植物来源的黄酮抗菌化合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及植物来源的黄酮抗菌化合物及其应用。

背景技术

多重耐药菌的快速传播对全球的公共卫生安全造成了严重的威胁，迫切需要新型的抗菌药物或抗菌增效剂。从历史上看，抗生素的发现主要是通过筛选土壤微生物的次级代谢产物。阻止致病菌生长。然而，这种方法重复率高，产量低，迫切需要挖掘新来源的抗菌化合物。以前从植物中发现小分子化合物，在不同目的的药物开发中取得了很大的进展。中草药的化学多样性展示了天然化合物用于治疗感染的优良效果，特别是使用奎宁和青蒿素治疗疟疾。由于缺乏哺乳动物的先进免疫系统，植物在进化上优化了特效药物类分子，以对抗细菌疾病。然而，自抗生素黄金时代以来，传统草药中尚未开发的化学多样性一直被忽视。

我们推断植物产生了对抗细菌病原体的活性化合物。植物富含多种多酚黄酮，包含15碳骨架的结构(C6-C3-C6)。黄酮类化合物广泛存在于草药中，在药物、营养和农业化学等方面具有多种用途。我们筛选出了很多带有异戊烯基并具有抗菌效果的黄酮化合物，如α-倒捻子素(AMG)和异补骨脂查尔酮(IBC)，不仅对MDR革兰阳性病原体具有抗菌效果，而且对MDR革兰阴性病原体或不同的革兰氏阴性病原体具有渗透外膜的有效性。此外，进一步的机制研究表明，这种黄酮类化合物在杀菌过程中，具有独特的作用方式。因此，植物来源的抗菌分子是一个未开发的宝库，以发现新的抗菌药物，来避免抗生素耐药性的日益普遍。综上，黄酮抗菌化合物及抗菌药物增效剂可为控制耐药菌发展提供有利保障，具有较高的开发和研究价值。

发明内容

本发明的目的是提供植物来源的抗细菌制剂。

本发明首先提供了37种具有抗革兰氏阳性耐药菌黄酮类化合物，此外本研究还提供了31种具有联合Colistin对抗mcr阳性的革兰氏阴性耐药菌。a)黄酮类化合物的母环结构：下面结构式中所示是黄酮类化合物的母环结构：即具有C6-C3-C6为基本骨架的一系列化合物。在黄酮母环结构上，C3位，C6位，C8位，C3'以及C5'更易被异戊烯基取代；

所述黄酮抗菌化合物的构效关系属于本发明的保护范围；主要包括异戊烯基的有无，数量，位置对革兰氏阳性菌抗菌活性的影响，其次还包括其他取代基和修饰包括环化，羟基和甲氧基可能对异戊烯基化黄酮类化合物抗菌活性的影响。

所述黄酮抗菌化合物的应用也属于本发明的保护范围；所述化合物的应用可为b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)或b7)或b8)： b1)抑制细菌；b2)制备抗细菌制剂；b3)预防细菌感染引起的疾病； b4)制备用于预防细菌感染引起的疾病的产品；b5)治疗细菌感染引起的疾病；b6)制备用于治疗细菌感染引起的疾病的产品；b7)防止食物腐败；b8)制备用于防止食物腐败的产品。

所述黄酮化合物联合多粘菌素的应用也属于本发明的保护范围；所述黄酮化合物联合多粘菌素的应用可为c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)：c1)抑制细菌；c2)制备抗细菌制剂；c3)预防细菌感染引起的疾病；c4)制备用于预防细菌感染引起的疾病的产品；c5)治疗细菌感染引起的疾病；c6)制备用于治疗细菌感染引起的疾病的产品。

