一种可注射pH/ROS双重响应水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及水凝胶技术领域，更具体地说涉及一种可注射pH/ROS双重响应水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

水凝胶具有一定力学性能、具有类似细胞外基质和粘弹性的3D聚合物网络结构，可以与周围环境进行营养物质、气体等的扩散和交换，也可以作为细胞、药物分子、生长因子的可控递送系统。可注射水凝胶由于具有剪切变稀的性能可以通过注射器或者微导管直接注射到目标位置。近来，ROS响应性可注射水凝胶也因其具有操纵恶劣微环境的自适应能力而引起了越来越多的关注。为了允许ROS响应，必须在水凝胶中形成可逆的共价交联网络。硼酸及其衍生物可以可逆地与顺式二醇键合，并响应微环境(葡萄糖、pH和ROS)的变化。但是目前苯硼酸修饰的天然高分子形成得水凝胶往往需要较高的pH值，这严重限制了其在体内的应用。通过降低苯硼酸的pKa，可以在中性条件下形成凝胶。因此可以携带细胞、药物分子、生长因子等输送至受损部位从而实现对药物、细胞等的精准释放。

发明内容

本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种可注射pH/ROS双重响应水凝胶及其制备方法和应用，通过制备二醇和酰肼修饰的透明质酸单体和苯硼酸和醛基修饰的透明质酸单体，将两种单体混合，然后通过席夫碱反应和硼酸酯反应制备得到在中性条件下形成的可注射pH/ROS双重响应水凝胶，可通过两种组分的配比得到不同力学性能和成胶时间的可注射水凝胶。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

一种可注射pH/ROS双重响应水凝胶及其制备方法，按照下述步骤进行：

步骤1，苯硼酸和醛基修饰的透明质酸的制备：

将透明质酸溶解在水中并加入离子交换树脂搅拌5-36h后，过滤，滤液用四丁基氢氧化铵调节至中性,冻干得到油溶性透明质酸，将上述油溶性透明质酸溶解于二甲基亚砜中，然后向其中加入1,3-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和羧基苯硼酸衍生物，加热至25-75℃反应10-36h后，即得到苯硼酸修饰的透明质酸溶液，将反应后的溶液透析、冻干后，即得到苯硼酸修饰的透明质酸，将上述苯硼酸修饰的透明质酸溶解在水中，并向其中加入高碘酸钠，避光反应1-10h，再加入乙二醇，透析、冻干后，即得到苯硼酸和醛基修饰的透明质酸，其中，透明质酸钠与离子交换树脂的质量比为1:0.1-1:10，苯硼酸衍生物采用3-羧基-4-氟苯硼酸、4-羧基-3-氟苯硼酸、5-羧基-2-氟苯硼酸、4-羧基-2-硝基苯硼酸或者3-羧基-5-硝基苯硼酸，1,3-二环己基碳二亚胺与透明质酸中羧基摩尔比为1:1-10:1，4-二甲氨基吡啶与透明质酸中羧基摩尔比1:1-10:1，羧基苯硼酸衍生物与透明质酸中羧基摩尔比为2:1-10:1,，高碘酸钠的用量0.2-1.5g，乙二醇的用量5-40mL；

如图1所示，苯硼酸和醛基修饰的透明质酸制备流程示意图。

步骤2，二醇和酰肼修饰的透明质酸的制备：

将透明质酸溶解到水中，向其中加入催化剂活化羧基，反应2-12h后，再向其中加入氨基丙二醇和二酰肼，再加热至20-37℃反应10-36h后，透析、冻干，即得到二醇和酰肼修饰的透明质酸，其中，催化剂采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺或者1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/1-羟基苯并三唑，催化剂与透明质酸中羧基摩尔比为1:1-10:1，氨基丙二醇和二酰肼的加入顺序为加入氨基二醇反应一段时间后再加入二酰肼、加入二酰肼反应一段时间后在加入氨基二醇或者同时加入二酰肼和氨基二醇，氨基二醇采用3-氨基-1,2-丙二醇、4-氨基-1,2-丁二醇、β-D-核吡喃糖胺或者D-萄糖胺，二酰肼采用碳酸二酰肼、己二酸二酰肼或者癸二酸二酰肼，氨基丙二醇与透明质酸中羧基摩尔比为1:1-10:1，二酰肼与透明质酸中羧基摩尔比为1:1-10:1；

如图2所示，二醇和酰肼修饰的透明质酸制备流程示意图。

步骤3，将步骤1制备得到的苯硼酸和醛基修饰的透明质酸溶于PBS溶液中，得到质量分数为3％-20％的苯硼酸和醛基修饰的透明质酸PBS溶液，将步骤2制备得到的二醇和酰肼修饰的透明质酸溶于PBS溶液中，得到质量分数为1％-10％的二醇和酰肼修饰的透明质酸PBS溶液，将上述两种溶液混合5s-120s后，即得到可注射pH/ROS双重响应水凝胶，其中，酰肼和醛基、苯硼酸和二醇的比例均为0.5-5。

在步骤1中，透明质酸钠与离子交换树脂的质量比为1:1，搅拌反应时间为24h，苯硼酸衍生物采用3-羧基-4-氟苯硼酸，加热温度为45℃，反应时间为24h。

在步骤2中，催化剂采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/1-羟基苯并三唑，透明质酸与催化剂的反应时间为48h，氨基丙二醇和二酰肼的加入顺序为同时加入二酰肼和氨基二醇，氨基二醇采用3-氨基-1,2-丙二醇，二酰肼采用碳酸二酰肼，加热反应时间为24h。

在步骤3中，醛基和苯硼酸修饰的透明质酸单体质量分数为5％-12％，二醇和酰肼修饰的透明质酸单体质量分数为2％-7％。

在步骤3中，两种溶液中酰肼和醛基、苯硼酸和二醇的比例均为1-5。

本发明的有益效果为：利用本发明方法制备得到的水凝胶制备方法简单，且同时具备可注射性，力学性能和成胶时间可根据需要进行改变；此外该体系可在中性条件下形成凝胶，适于包裹活性因子、细胞和药物，可应用于组织工程领域。

附图说明

图1是本发明制备苯硼酸和醛基修饰透明质酸单体的制备流程示意图；

图2是本发明制备二醇和酰肼修饰透明质酸单体的制备流程示意图；

图3是本发明制备苯硼酸和醛基修饰透明质酸单体的核磁谱图；

图4是本发明制备二醇和酰肼修饰透明质酸单体的核磁谱图；

图5是本发明制备的双重响应水凝胶的成胶时间；

图6是本发明制备的双重响应水凝胶的流变性能。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1

步骤1，用天平称量1g透明质酸，1.37g碳酸二酰肼、1.48g 3-氨基-1,2-丙二醇、1.29g 1-羟基苯并三唑、1.16g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，适量的水放入单口烧瓶中，加热25℃开始反应，反应时间48h。

步骤2，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到二醇和酰肼修饰的透明质酸。

步骤3，用天平称取1g透明质酸、1g离子交换树脂和适量的水加入单口瓶中，搅拌24h，反应完成后过滤，滤液用四丁基氢氧化铵调节至中性，冻干得到油溶性透明质酸。

步骤4，用天平称取1g油溶性透明质酸、0.6g N,N'-二环己基碳酰亚胺、0.5g 3-羧基-4-氟苯硼酸、0.5g 4-二甲氨基吡啶和适量的二甲基亚砜加入单口瓶中，加热45℃开始反应，反应时间24h。

步骤5，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到苯硼酸修饰的透明质酸。

步骤6，用天平称取1g苯硼酸修饰的透明质酸、0.5g高碘酸钠和适量水加入单口瓶中，加热25℃开始反应，反应时间5h。

步骤7，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到醛基和苯硼酸修饰的透明质酸。

步骤8，用天平将所制备的二醇和酰肼修饰的透明质酸溶于PBS溶液中，制备成一定质量分数的溶液。质量分数为1.3％。

步骤9，用天平将所制备的醛基和苯硼酸修饰的透明质酸溶于PBS溶液中，制备成一定质量分数的溶液。质量分数为2.6％。然后将二醇和酰肼修饰的透明质酸溶液200μL和醛基和苯硼酸修饰的透明质酸溶液200μL，混合形成凝胶。

实施例2

步骤1，用天平称量1g透明质酸，1.37g碳酸二酰肼、1.48g 3-氨基-1,2-丙二醇、1.29g 1-羟基苯并三唑、1.16g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，适量的水放入单口烧瓶中，加热25℃开始反应，反应时间48h。

步骤2，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到二醇和酰肼修饰的透明质酸。

步骤3，用天平称取1g透明质酸、1g离子交换树脂和适量的水加入单口瓶中，搅拌24h，反应完成后过滤，滤液用四丁基氢氧化铵调节至中性，冻干得到油溶性透明质酸。

步骤4，用天平称取1g油溶性透明质酸、0.6g N,N'-二环己基碳酰亚胺、0.5g 3-羧基-4-氟苯硼酸、0.5g 4-二甲氨基吡啶和适量的二甲基亚砜加入单口瓶中，加热45℃开始反应，反应时间24h。

步骤5，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到苯硼酸修饰的透明质酸。

步骤6，用天平称取1g苯硼酸修饰的透明质酸、0.5g高碘酸钠和适量水加入单口瓶中，加热25℃开始反应，反应时间5h。

步骤7，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到醛基和苯硼酸修饰的透明质酸。

步骤8，用天平将所制备的二醇和酰肼修饰的透明质酸溶于PBS溶液中，制备成一定质量分数的溶液。质量分数为2％。

步骤9，用天平将所制备的醛基和苯硼酸修饰的透明质酸溶于PBS溶液中，制备成一定质量分数的溶液。质量分数为4％。然后将二醇和酰肼修饰的透明质酸溶液200μL和醛基和苯硼酸修饰的透明质酸溶液200μL，混合形成凝胶。

实施例3

步骤1，用天平称量1g透明质酸，1.37g碳酸二酰肼、1.48g 3-氨基-1,2-丙二醇、1.29g 1-羟基苯并三唑、1.16g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，适量的水放入单口烧瓶中，加热25℃开始反应，反应时间48h。

步骤2，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到二醇和酰肼修饰的透明质酸。

步骤3，用天平称取1g透明质酸、1g离子交换树脂和适量的水加入单口瓶中，搅拌24h，反应完成后过滤，滤液用四丁基氢氧化铵调节至中性，冻干得到油溶性透明质酸。

步骤4，用天平称取1g油溶性透明质酸、0.6g N,N'-二环己基碳酰亚胺、0.5g 3-羧基-4-氟苯硼酸、0.5g 4-二甲氨基吡啶和适量的二甲基亚砜加入单口瓶中，加热45℃开始反应，反应时间24h。

步骤5，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到苯硼酸修饰的透明质酸。

步骤6，用天平称取1g苯硼酸修饰的透明质酸、0.5g高碘酸钠和适量水加入单口瓶中，加热25℃开始反应，反应时间5h。

步骤7，反应完成后，将反应后的溶液倒入透析袋中，透析3天，每天换水3次，将透析后的溶液冻干，得到醛基和苯硼酸修饰的透明质酸。

步骤8，用天平将所制备的二醇和酰肼修饰的透明质酸溶于PBS溶液中，制备成一定质量分数的溶液。质量分数为3.3％。

步骤9，用天平将所制备的醛基和苯硼酸修饰的透明质酸溶于PBS溶液中，制备成一定质量分数的溶液。质量分数为6.6％。然后将二醇和酰肼修饰的透明质酸溶液200μL和醛基和苯硼酸修饰的透明质酸溶液200μL，混合形成凝胶。

如图3所示，对制备的苯硼酸和醛基修饰的透明质酸单体进行核磁表征，图中显示在7.0-8.5ppm处出现了明显的苯环峰，说明3-羧基-4-氟苯硼酸已成功透明质酸上的羟基反应，证明了3-羧基-4-氟苯硼酸修饰透明质酸的成功合成，通过醛基和苯硼酸修饰透明质酸与肼基甲酸叔丁酯反应来定性醛基的修饰及定量其含量，图中显示在1.25-1.5ppm处出现了明显的叔丁基峰，表明了醛基和苯硼酸修饰的透明质酸的成功合成，通过积分可以计算得到苯硼酸和醛基的取代度分别为10％和9.5％。

如图4所示，对制备的二醇和酰肼修饰的透明质酸单体进行核磁表征，图中显示在2.5-3.0ppm处出现了明显的-CH-峰，表明二醇修饰的透明质酸的成功合成，为了定性和定量酰肼的成功修饰，使用二醇和酰肼修饰的透明质酸与苯甲醛反应，图中显示在7.0-8.0ppm处出现了明显的苯环峰，表明了酰肼的成功修饰，通过积分可以计算得到二醇和酰肼的取代度分别为15％和17.2％。

如图5所示，将制备得到的酰肼和二醇修饰的透明质酸和醛基和苯硼酸修饰的透明质酸调控两组分的浓度进行成胶时间测试，随着聚合物浓度的增加，成胶时间逐渐降低。

如图6所示，将制备得到的酰肼和二醇修饰的透明质酸和醛基和苯硼酸修饰的透明质酸调控两组分的浓度进行流变性能测试。时间扫描和频率扫描的结果表明随着聚合物浓度的增加，水凝胶的储能模量和损耗模量均有一定程度的增加，其力学强度可调，在10-2000Pa。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。