一种基于QuEChERS法结合UPLC-MS/MS的吡咯里西啶碱检测方法及应用

技术领域

本发明涉及吡咯里西啶碱检测领域，尤其涉及一种基于QuEChERS法结合UPLC-MS/MS的吡咯里西啶碱检测方法及应用。

背景技术

我国是茶叶大国，生产的茶叶享誉全球。近年来，随着欧洲一份监测中发现85％茶叶中有吡咯里西啶碱(Pyrrolizidine alkaloids,PAs)检出，使得PAs成为继农药等污染物外茶叶中一种新型的外源污染物，成为我国茶叶出口受阻的主要污染物之一。

PAs是植物次生代谢产生的一类天然毒素，其中的不饱和PAs及大部分PAs的氮氧化物具有多种毒性，可通过植物源污染食品从而威胁人类健康。目前，在奥地利、德国、比利时等许多欧洲国家已经对茶叶中PAs的污染起源与途径展开研究，这就需要建立较为完善的茶叶检测技术与监督体系。但已报道的茶叶中PAs的前处理方法多采用SPE小柱法，该方法不仅耗时长，洗脱溶剂量大且成本高，不利于茶叶中多种PAs的快速检测。

因此，灵敏度高、选择性强、耗时短、成本低的PAs检测技术亟待开发，从而为茶叶中PAs的污染来源分析提供检测手段，对茶园安全防控具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于QuEChERS法结合UPLC-MS/MS的吡咯里西啶碱检测方法及应用，该方法灵敏度高、选择性强、耗时短、成本低，且不仅适用于干茶、茶鲜叶、杂草样品中吡咯里西啶碱的检出，同样适用于土壤样品中吡咯里西啶碱的检出，为茶叶中PAs的污染来源分析提供检测手段。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种基于QuEChERS法结合UPLC-MS/MS的吡咯里西啶碱检测方法，包括如下步骤：

(1)提取

对目标样品进行化合物提取，获得含提取物的上清液；

(2)净化

取步骤(1)的上清液于盛有填料的离心管中，再依次进行涡旋、离心处理；接着，取离心后的净化液过滤膜，得净化液；其中，所述离心管中的填料由10mg石墨化碳黑(GCB)、20mg乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶(PSA)和15mg十八烷基硅烷键合硅胶(C

(3)检测

采用超高效液相色谱-质谱联用仪对步骤(2)所得的净化液进行检测分析；

色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱2.1mm×100mm，1.8μm；柱温：40℃；流动相A：添加有0.1％甲酸和1mM甲酸铵的水溶液；流动相B：添加有0.1％甲酸和1mM甲酸铵的甲醇溶液；流速：0.25mL/min；进样量：3μL；使用梯度洗脱程序；

质谱条件为：离子源，电离方式：电喷雾正离子源ESI+；毛细管电压：4.0kV；雾化器压力：7.0bar；锥孔回吹流量：150L/h；溶解温度：400℃；溶剂气体流量：800L/h；冲击气体流量：0.25mL/min；监视模式：多反应监视模式MRM。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，目标样品具体为同一茶园生态体系中的干茶、茶鲜叶、杂草或土壤；其中，所述干茶指利用所述茶鲜叶获得的市售成品茶叶。

作为本发明的优选方式之一，当所述目标样品为干茶、茶鲜叶或杂草时，步骤(1)的提取步骤具体为：采用粉碎机对干茶、茶鲜叶或杂草进行粉碎处理；称取1g粉碎后样品，加入10mL 0.1M硫酸溶液涡旋提取1min、超声提取15min，接着于10000rps/min条件下离心10min；将提取后剩余残渣再加入10mL 0.1M硫酸溶液，复提一次；合并两次提取的上清液，待净化。

作为本发明的优选方式之一，当所述目标样品为土壤时，步骤(1)的提取步骤具体为：称取1g经粉碎过筛处理的土壤样品，置于50mL离心管中；加入0.1mL 0.1M柠檬酸三钠溶液调节土壤pH，静置2min后，再加入10mL 0.1M硫酸甲醇涡旋提取2min；接着，振荡器振荡处理30min，超声提取30min，10000rps/min条件下离心8min；将提取后剩余残渣再加入10mL0.1M硫酸甲醇，复提一次；合并两次提取的上清液，待净化。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，取2mL步骤(1)的上清液于盛有填料的10mL离心管中，涡旋1min，10000rps/min条件下离心8min；接着，取1mL净化液过0.22μm滤膜，得净化液。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，采用超高效液相色谱-质谱联用仪对步骤(2)所得的净化液进行检测，最终获得样品中15种吡咯里西啶碱的含量结果。

