一种交联改性的三维胶原支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物医用材料，尤其涉及一种三维胶原支架，本发明还涉及三维胶原支架的制备方法。

背景技术

胶原蛋白是生物体含量最丰富的结构性蛋白质，其含量约占动物体内总蛋白含量的25％-30％，是结缔组织中重要的组成部分，具有支撑器官、保护机体的作用。胶原蛋白特有的三螺旋氨基酸结构使其具有良好的生物相容性、抵抗原性等多种优良特性。同时，它作为细胞外骨架的重要组成部分，能够调控细胞的迁移和许多细胞因子的分泌，具有促进细胞生长及快速止血等优良性能，是生物医用材料的制备来源之一。三维细胞培养是一种以生物材料为载体的新型细胞培养方式。胶原支架所形成的三维结构不仅能够提供类似细胞体内生长的三维空间结构，同时增加了细胞间或细胞与胞外基质间的相互联系，为细胞获取营养、生长和代谢提供了良好的环境。

传统的胶原蛋白来源为猪、牛等陆生动物的皮肤组织，但由于人朊病毒病、口蹄疫等健康问题，使人们产生顾虑。水产动物源胶原蛋白凭借良好的凝胶性、高可溶性等特性，成为了重要的替代来源，并被广泛使用。水产动物体内的胶原蛋白含量通常高于陆生动物，如在鱼皮中，胶原含量可以达到其蛋白质总含量的80％及以上。目前，在水产动物内最为常见的是Ⅰ型和Ⅴ型胶原蛋白，是水产品加工废弃物中含量最高的蛋白质。其中，Ⅰ型胶原蛋白在医用敷料、组织工程材料、载药支架等方面均有广泛应用。

然而，从动物组织中直接提取胶原容易破坏其天然交联，降低机械完整性、抗水解性等；同时由于水产动物较低的生活环境决定了其较低的热稳定性，以上均导致纯胶原蛋白在应用时会受到许多限制，因此需要进行外源改性，以提高胶原基生物材料的力学性能、抗水解性能、结构稳定性等，从而实现水产胶原蛋白的高值化利用。

现有一般采用高温、紫外线、γ射线等物理改性、加入京尼平交联、戊二醛等交联剂进行化学交联或调整工艺参数的方法来提高胶原支架的力学强度，但是上述物理改性方法只能小幅改善胶原支架的力学性能，无法满足应用需求，而戊二醛等化学交联容易有交联剂残留，导致生物毒性，而调整工艺参数容易造成胶原多孔支架材料的孔径减小，不利于细胞增殖，影响胶原支架的诱导组织再生性。因此需要改进。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种结构稳定性佳、吸湿性好和体外凝血能力强的交联改性的三维胶原支架。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种无细胞毒性的三维胶原支架。

本发明所要解决的第三个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种结构稳定性佳、吸湿性好和体外凝血能力强的交联改性的三维胶原支架的制备方法。

本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种无细胞毒性的三维胶原支架的制备方法。

本发明解决上述第一个和第二个技术问题所采用的技术方案为：一种交联改性的三维胶原支架，其特征在于采用中华鳖裙边胶原蛋白与EDC和NHS交联制备改性三维胶原支架。

本发明解决上述第三个和第四个技术问题所采用的技术方案为：一种权利要求1所述交联改性的三维胶原支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

将中华鳖裙边胶原蛋白在含有MES缓冲液的乙醇中浸泡，使胶原蛋白完全湿润；再将其浸入同时含MES缓冲液、交联剂EDC和交联剂NHS的乙醇中进行交联，交联温度为4～35℃，交联时间为2～6h；然后一次洗涤，再在NaCl溶液中按照摩尔浓度梯度，依次浸泡，最后用去离子水进行二次洗涤，并冷冻干燥。

作为优选，所述的MES缓冲液pH为5.0～6.0，乙醇中的体积百分比浓度为30％～50％。

作为优选，所述的交联剂EDC和交联剂NHS的摩尔浓度比为1～2.5:1，交联剂EDC和交联剂NHS在乙醇中的体积百分比浓度为30％～50％。

作为优选，所述的EDC的浓度为20～100mmol/L，NHS的浓度为10～50mmol/L。

作为最佳，所述的交联剂EDC和交联剂NHS的摩尔浓度比为2.0:1。

作为最佳，所述交联温度为25℃，交联时间为4h。

作为优选，所述NaCl溶液按照摩尔浓度梯度浸泡，采用1、2、4mol/L的浓度梯度。

作为优选，所述一次洗涤采用0.1mol/L Na

与现有技术相比，本发明的优点在于：EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)可以促进胶原蛋白的谷氨酸或天冬氨酸的羧基与氨基连接形成酰胺键，其本身则形成水溶性的脲衍生物，并能在冲洗过程中被除去，因此避免了有毒物质的引入，也被称为“零距离交联剂”。与此同时，EDC常与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)进行联用，以提高其交联效率。交联改性后的胶原支架在保持了胶原蛋白原本疏松多孔、互相连接的典型海绵状形貌的基础上，大大增强了胶原材料的结构稳定性、吸湿性和体外凝血能力。与京尼平交联的胶原蛋白相比，EDC/NHS交联的胶原支架不会产生细胞毒性，在符合生物材料的安全性要求的同时具有良好的生物组织相容性，具备作为生物医用材料的应用潜能。

附图说明

图1为实施例1中EDC/NHS交联改性的三维胶原支架的宏观形态。

图2为实施例1中EDC/NHS交联改性的三维胶原支架的显微照片。

图3为非交联的中华鳖裙边胶原蛋白吸湿性检测结果。

图4为紫外辐射交联的中华鳖裙边胶原蛋白吸湿性检测结果。

图5为实施例1中EDC/NHS交联的中华鳖裙边胶原蛋白吸湿性检测结果。

图6为京尼平交联的中华鳖裙边胶原蛋白吸湿性检测结果。

图7为各组中华鳖裙边胶原蛋白的体外凝血能力检测结果。

图8为实施例1中EDC/NHS交联改性的三维胶原支架的生物组织相容性检测结果。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。但本发明的实施方式不限于此。另外，如未有特殊说明，以下采用的材料和方法均为本领域常规选择及常规技术手段。

实施例1

1.将中华鳖裙边胶原蛋白在含有50mmol/L MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲液(pH＝5.5)的40％乙醇中浸泡30min使其完全湿润。

2.将湿润的胶原蛋白浸入同时含50mmol/L MES缓冲液(pH＝5.5)和EDC/NHS(EDC的浓度为60mmol/L，NHS的浓度为30mmol/L)的40％乙醇中进行交联。

3.交联温度为25℃，交联时长为4h。

4.用Na

最终获得的交联改性的三维胶原支架的宏观形态和微观结构分别如图1和图2所示。

如图1所示，在宏观形态上，经过EDC/NHS交联改性的三维胶原支架呈白色、多孔、均匀、致密的海绵状形态；如图2所示，交联后胶原具有三维多孔结构，孔径相对均匀，具有良好的连通性。良好的孔隙率和连通性能够为细胞提供类似体内生长的三维空间结构，有利于营养物质的运输，并增加了细胞间或细胞与胞外基质间的相互联系，可作为三维细胞培养的优良载体。

实施例2

1.将中华鳖裙边胶原蛋白在含有50mmol/L MES缓冲液(pH＝5.5)的40％乙醇中浸泡30min使其完全湿润。

2.将湿润的胶原蛋白浸入同时含50mmol/L MES缓冲液(pH＝5.5)和EDC/NHS(EDC的浓度为100mmol/L，NHS的浓度为50mmol/L)的40％乙醇中进行交联。

3.交联温度为4℃，交联时长为2h。

4.用Na

最终获得的交联复合胶原支架，宏观形态与微观结构特征与实施例1一致。

实施例3

1.将中华鳖裙边胶原蛋白在含有50mmol/L MES缓冲液(pH＝5.5)的40％乙醇中浸泡30min使其完全湿润。

2.将湿润的胶原蛋白浸入同时含50mmol/L MES缓冲液(pH＝5.5)和EDC/NHS(EDC的浓度为80mmol/L，NHS的浓度为40mmol/L)的40％乙醇中进行交联。

3.交联温度为15℃，交联时长为6h。

4.用Na2HPO4(0.1mol/L)洗涤2h，并重复一次，再在NaCl中按1、2、4mol/L的浓度梯度，依次浸泡过夜，最后用去离子水反复洗涤，并冷冻干燥。

实施例4

1.将中华鳖裙边胶原蛋白在含有50mmol/L MES缓冲液(pH＝5.5)的40％乙醇中浸泡30min使其完全湿润。

2.将湿润的胶原蛋白浸入同时含50mmol/L MES缓冲液(pH＝5.5)和EDC/NHS(EDC的浓度为80mmol/L，NHS的浓度为40mmol/L)的40％乙醇中进行交联。

3.交联温度为35℃，交联时长为4h。

4.用Na

最终获得的交联复合胶原支架，宏观形态与微观结构特征与实施例1一致。

以下以实施例1为例，通过测试例将实施例1中制备的EDC/NHS交联的中华鳖裙边胶原蛋白与非交联的中华鳖裙边胶原蛋白、紫外辐射交联的中华鳖裙边胶原蛋白、京尼平交联的中华鳖裙边胶原蛋白的吸湿性和体外凝血能力进行比较，并通过细胞毒性和三维细胞培养试验对以上各组中华鳖裙边胶原蛋白进行了生物组织相容性评价。

其中，紫外辐射交联的中华鳖裙边胶原蛋白处理过程如下：将中华鳖裙边胶原蛋白放置在铝片上，用五个15W紫外灯(254nm)进行辐射，光源与胶原蛋白之间的距离为6英寸，辐射时长为60min，期间翻面一次，使胶原蛋白两面受辐射程度相同。京尼平交联的中华鳖裙边胶原蛋白处理过程如下：将中华鳖裙边胶原蛋白在含0.5％(m/v)京尼平的PBS中，4℃交联24h，然后用去离子水反复洗涤，并冷冻干燥。

测试例(一)吸湿性检测

将胶原样品切成1×1cm大小，准确称重(Wd)，浸泡在含有142mmol/L Na

吸湿性(％)＝(Ww-Wd)/Wd×100。

结果：经过吸湿性检测后，各组中华鳖裙边胶原蛋白的形态如图3～6所示，如图3和图4所示，非交联和紫外辐射交联的中华鳖裙边胶原蛋白呈现弥散塌陷状，不具备作为三维细胞培养的支架形态；参考图5和图6所示，而经过EDC/NHS交联和京尼平交联的中华鳖裙边胶原蛋白依旧能保持良好的三维支架形态，表明交联改性后裙边胶原蛋白的机械强度有明显提升。根据吸湿性计算公式得，非交联的中华鳖裙边胶原蛋白的吸湿性为5.43±0.53％，紫外辐射交联的中华鳖裙边胶原蛋白的吸湿性为8.07±1.01％，京尼平交联的中华鳖裙边胶原蛋白的吸湿性为22.53±2.59％，而EDC/NHS交联的中华鳖裙边胶原蛋白的吸湿性为29.91±1.30％，极显著高于其他组，且差异具有统计学意义(P＜0.01)。

测试例(二)体外凝血能力检测

采用抗凝全血进行试验，可降低凝血率，放大止血敷料的凝血能力差异。将胶原样品切成1×1cm大小，置于烧杯底部，37℃水浴5min；在样品表面滴加0.25mL新鲜抗凝全血，再加入0.02mL CaCl

BCI(％)＝(ODs/ODc)×100

其中，ODs为生成的血红蛋白溶液的吸光度，ODc为抗凝血加入50ml去离子水中0.25mL的吸光度。

结果：各组中华鳖裙边胶原蛋白的体外凝血能力如图7所示。经过30min的凝血试验后，所有组别的抗凝全血均逐渐凝固形成血块，表明试验所用的非交联和交联的中华鳖裙边胶原蛋白均具备了良好的凝血活性。其中，经过紫外辐射交联和京尼平交联的中华鳖裙边胶原蛋白的体外凝血能力与非交联的中华鳖裙边胶原蛋白相比，差异不显著(P＞0.05)；而经过EDC/NHS交联后的中华鳖裙边胶原蛋白表现出极显著优势(P＜0.01)，且凝血效果最优。表明经过EDC/NHS交联后，可以将胶原蛋白转化为更有效的吸附性止血敷料，能迅速分解水合物，浓缩血液中的蛋白质和血小板，达到快速止血效果。

测试例(三)细胞毒性检测

小鼠成纤维细胞(L929)用于细胞毒性检测。L929细胞维持在DMEM完全培养基中，该培养基中添加了10％(v/v)的胎牛血清和1％(v/v)的青霉素/链霉素抗生素。

胶原浸提液的制备：将胶原样品切成1×1cm的小块浸入DMEM完全培养液中(3cm

(1)将处于对数生长期的L929细胞用DMEM完全培养液配制成2×10

(2)弃去原培养液，将胶原浸提液以每孔100μL注入，置于培养箱中分别培养48h，每个胶原样品设6个平行。

(3)取出待测的96孔板，每孔加入10μL噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/mL)，继续培养4h后弃去原培养液和MTT溶液，加入150μL二甲基亚砜(DMSO)溶液，避光震荡5min，用酶标仪在波长570nm处检测各孔的吸光值。根据下式计算细胞相对增殖率(RGR)：

RGR(％)＝OD570e/OD570b×100

其中，OD570e为样品组平均吸光值，OD570b为空白组平均吸光值。

(4)利用浸提液MTT比色法细胞毒性评级标准(表1)对非交联和交联改性的中华鳖裙边胶原蛋白的细胞毒性进行分级。若试验结果为0或1级，则材料合格；若试验结果为2级，则应结合细胞形态进行综合分析测评；若试验结果为3～5级，则为不合格。

表1浸提液MTT比色法细胞毒性评级标准

结果：经过48h的培养后，非交联的胶原蛋白、紫外辐射交联的胶原蛋白和EDC/NHS交联的胶原蛋白的细胞毒性分级为1级，呈弱毒性，基本符合生物材料安全性要求，L929细胞能够在其中维持正常的生长与增殖；而京尼平交联的胶原蛋白的细胞毒性分级为3级，严重影响细胞的存活率，不符合生物材料的安全性要求。

测试例(四)生物组织相容性检测

以EDC/NHS交联改性的中华鳖裙边胶原蛋白为三维细胞培养的载体支架，小鼠成纤维细胞(L929)用于生物组织相容性检测。L929细胞维持在DMEM完全培养基中，该培养基中添加了10％(v/v)的胎牛血清和1％(v/v)的青霉素/链霉素抗生素。

(1)将经过EDC/NHS交联改性的三维胶原支架切成1×1cm大小，置于DMEM完全培养液中浸泡过夜做预处理。

(2)取对数期、生长状态良好的L929细胞经消化吹打后，制成10

(3)将经过预处理的三维胶原支架置入24孔培养板，取50μL单细胞悬液滴加入已用三维支架铺底的培养板中，置于培养箱内培养，待细胞黏附后，补加1mLDMEM完全培养液，隔天换液1次。

(4)培养3d后将支架取出，浸入4％多聚甲醛中4℃固定15min，再用20％蔗糖溶液脱水处理45min后，置入OCT冰冻胶中进行包埋，按14μm厚度用冰冻切片机进行切片。

(5)将切片在离子水中水化30s后，滴加50μL DAPI染液，避光染色5min，用抗荧光淬灭封片剂封片后在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

结果：EDC/NHS交联改性的三维胶原支架的生物组织相容性如图8所示。成纤维细胞可顺利迁入EDC/NHS交联改性的三维胶原支架内部，分布较为均匀，且迁入后的细胞均附着在支架的胶原纤维上，表明该支架可为L929细胞的三维培养提供充足的营养和良好的生长空间，具备优良的生物组织相容性,是一种低毒、高细胞亲和性、且具有一定结构稳定性的胶原支架，具有作为生物医用材料的应用潜能。