上述任一所述细菌感染引起的疾病具体可为MRSA引发的皮肤组织感染以及VRE肠道定殖。

上述任一所述产品可为药物或疫苗。

本发明还保护所述黄酮化合物在恢复耐多粘菌素的革兰氏阴性菌对多粘菌素的敏感性中的应用。

上述应用中，所述革兰氏阴性菌多种革兰氏阴性菌。所述耐多粘菌素的革兰氏阴性菌具体可为含mcr耐药基因的革兰氏阴性菌。所述含 mcr耐药基因的革兰氏阴性菌具体可为含mcr-1耐药基因的大肠杆菌、含耐药基因的肺炎克雷伯菌、含mcr-1耐药基因的鲍氏不动杆菌、含mcr-1耐药基因的弗氏枸橼酸杆菌、含mcr-1耐药基因的解鸟氨酸乌拉尔菌、含mcr-1耐药基因的粘质沙雷氏菌、含mcr-1耐药基因的沙门氏菌、含mcr-3耐药基因的维氏气单胞菌、含mcr-1耐药基因的产碱普罗威登斯菌、含mcr-1耐药基因的植生乌拉尔菌或含mcr-1耐药基因的阴沟肠杆菌。所述含mcr-1耐药基因的大肠杆菌具体可为大肠杆菌(Escherichiacoli)12120478(mcr-1)、大肠杆菌(Escherichiacoli)1794 (mcr-1)、大肠杆菌(Escherichiacoli)WZ3909(mcr-1)、大肠杆菌(Escherichiacoli)878(mcr-1)、大肠杆菌(Escherichiacoli)C3(mcr-1)或大肠杆菌(Escherichia coli)B2(NDM-5+mcr-1)。所述的含耐药基因的肺炎克雷伯菌具体可为肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)38 或肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)40。所述含mcr-1耐药基因的鲍氏不动杆菌具体可为鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)17QD (mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的弗氏枸橼酸杆菌具体可为弗氏枸橼酸杆菌(Citrobacterfreumdii)2AP4RC(mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的解鸟氨酸乌拉尔菌具体可为解鸟氨酸乌拉尔菌(Raoultellaornithinolytica)68BC(mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的粘质沙雷氏菌具体可为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)99RC(mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的沙门氏菌具体可为沙门氏菌(Salmonellaenterica)SH30(mcr-1)或沙门氏菌(Salmonellaenterica) SH170(mcr-1)。所述含mcr-3耐药基因的维氏气单胞菌具体可为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)172(mcr-3)。所述含mcr-1耐药基因的产碱普罗威登斯菌具体可为产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)SLRD1WC(mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的植生乌拉尔菌具体可为植生乌拉尔菌(Raoultellaplanticola) DRRF15BC(mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的阴沟肠杆菌具体可为阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)ZWRF15BC(mcr-1)。

本发明还保护两种抗菌效果很好的抗细菌制剂，其包含黄酮抗菌化合物AMG和IBC。

实验证明，植物来源的抗菌分子是一个未开发的宝库，以发现针对 MDR病原菌的化合物，本研究首先提供了37种具有抗革兰氏阳性耐药菌黄酮类化合物，此外本研究还提供了31种具有联合Colistin对抗mcr 阳性的革兰氏阴性耐药菌。在结构上，异戊烯基的位置和数量对抗菌活性起着至关重要的作用。另外，其他取代基和修饰包括环化，羟基和甲氧基也可能对异戊烯基化黄酮类化合物的抗菌活性产生重要影响。本研究以化合物AMG或IBC作为异戊烯基化黄酮类化合物的代表，研究发现此化合物不具有溶血性和细胞毒性，具备较好的安全性；在动物实验中，黄酮类化合物AMG或IBC可以有效的抑制MDR革兰氏阳性菌引发的感染或污染，包括治疗由MRSA引起的伤口皮肤感染，清除VRE 的肠道定殖以及较好的防腐败和消毒作用。此外，黄酮化合物AMG或 IBC来源于植物，分子量小，结构简单，可大量获取和制备。因此，本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为黄酮抗菌化合物AMG和IBC与不同种类抗生素的协同效果。

