同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒及应用

文献发布时间：2023-06-19 16:08:01

技术领域

本发明属于法医遗传学技术领域，涉及一种马亲权鉴定和个体识别的方法，具体为同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒及应用。

背景技术

马在动物分类学中的分类为：脊椎动物亚门(Vertebrata)、哺乳纲(Mammalia)、奇蹄目(Perissodactyla)、马科(Equidae)、马属(Equus)、马(Equus caballus)。是一种草食性动物。现存家马和普氏野马两个亚种。2011年末，我国马的存栏数约为677万匹，位居世界第2位。有地方品种29个，培育品种13个，已经形成育种群的引入品种有10个以上，形成了丰富多彩、分布广阔的马种资源，但其中2/3以上已经处于数量下降、濒危或濒临灭绝状态。我国马种资源正处于保种和向非役用转型的关键时期。马在我国主要分布于四川、新疆、内蒙等省(区)，其中内蒙2018年存栏数63.83万头，位列全国第三。

短串联重复序列基因座(Short Tandem Repeat，STR)作为继限制性片段长度多态性之后的第二代遗传标记，自二十世纪八九十年代以来，被广泛应用于法医物证学方面相关的研究及鉴定，是目前应用最广泛的遗传标记之一。STR标记与其他遗传标记物相比，STR基因座片段小、容易扩增，更适用于微量和降解检材，且多个STR基因座可以同时进行复合扩增，具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点，被广泛应用于法医物证中的个体识别和亲子鉴定。经研究报道发现，该项技术也可用于马亲权鉴定与个体识别。

目前市场上针对马STR的商品化试剂盒仅有AB的Thermo Scientifc BovineGenotypes Panel 3.1，其为四色试剂盒，包括17个STR位点((AHT4,AHT5,ASB2,ASB17,ASB23,CA425,HMS1,HMS2,HMS3,HMS6,HMS7,HTG4,HTG6,HTG7,HTG10,LEX3 and VHL20)。根据其用户手册，这些基因座选自FAO-ISAG所推荐的马微卫星位点，所适用的也是马品种。但由于这些基因座只位于常染色体且数目不多，不排除可能遇到等位基因型相同的两个个体，当两个个体基因型相同时，基因座数量少的试剂盒将无法区别两个个体。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，实现在单管内同时扩增、检测马20个STR基因座，且在基因座排布中尽量使各基因座分布于不同染色体上、相互之间不存在遗传连锁；确保在扩增过程中各条引物之间相互无干扰，无非特异峰产生，从而满足马亲权鉴定、个体识别及性别辨别等多种需求。鉴于此，本发明提供了同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒及应用。

技术方案：同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒，所述试剂盒包括扩增以下20个STR基因座的特异性扩增引物；其中，20个STR基因座为：HTG6、HTG7、COR22、CA425、HTG4、COR82、LEX54、COR69、AHT5、HMS3、HMS1、HMS6、HMS7、COR58、HTG10、ASB17、VHL20、HMS2、ASB2、LEX34。

优选的，所述特异性扩增引物的序列如下：HTG6、SEQ ID NO:1-2；HTG7、SEQ IDNO:3-4；COR22、SEQ ID NO:5-6；CA425、SEQ ID NO:7-8；HTG4、SEQ ID NO:9-10；COR82、SEQID NO:11-12；LEX54、SEQ ID NO:13-14；COR69、SEQ ID NO:15-16；AHT5、SEQ ID NO:17-18；HMS3、SEQ ID NO:19-20；HMS1、SEQ ID NO:21-22；HMS6、SEQ ID NO:23-24；HMS7、SEQ IDNO:25-26；COR58、SEQ ID NO:27-28；HTG10、SEQ ID NO:29-30；ASB17、SEQ ID NO:31-32；VHL20、SEQ ID NO:33-34；HMS2、SEQ ID NO:35-36；ASB2、SEQ ID NO:37-38；LEX34、SEQ IDNO:39-40。

优选的，所述特异性扩增引物的浓度如下：HTG6、0.2μM；HTG7、0.15μM；COR22、0.15μM；CA425、0.2μM；HTG4、0.25μM；COR82、0.25μM；LEX54、0.25μM；COR69、0.25μM；AHT5、0.25μM；HMS3、0.2μM；HMS1、0.15μM；HMS6、0.2μM；HMS7、0.25μM；COR58、0.25μM；HTG10、0.25μM；ASB17、0.25μM；VHL20、0.2μM；HMS2、0.2μM；ASB2、0.25μM；LEX34、0.2μM。特异性扩增引物具体信息如下表所示：

优选的，所述特异性扩增引物分为5组，HTG6、HTG7、COR22、CA425为第1组，HTG4、COR82、LEX54、COR69为第2组，AHT5、HMS3、HMS1、HMS6为第3组，HMS7、COR58、HTG10、ASB17为第4组，VHL20、HMS2、ASB2、LEX34为第5组。

优选的，所述特异性扩增引物采用荧光染料FAM、HEX、SUM、LYN、PUR中的任一种进行标记，且5组引物采用的荧光染料均不同，内标选用橙色荧光SIZ标记。

优选的，每个基因座的特异性扩增引物中至少1条的5’端采用荧光标记。

优选的，所述试剂盒包括：20个基因座的等位基因分型标准物、反应混合液、热启动Taq酶、马基因组DNA、sdH

优选的，所述反应混合液包括：MgCl

以上任一所述同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒在马亲权鉴定或个体识别中的应用。

有益效果：(1)本发明所述试剂盒能够在单管中同时扩增、检测20个马STR位点，为同类型产品中检测位点最多的试剂盒；(2)选用的基因座尽量分布在不同染色体上，相互之间不存在遗传连锁，从而提高了试剂盒的整体识别能力；(3)所述特异性扩增引物之间相互无干扰，无非特异峰产生，且具有特异性强、分辨率高、分型准确、灵敏度高等特点，可完全满足马亲权鉴定、个体识别、性别辨别等多方面需求。