作为本发明的优选方式之一，所述15种吡咯里西啶碱分别为天芥菜碱(He)、天芥菜碱氮氧化物(HeNO)、促黑激素(Im)、促黑激素氮氧化物(ImNO)、千里光碱(Jb)、千里光碱氮氧化物(JbNO)、欧天芥菜碱(Eu)、欧天芥菜碱氮氧化物(EuNO)、倒千里光碱(Re)、倒千里光碱氮氧化物(ReNO)、千里光宁碱(Sn)、千里光宁碱氮氧化物(SnNO)、千里光菲林碱(Sp)、千里光菲林碱氮氧化物(SpNO)、克氏千里光碱(Sk)。

一种如权利要求1-7任一所述的基于QuEChERS法结合UPLC-MS/MS的吡咯里西啶碱检测方法在确定茶叶中PAs污染来源方面的应用。

作为本发明的优选方式之一，采用所述基于QuEChERS法结合UPLC-MS/MS的吡咯里西啶碱检测方法对同一茶园生态体系中的干茶、茶鲜叶、杂草和土壤样品的吡咯里西啶碱含量进行检测，并根据检测结果分析茶叶中PAs的污染来源。

本发明相比现有技术的优点在于：

(1)液质检测时，样品本身的基质会造成目标化合物的干扰；本发明基于QuEChERS填料法提出一种有效去除样品中各种复杂基质等干扰成分的前处理方法，耗时短、成本低，结合超高效液相色谱-质谱联用的技术，提高了检测方法的准确度和灵敏度；

(2)本发明方法不仅适用于干茶、茶鲜叶、杂草样品中PAs的检出，还同样适用于土壤样品；当采用本发明方法对同一茶园生态体系中的干茶、茶鲜叶、杂草和土壤样品中15种PAs含量同时进行检测，可根据检测结果的对比，分析并确定出茶叶中PAs的真正污染来源，对茶园杂草等污染物防控、保障茶叶质量安全具有重要意义；

(3)本发明中土壤样品采用0.1mL 0.1M柠檬酸三钠溶液调节土壤pH，利于土壤样品中PAs的提取；

(4)本发明在UPLC-MS/MS检测的色谱条件中，流动相A采用添加有0.1％甲酸和1mM甲酸铵的水溶液，而非常规的水；流动相B采用添加有0.1％甲酸和1mM甲酸铵的甲醇溶液，非常规的纯甲醇溶液；可有效提高化合物的分离度和灵敏度，进一步提高检测的准确度。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种基于QuEChERS法结合UPLC-MS/MS快速测定干茶、茶鲜叶或杂草中吡咯里西啶碱的方法，包括如下步骤：

(1)提取

取30～40g干茶、茶鲜叶或杂草，采用粉碎机行粉碎处理，获得相应的干茶粉末(200目)、打碎的茶鲜叶或杂草匀浆；称取1g粉碎后样品，加入10mL 0.1M硫酸溶液涡旋提取1min、超声提取15min，接着于10000rps/min条件下离心10min；将提取后剩余残渣再加入10mL 0.1M硫酸溶液，复提一次；合并两次提取的上清液，待净化。

(2)净化

取2mL步骤(1)的上清液于盛有填料(GCB：PSA：C

(3)检测

采用超高效液相色谱-质谱联用仪对步骤(2)所得的净化液进行吡咯里西啶碱的检测分析。

色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱2.1mm×100mm，1.8μm；柱温：40℃；流动相A：水(0.1％甲酸+1mM甲酸铵)；流动相B：甲醇(0.1％甲酸+1mM甲酸铵)；流速：0.25mL/min；进样量：3μL；使用梯度洗脱程序见表1。

质谱条件为：离子源，电离方式：电喷雾正离子源(ESI+)；毛细管电压：4.0kV；雾化器压力：7.0bar；锥孔回吹流量：150L/h；溶解温度：400℃；溶剂气体流量：800L/h；冲击气体流量：0.25mL/min；监视模式：多反应监视模式(MRM)。

表1色谱流动相梯度洗脱程序

实施例2

本实施例的一种基于QuEChERS法结合UPLC-MS/MS快速测定土壤样品中吡咯里西啶碱的方法，包括如下步骤：

(1)提取

称取1g经粉碎过筛处理的土壤样品(200目)，置于50mL离心管中；加入0.1mL 0.1M柠檬酸三钠溶液调节土壤pH，静置2min后，再加入10mL 0.1M硫酸甲醇涡旋提取2min；接着，振荡器振荡处理30min，超声提取30min，10000rps/min条件下离心8min；将提取后剩余残渣再加入10mL 0.1M硫酸甲醇，复提一次；合并两次提取的上清液，待净化。

(2)净化

取2mL步骤(1)的上清液于盛有填料(GCB：PSA：C

(3)检测

采用超高效液相色谱-质谱联用仪对步骤(2)所得的净化液进行吡咯里西啶碱的检测分析；

色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱2.1mm×100mm，1.8μm；柱温：40℃；流动相A：水(0.1％甲酸+1mM甲酸铵)；流动相B：甲醇(0.1％甲酸+1mM甲酸铵)；流速：0.25mL/min；进样量：3μL；使用梯度洗脱程序见表1。

质谱条件为：离子源，电离方式：电喷雾正离子源(ESI+)；毛细管电压：4.0kV；雾化器压力：7.0bar；锥孔回吹流量：150L/h；溶解温度：400℃；溶剂气体流量：800L/h；冲击气体流量：0.25mL/min；监视模式：多反应监视模式(MRM)。

实施例3

本实施例用以验证本发明检测方法的准确度、灵敏度与可重复性。

1、基质匹配标准溶液的配制

分别准确称取天芥菜碱(He)、天芥菜碱氮氧化物(HeNO)、促黑激素(Im)、促黑激素氮氧化物(ImNO)、千里光碱(Jb)、千里光碱氮氧化物(JbNO)、欧天芥菜碱(Eu)、欧天芥菜碱氮氧化物(EuNO)、倒千里光碱(Re)、倒千里光碱氮氧化物(ReNO)、千里光宁碱(Sn)、千里光宁碱氮氧化物(SnNO)、千里光菲林碱(Sp)、千里光菲林碱氮氧化物(SpNO)、克氏千里光碱(Sk)15种PAs对照品各1mg，加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶，配制成100μg/mL的对照品储存母液，做好标签，置于棕色试剂瓶中低温保存备用。

取对照品储备母液1mL，用甲醇定容至10mL容量瓶中，配制成10μg/mL15种PAs混和对照液，置于棕色试剂瓶保存、备用。

取10μg/mL工作液1mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到1μg/mL 15种PAs混和对照液，置于棕色试剂瓶保存，作为工作液。

采用逐级稀释法，将1μg/mL工作液分别配制成100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.01μg/L的标准溶液，用空白茶叶基质的提取净化液作为定容液，过0.22μm滤膜，用超高效液相色谱-质谱联用仪检测。

以各点的浓度值为横坐标，以质谱上所测得定量离子的峰面积为纵坐标，建立线性方程，相关系数及线性范围见表2-1、表2-2。

表2-1 15种PAs(基质匹配)的线性方程、相关系数和线性范围

表2-2 15种PAs(基质匹配)的线性方程、相关系数和线性范围

2.基质加标回收率样品制备过程

(1)取30～40g干茶、茶鲜叶和杂草样品(此处采用的均为不含任何PAs的空白样品)，将干茶、茶鲜叶和杂草分别用粉碎机均匀粉碎后，得到的200目的干茶粉末和打碎的茶鲜叶、杂草匀浆；用感量为0.001g的电子天平准确称取1g茶叶，15种PAs的3种添加水平为0.02、0.1和0.5mg/kg；静置10min后，加入10mL 0.1M硫酸溶液涡旋提取1min，超声提取15min，10000rps/min条件下离心10min；将提取后剩余残渣再加入10mL 0.1M硫酸溶液，复提一次；合并两次提取的上清液，待净化；

将采集500g的土壤样品(此处采用的为不受任何PAs污染的空白样品)在阴凉通风的房间的晾2～3天，然后用粉碎机将小土块粉碎，再过200目的筛网土壤粉末装入保鲜袋中保存；用感量为0.001g的电子天平准确称取1g经过预处理的土壤样品，分别按照0.02、0.1和0.5mg/kg的添加水平加入15种PAs的混合对照液；静置10min后，加入0.1mL 0.1M柠檬酸三钠溶液调节土壤pH；静置2min，加入10mL 0.1M硫酸甲醇涡旋提取2min，振荡器振荡30min，超声提取30min，10000rps/min下离心8min；将提取后剩余残渣再加入10mL 0.1M硫酸甲醇，复提一次，合并两次提取的上清液，待净化；

(2)干茶、茶鲜叶、杂草和土壤样品所得的上清液分别取2mL加入盛有填料(GCB：PSA：C

土壤样品得到的上清液取2mL上清液加入提前称好填料的10mL离心管中，涡旋1min，10000rps/min，离心8min；取1mL净化液，过0.22μm有机相滤膜，得净化液。

(3)采用超高效液相色谱-质谱联用仪对步骤(2)所得的净化液进行吡咯里西啶碱的检测分析。色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱2.1mm×100mm，1.8μm；柱温：40℃；流动相A：水(0.1％甲酸+1mM甲酸铵)；流动相B：甲醇(0.1％甲酸+1mM甲酸铵)；流速：0.25mL/min；进样量：3μL；使用梯度洗脱程序见表1。