图2为黄酮抗菌化合物AMG和IBC的溶血性试验。

图3为黄酮抗菌化合物AMG和IBC治疗小鼠伤口的皮肤感染；其中PBS为PBS组，IBC为IBC治疗组，AMG为AMG治疗组，抗生素组为万古霉素治疗组。

图4为黄酮抗菌化合物AMG或IBC可以有效清除VRE肠道定殖；其中PBS为PBS组，IBC为IBC治疗组，AMG为AMG治疗组，抗生素组为泰妙菌素治疗组。

图5为黄酮抗菌化合物AMG或IBC防腐败模型；

图6为黄酮抗菌化合物AMG或IBC消毒模型。

实施例

下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

BALB/c雌性小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。

MHB肉汤培养基为含牛肉粉1.5g/L、可溶性淀粉1.5g/L和酸水解酪蛋白17.5g/L的水溶液。

实施例1、植物来源的黄酮抗菌化合物的筛选

据估计，植物界现存大约有450000个物种，在《中国植物志》记载了中国的301科3408属31142种维管植物。黄酮类化合物广泛分布于植物中，履行许多功能。目前，超过5000个自然的黄酮类化合物已从各种植物中被鉴定。本发明首先从文献中查找了85个黄酮类化合物，包括23个黄酮，20个异黄酮，13个黄烷酮，10个查尔酮以及19个

方法1：采用肉汤稀释法(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI，2019)检测85种黄酮化合物的抗菌活性，测试菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 29213和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。检测85 种黄酮化合物对MRSA菌株的最小抑菌浓度的步骤如下：

1、用MHB肉汤培养基悬浮待测菌株，得到菌浓度为1×10

2、取85种黄酮化合物其中一种，用DMSO溶解并用MHB肉汤培养基稀释，得到浓度为512μg/mL的化合物溶液。

3、取96孔板，加入MHB肉汤培养基(每孔100μL)，第一列每孔加入步骤2制备的化合物溶液(每孔100μL)，倍比稀释至第十孔，第十孔弃掉100μL液体，之后每孔加入100μL步骤1制备的菌悬液，最终化合物溶液在孔中的浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、 32.0μg/mL、64.0μg/mL或128.0μg/mL，37℃静置培养16h-20h，观察孔内抑制细菌生长的最低浓度即为MIC。在96孔板中设置阴性对照孔和阳性对照孔。每个阴性对照孔加入200μLMHB肉汤培养基。每个阳性对照孔加入100μLMHB肉汤培养基和100μL步骤1制备的菌悬液。

方法2：采用棋盘分析法检测85种黄酮化合物与不同抗菌药物的协同作用，测试菌株为大肠杆菌ATCC 25922和多重耐药的大肠杆菌(Escherichia coli)B2(NDM-5+mcr-1)，棋盘分析法具体步骤如下：

1)用MHB肉汤培养基悬浮测试菌株，得到菌浓度为1×10

2)取85种黄酮化合物其中一种，用DMSO溶解并用MHB肉汤培养基稀释，得到浓度为256μg/mL的黄酮化合物溶液。

3)取抗菌药物(氨苄西林；头孢曲松；红霉素；氟苯尼考；庆大霉素；美罗培南；氧氟沙星；多粘菌素；利福平；四环素；氟苯尼考)，用DMSO溶解并用MHB肉汤培养基稀释，得到浓度为128μg/mL的抗菌药物溶液。

4)取96孔板，每孔加入100μLMHB肉汤培养基，最后一行每孔加入100μL步骤2)制备的黄酮化合物溶液(第一孔浓度为512μg/mL)，自第八行倍比稀释至第二行；第一列每孔加入加入步骤3)制备的抗菌药物溶液(每孔100μL)，倍比稀释至第十列，之后每孔加入100μL步骤1)制备的菌悬液，37℃静置培养16h-20h，观察黄酮化合物与不同抗菌药物联合使用抑制细菌生长时二者的最低浓度组合。设置阳性对照孔，每个阳性对照孔加入100μLMHB肉汤培养基和100μL步骤1)制备的菌悬液。