附图说明

图1为本发明的基因座排布示意图；

图2为本发明的实际样本1分型图。

图3为本发明的实际样本2分型图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒，具体包括：

一、基因座位点筛选

根据多态性高、标记间不连锁、易于基因分型等要求及实际引物测试效果与基因座排布需求，筛选出20个染色体STR基因座：HTG6、HTG7、COR22、CA425、HTG4、COR82、LEX54、COR69、AHT5、HMS3、HMS1、HMS6、HMS7、COR58、HTG10、ASB17、VHL20、HMS2、ASB2、LEX34。

二、基因座排布

根据以上20个基因座，设计了独特的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方法：HTG6、HTG7、COR22、CA425为第一组，荧光染料标记物为FAM；HTG4、COR82、LEX54、COR69为第二组，荧光染料标记物为HEX；AHT5、HMS3、HMS1、HMS6为第三组，荧光染料标记物为SUM；HMS7、COR58、HTG10、ASB17为第四组，荧光染料标记物为LYN；VHL20、HMS2、ASB2、LEX34为第五组,荧光染料标记物为PUR基因座排布如图1。

三、特异性引物设计及复合扩增条件的建立

通过基因座名称或者染色体位置，利用UCSC或NCBI网站进行基因座序列下载；其次，根据每个基因座重复单元两侧的序列进行引物设计。

(1)特异性引物设计

在设计特异性引物时，使用的设计软件最佳搭配是Premier和Oligo合并使用，以Premier进行自动搜索，Oligo进行分析评价，特异性引物碱基分布要随机、Tm值相近、GC含量在40％～60％之间、引物自身及引物之间不应存在互补序列；同时也要保证引物扩增的特异性，在NCBI数据库中使用Primer-BLAST软件对设计的引物进行比对分析，要充分考虑引物3’端的特异性，因为引物3’端序列同源性较高的话容易导致错误引发。

随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座的特异性引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试，最终保证试剂盒的扩增特异性及效率。

(2)复合扩增条件的建立

先对20个基因座的单一扩增条件进行优化，在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上，研究20个基因座复合扩增PCR反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，包括循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，建立起复合扩增体系，同时扩增出20个基因座或位点，最终特异性引物序列及浓度见表1。

表1特异性引物序列及浓度

所述特异性扩增引物分为5组，HTG6、HTG7、COR22、CA425为第1组，HTG4、COR82、LEX54、COR69为第2组，AHT5、HMS3、HMS1、HMS6为第3组，HMS7、COR58、HTG10、ASB17为第4组，VHL20、HMS2、ASB2、LEX34为第5组。所述特异性扩增引物采用荧光染料FAM、HEX、SUM、LYN、PUR中的任一种进行标记，且5组引物采用的荧光染料均不同，内标选用橙色荧光SIZ标记。每个基因座的特异性扩增引物中至少1条的5’端采用荧光标记。

所述试剂盒包括：20个基因座的等位基因分型标准物、反应混合液、热启动Taq酶、马基因组DNA、sdH

表2试剂盒扩增体系

本试剂盒仅可用于提取样本的扩增，马基因组DNA指的是马基因组DNA提取物。因提取检材与提取方式的不同，所获得的DNA提取物浓度也不同，加入量X为不定值，根据所提DNA提取物的浓度可调节马基因组DNA的加入量，保证加入的DNA为0.125-1ng，可获得准确分型结果。马基因组DNA最大加入量X为2μL。

所述反应混合液包括：MgCl

实施例2

实施例1复合扩增试剂盒在马亲权鉴定或个体识别中的应用。应用步骤如下：

1、配制PCR扩增体系；

2、扩增热循环

(l)将PCR扩增管置于热循环仪上；

(2)选择表3推荐的PCR扩增条件进行PCR扩增；

(3)扩增后的产物应避光保存；

表3

3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物：(0.5μLAGCU Marker SIZ-500)×(进样数)+(12μL去离子甲酰胺)×(进样数)，AGCU MarkerSIZ-500购于无锡中德美联生物技术有限公司；

将12.5μL所述上样混合物与1μL扩增产物或20个基因座等位基因分型标准物Allelic Ladder(无锡中德美联生物技术有限公司)混合，避免产生气泡，95℃变性3min，冰浴3min，并尽快使遗传分析仪进行电泳检测；

4、分型分析

用片段分析软件GeneMapper ID-X分析步骤三中遗传分析仪检测收集的数据，电泳采用多道或单道毛细管电泳。

本实施例中的样本1为马肉粉末，样本购自国家计量局，利用Chelex法对样本进行马基因组DNA提取。样本2为无锡食药环送检疑似马肉假冒驴肉检材，利用磁珠提取试剂盒对马基因组DNA提取。

结果显示，使用本发明对上述马样本进行分型检测，使用本发明可对马个体进行有效辨别，在马个体识别上有较大的作用。

序列表

<110> 呼伦贝尔市公安局刑事侦查支队

无锡中德美联生物技术有限公司

<120> 同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒及应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA