体相比，本发明根据水包油包水复乳液和溶剂挥发原理，通过制备过程所用的管道组合、管口直径和流速控制，使复合微载体具备单一分散性和促进间充质干细胞(MSCs)粘附/增殖与成骨分化的补丁结构。制备的聚合物复合微载体具有适合细胞生长的粒径，集中单一的粒径分布，生物可降解性，聚合物复合微载体内部具有清晰分明的补丁结构；通过改变合成聚合物与天然大分子的质量比，实现精确调控聚合物微载体的形貌与结构，同时，天然大分子含量较低的微载体对MSCs粘附/增殖已有明显的促进效应，而天然大分子含量较高的微载体对MSCs成骨分化具有明显的促进效应。

综上所述，本发明利用水包油包水复合乳液和溶剂挥发原理，通过不同管道组合、尺寸选择和流速控制，使聚合物复合微载体具备单一分散性、清晰分明的补丁结构；通过初乳液油水相浓度、体积比，调控聚合物复合微载体的内部结构和组成。

聚合物复合微载体可用于细胞扩增及组织再生支架材料，符合生产需求，同时具有生物相容性的合成高分子聚合物成分，且具有细胞结合位点的天然大分子材料，并通过合理的组分配比和结构调控，使聚合物复合微载体能促进细胞粘附/增殖、成骨分化，实现细胞扩增以及骨组织的修复。

利用合成高分子聚合物和天然大分子材料，使微载体具有良好的机械性能、细胞粘附性能以及促进细胞成骨分化性能；同时，合成高分子聚合物作为微载体的主体，保证了微载体的成球性并使微载体降解周期达到几个月，使其适宜作为组织工程支架、作为可植入型细胞载体，并可成为多功能的细胞扩增与骨组织修复的平台。

合成高分子聚合物可内嵌不同种类的天然大分子制备复合微载体，亦可用作多种贴壁型细胞的生长载体。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。