分级抑菌浓度FIC指数按照以下公式进行计算：

FIC＝MIC(A联合应用)/MIC(A单用)+MIC(B联合应用)/MIC(B单用)

实验结果如表1，结果表明，将近一半的黄酮类化合物(37/85)对药物敏感的金黄色葡萄球菌ATCC 29213和耐药MRSA T144(1-8μg/ mL)均具有强大的抗菌活性。需要强调的是，尽管所有的黄酮类化合物对革兰氏阴性菌大肠杆菌均无抗菌作用，但黄酮中的三分之一(31/85)可恢复带有mcr耐药基因E.coli B2对抗生素Colistin的敏感性。

表1

a表示在8μg/mL黄酮化合物作用下，抑制E.coli B2生长时，所需要colistin的最低浓度(μg/mL)；b表示colistin和黄酮化合物(8μg/mL)联合抑制E.coli B2生长时的FICI被展示出来。

实施例2、植物来源的黄酮抗菌化合物的筛选

在大多数黄酮类化合物中，都可以检测到异戊烯化。文献报道，黄酮类化合物发挥抗菌活性，与异戊烯基有关。在本研究中，通过构效关系的比较，我们发现异戊烯基是黄酮类化合物发挥抗菌活性必不可少的基团，但并非所有异戊烯基化的类黄酮都具有抗菌活性。在85个化合物中，有79个化合物具有异戊烯基基团，其中有46个化合物具有一个异戊烯基，有25个具有两个异戊烯基，有8个具有三个异戊烯基。然而，在85个化合物中，有37个化合物对MRSA具有抗菌活性，其中有36个化合物异戊烯化，有1个化合物未异戊烯化。其中，与一个或三个异戊烯化的化合物相比较，有两个异戊烯化(69.2％，18/26)的黄酮抗菌化合物占优势。并且，异戊烯基位于黄酮化合物骨架的C8(44.4％， 16/36)、C6(30.6％，11/36)、C3(22.2％，8/36)和C3’(16.7％，6/36)是其抗菌活性的先决条件，这与前人的研究结果一致。异戊烯基的存在增加了黄酮化合物的疏水性，这导致对细菌生物膜的亲和力更高，并与靶蛋白的相互作用更好，这是目前大家公认的对抗菌作用的解释。此外，异戊烯基在特定骨架中的位置和数量在抗菌活性中也起着重要作用。在本研究所测试的所有黄酮化合物中，活性较好的候选物都有两个异戊烯基。另外，其他取代基和修饰包括环化，羟基和甲氧基也可能对异戊烯基化黄酮类化合物的抗菌活性产生重要影响。

实施例3、黄酮化合物AMG，IBC抗菌活性的测定

本研究为了更好地发现效果最佳的先导化合物，从5大类黄酮中分别筛选出桑黄酮，5,7,4'-三羟基-6,3'-二异戊烯基异黄酮，光甘草醇，异补骨脂查尔酮(IBC)andα-倒捻子素(AMG)。由于发现AMG和IBC 不仅具有较好的抗革兰氏阳性菌的活性和协同Colistin抗革兰氏阴性菌的活性，而且具有较低的溶血性和细胞毒性，因此针对AMG和IBC做了更进一步的抗菌活性测定。

本部分主要测定了AMG和IBC对MDR细菌MRSA(23株)和 VRE(54株)的抗菌活性。其中还包括质控菌株ATCC 29213，ATCC 25922以及对照菌株E.coli B2。