质谱条件为：离子源，电离方式：电喷雾正离子源(ESI+)；毛细管电压：4.0kV；雾化器压力：7.0bar；锥孔回吹流量：150L/h；溶解温度：400℃；溶剂气体流量：800L/h；冲击气体流量：0.25mL/min；监视模式：多反应监视模式(MRM)。15种PAs的定量离子和定性离子、锥孔电压和碰撞电压具体参数见表3。

表3 15种PAs的MRM参数

注：“*”为定量离子。

最终检测所得15种PAs在干茶、茶鲜叶、杂草和土壤4种基质中的平均回收率范围为72.04％-114.17％，相对标准偏差小于16.0％，见表4-1、表4-2。

表4-1干茶、茶鲜叶中15种PAs的回收率(％)及相对标准偏差

表4-2杂草和土壤中15种PAs的回收率(％)及相对标准偏差

结论：本实施例说明干茶、茶鲜叶、杂草和土壤样品经本发明检测方法准确度高，灵敏度高，重复性好，满足这几种样品中15种PAs的检测要求。

实施例4

本实施例用以验证本发明方法应用于真实成品茶(干茶)、茶鲜叶、杂草和土壤样品时的效果(即，采用本发明方法检测真实成品茶、茶鲜叶、杂草和土壤样品中15种PAs含量)。

(1)从茶叶市场收集市售绿茶(10份)，在安徽某地区的茶园采集鲜茶叶(10份)，杂草(10份)，每份样品100～150g，分别取30～40g干茶、茶鲜叶、杂草样品；将干茶、茶鲜叶、杂草分别用粉碎机均匀粉碎后，得到的200目的干茶粉末和打碎的鲜茶和杂草匀浆；用感量为0.001g的电子天平分别准确称取1g干茶、茶鲜叶、杂草，加入10mL 0.1M硫酸溶液涡旋提取1min，超声提取15min，10000rps/min，离心10min；将提取后剩余残渣再加入10mL 0.1M硫酸溶液，复提一次；合并两次提取的上清液，待净化。

采集安徽某茶区土壤样品(10份)，每份样品在200g左右，采集的土壤样品在阴凉通风的房间的晾2～3天，然后用粉碎机将小土块粉碎，在过200目的筛网土壤粉末装入保鲜袋中保存；用感量为0.001g的电子天平准确称取1g经过预处理的土壤样品，置于50mL离心管中；加入0.1mL 0.1M柠檬酸三钠溶液调节土壤pH，静置2min，加入10mL 0.1M硫酸甲醇涡旋提取2min，振荡器振荡30min，超声提取30min，10000rps/min下离心8min；将提取后剩余残渣再加入10mL 0.1M硫酸甲醇，复提一次；合并两次提取的上清液，待净化。

(2)干茶、茶鲜叶、杂草和土壤所得的上清液分别取2mL加入提前称好填料(GCB：PSA：C

(3)采用超高效液相色谱-质谱联用仪对步骤(2)所得的净化液进行吡咯里西啶碱的检测分析。

色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱2.1mm×100mm，1.8μm；柱温：40℃；流动相A：水(0.1％甲酸+1mM甲酸铵)；流动相B：甲醇(0.1％甲酸+1mM甲酸铵)；流速：0.25mL/min；进样量：3μL；使用梯度洗脱程序见表1。

质谱条件为：离子源，电离方式：电喷雾正离子源(ESI+)；毛细管电压：4.0kV；雾化器压力：7.0bar；锥孔回吹流量：150L/h；溶解温度：400℃；溶剂气体流量：800L/h；冲击气体流量：0.25mL/min；监视模式：多反应监视模式(MRM)。

最终，真实的成品茶、茶鲜叶、杂草和土壤中15种吡咯里西啶碱的检测结果如表5-1、表5-2所示。

表5-1真实成品茶与杂草样品中15种PAs的检测结果

注：ND表示低于定量限。

表5-2真实茶鲜叶与土壤样品中15种PAs的检测结果

注：ND表示低于定量限。

结论：本实施例说明本发明方法适用于真实市售绿茶样品、茶鲜叶、茶园杂草和土壤样品中15种PAs的检测，满足不同样品基质中多种PAs检测要求。

综上所述，本发明开发的基于QuEChERS法结合UPLC-MS/MS的吡咯里西啶碱检测方法可快速、准确、灵敏地测定真实成品茶、茶鲜叶、杂草和土壤中15种吡咯里西啶碱的含量。

那么，当采用所述基于QuEChERS法结合UPLC-MS/MS的吡咯里西啶碱检测方法对同一茶园生态体系中的成品茶、茶鲜叶、杂草和土壤样品的吡咯里西啶碱含量进行检测，便可根据检测结果逐步分析茶叶中PAs的污染来源。因此，本发明方法在确定茶叶中PAs污染来源方面具有应用优势。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。