待测菌株详见表2。

表2

注：a、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC No.29213和大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC No.25922均保藏于美国模式培养物集存库(简称ATCC，地址：American Type Culture Collection(ATCC)10801University Boulevard Manassas,VA20110USA)，公众可从美国模式培养物集存库获得。

b、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)VRE A4为万古霉素的耐药菌株。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)MRSA T144为甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌。名称中含有“NDM”的菌株均为产新德里金属β-内酰胺酶介导β-内酰胺类抗生素耐药的菌株。名称中含有“mcr”的菌株均为携带有多粘菌素耐药基因mcr的菌株。

c、文献1为Liu Y，Ding S，Dietrich R，

d、文献3为Ling Z，Yin W，Li H，et al.Chromosome-mediated mcr-3variants inAeromonas veronii from chicken meat[J].Antimicrobial agents and chemotherapy，2017， 61(11)：e01272-17.维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)172(mcr-3)在文献3中的名称为Aeromonas veronii 172。

e、来源中为自行分离的菌株的分离过程如下：(1)分别采集山东、河南、四川等省份的距离较远的不同屠宰场、养殖场内猪鼻拭子，超市内零售鸡肉、猪肉等，将其浸渍于BHI液体培养基中5min，并将其过滤，滤液保存于ESwab管中备用；(2)用接种环蘸取不同滤液涂布于含2μg/mL的多粘菌素的科马嘉尿道定位显色培养基上，37℃培养18h，挑选红色(大肠杆菌)、蓝色(肺炎克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属、肠杆菌属)或奶油色半透明(假单胞杆菌属)的单克隆菌株转接到BHI平板上，37℃培养18h。用超厚滤纸片从平板上刮取适当细菌转移到2ml无菌试管中，置于-20℃冰箱中保存备用；(3)挑选单克隆菌株接种于BHI液体培养基中增菌，然后提取基因组DNA；(4)以步骤(3)提取的基因组DNA为模板，采用常规PCR 扩增16SrRNA和测序的方法进一步确证菌属；同时，扩增mcr基因检测。

采用肉汤稀释法(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI，2019)检测AMG或IBC黄酮化合物的抗菌活性。检测对各待测菌株的最小抑菌浓度，步骤同实施例1的方法1：

实验结果见表3。结果表明，化合物AMG或IBC对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌)具有良好的抗菌活性，而对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)无抗菌活性。化合物AMG或IBC对革兰氏阳性菌(含耐药菌)的最小抑菌浓度分别为0.5-1μg/mL、4-8μg/mL。

表3

MRSA,耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌；VRE,耐万古霉素的肠球菌；AMG:α-倒捻子素；IBC: 异补骨脂查耳酮；VAN:万古霉素.E.coli B2,携带有多种抗生素耐药基因的临床分离株，包括 bla

实施例4、黄酮抗菌化合物AMG或IBC和抗菌药物的协同作用

四环素、替加环素属于四环素类药物。氟苯尼考属于氯霉素类药物。氨苄西林、头孢曲松、美罗培南属于β-内酰胺类药物。红霉素属于大环内酯类药物。庆大霉素属于氨基糖苷类化合物。氧氟沙星属于喹诺酮类药物。多粘菌素属于环肽类药物。利福平属于利福霉素类药物。

一、黄酮抗菌化合物AMG或IBC和不同抗生素的协同作用

首先，为了确定化合物AMG和IBC对不同类别的抗生素是否具有增强作用，因此，多药耐药菌E.coli B2作为模式菌株，针对包括抑制蛋白质合成的四环素，阻止DNA复制的氧氟沙星(喹诺酮类抗生素)，抑制RNA合成的利福平和氨苄西林(一种β-内酰胺抗生素)等抗生素进行测定。其次，为了验证协同抗菌效果，我们进一步评估了对87种耐药的临床大肠杆菌分离株的协同效果，其中77株来源于人的分离株和10株来自动物的分离株。为了进一步研究这种组合针对不同细菌的普遍性，我们随后测定了11种革兰氏阴性细菌的FIC值，这些所测试的革兰氏阴性菌几乎都存在mcr基因。

抗菌药物为四环素、替加环素、氟苯尼考、氨苄西林、头孢曲松、美罗培南、红霉素、庆大霉素、氧氟沙星、多粘菌素、利福平。

采用棋盘分析法检测化合物AMG或IBC与不同抗菌药物的协同作用，测试菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)B2(NDM-5+mcr-1)，棋盘分析法具体步骤同实施例1的方法2。

测试结果见图1。结果表明，化合物AMG或IBC和所测试抗菌药物(四环素、替加环素、氟苯尼考、氨苄西林、头孢曲松、美罗培南、红霉素、庆大霉素、氧氟沙星和利福平)的FIC指数均大于0.5，但协同多粘菌素的FIC指数0.04，因此化合物AMG或IBC和多粘菌素具有良好的协同作用。

二、黄酮抗菌化合物AMG或IBC恢复多粘菌素耐药的革兰氏阴性菌对多粘菌素的敏感性

采用棋盘分析法测定化合物AMG或IBC和抗菌药物对mcr阳性革兰氏阴性菌的协同作用，具体实验方法同实施例1的方法2。

实验结果见表4。结果表明，化合物AMG或IBC联合多粘菌素对药物敏感或耐药的革兰氏阴性菌的FIC指数为0.03-0.26，远远低于0.5。因此化合物AMG或IBC可恢复耐多粘菌素的革兰氏阴性菌对多粘菌素的敏感性。

表4

实施例5、黄酮抗菌化合物AMG或IBC的溶血性试验

PBS缓冲液为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。

8％红细胞悬浮液的制备方法如下：(1)取脱纤维羊血10mL，3000g 离心10min，弃上清，得到沉淀；(2)取步骤(1)得到的沉淀，用PBS 缓冲液清洗两次，得到100％红细胞悬浮液；(3)将8mL 100％红细胞悬浮液和92mL PBS缓冲液混合，得到8％红细胞悬浮液。

取化合物AMG或IBC，用DMSO溶解，然后用PBS缓冲液稀释，得到浓度为1024μg/mL的化合物AMG或IBC溶液。

1、在96孔板中前11列加入100ul/孔的PBS溶液，最后一列加入 100ul 0.2％Triton X-100作为阳性对照。

2、完成步骤1后，取所述96孔板，第一孔加入100μL化合物AMG 或IBC溶液，依次倍比稀释至第10列；第11列作为阴性对照。第一孔至第十孔浓度分别为：512μg/mL，256μg/mL，128μg/mL，64μg/mL， 32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL。

3、完成步骤2后，取所述96孔板，每孔加入100μL 8％红细胞悬浮液，37℃孵育1h，3000g离心10min，吸取100μL上清液至新的1.5ml 离心管中。

4、多功能酶标仪测量步骤3得到的上清液的OD

5、将步骤2替换为步骤a，其它步骤均不变，得到阴性对照OD

6、将步骤2替换为步骤b，其它步骤均不变，得到阳性对照OD

根据下述公式计算溶血率和半数溶血浓度Hly

溶血率＝(化合物AMG或IBC溶液OD576

部分实验结果见图2。结果表明，化合物AMG和IBC的Hly

实施例6、化合物AMG或IBC治疗小鼠皮肤感染

1、实验操作具体步骤

(1)小鼠称重分组，每组10只小鼠；

(2)BALB/c小鼠1％戊巴比妥钠，100uL腹腔注射麻醉，背部剃毛，剃干净。

(3)用铅笔画一个直径为0.5cm的圆形；一只鼠背部2个伤口重复；当伤口附近毛发长出及时清理，保证伤口周围干净无毛发。

(4)在伤口处滴上50uL的MRSA，菌浓度为2×10

(5)攻菌处理后1h，分别用10％DMSO，2mg/kg AMG，8mg/kg IBC，Van 1mg/kg(每组滴50uL进行治疗)

(6)感染一天后伤口化脓为造模成功；

(7)感染后第3，5，7，10，15天拍照，取伤口处皮肤(每次取四只鼠，四个伤口)，研磨，菌落计数。

2、统计感染后第3，5，7，10，15天伤口尺寸，并进行伤口处菌落计数。

实验结果见图3。结果表明，AMG和IBC可以促进MRSA引起的皮肤伤口愈合，对小鼠皮肤感染模型具有治疗效果，在体内的抗菌作用与万古霉素相似。

实施例7、化合物AMG或IBC可以有效清除VRE肠道定殖

分组：PBS组；AMG(1，4mg/kg)治疗组；IBC(16，64mg/kg)治疗组；对照泰妙菌素(2mg/kg)治疗组。

1、实验操作具体步骤

(1)0.5g/L AMP饮水处理五天之后；停药一天；取粪便，进行称重及VRE计数(CFU/g)；

(2)1×10

(3)VRE灌胃24h后，进行灌胃给药治疗(200ul)，6组小鼠分别给予PBS，AMG(1和4mg/kg)，IBC(16和64mg/kg)和泰妙菌素(2mg/kg)。

(4)每天固定时间，取粪便，称重及测VRE数目，共检测7天。给药治疗后1天和7天取回肠、盲肠及结肠内容物计数，且取部分各肠段分别用4％多聚甲醛固定及-80℃冻存(备注：给药第一天解剖一半的小鼠，取肠段；给药第七天再解剖剩下的那一半小鼠，取肠段)。

(5)将治疗前采集的粪便、治疗后1，3，7天的粪便和给药治疗后1天和7天肠段送赛诺百合公司，进行16s宏基因组测序，测肠道菌群相对丰度以及肠道菌群多样性(备注：粪便或者内容物可以多采集一点，例如每只小鼠采集三到四颗粪便，肠段内容物尽可能多采集)。

2、试验动物准备

实验动物：6周龄ICR小鼠。本实验均用无菌水，正常鼠粮。试验共分为6组，每组8只小鼠，正式实验需要48只小鼠。

3、实验的结果统计

治疗前采集的粪便、治疗后1，3，7天的粪便和给药治疗后1天和 7天肠段送赛诺百合公司，进行16s宏基因组测序。

实验结果见图4。由于AMG或IBC口服给药导致肠道内定殖的VRE 浓度降低。这些结果表明AMG或IBC在体内可以迅速杀死VRE。

实施例8、化合物AMG或IBC防腐败模型

接下来，在腐败模型中将AMG和IBC用作食品防腐剂。

1、实验操作具体步骤

(1)猪肉28块(每块5g)，随机分成7组；一组为阴性对照，不做处理；其余6组每组滴加200μL金黄色葡萄球菌ATCC 29213 6× 10

(2)置于37℃培养箱中放置24h，观察肉质、形态变化和气味；

(3)猪肉匀浆，梯度稀释，用金黄色葡萄球菌显色培养基进行菌落计数。

实验结果见图5。结果表明，AMG或IBC可以有效减少猪肉腐败模型中金黄色葡萄球菌的数量，经过AMG或IBC处理的肉的质量和气味得到了很好的保留。

实施例9、化合物AMG或IBC消毒模型

为了评估AMG和IBC作为餐具消毒剂的效果，研究了AMG和IBC 在装有MRSA的午餐盒上的消毒效果。

1、实验操作具体步骤

(1)饭盒28个，随机分成7组；一组为阴性对照，不做处理；其余6组每组饭盒底部涂抹含有金黄色葡萄球菌ATCC 29213 6×10

(2)之后分别滴加500μL不同浓度的AMG或IBC，具体浓度如下①0μg/mL药物；②AMG2mg/L；③AMG 5mg/L；④IBC 8mg/L；⑤IBC 20mg/L；化合物所选用的浓度分别对应2×MIC和5×MIC；⑥对照：新洁尔灭(2g/L)。

(3)室温静置2min后，用金黄色葡萄球菌显色培养基进行菌落计数。

实验结果见图6。结果表明，AMG或IBC的浓度分别为2μg/mL 和8μg/mL，可在2分钟时显着降低塑料午餐盒上的金黄色葡萄球菌的数量，并在10分钟内消除所有金黄色葡萄球菌，这与新洁尔灭的作用相似。因此，化合物AMG或IBC具有较好的消毒效果。