肿瘤特异性靶向的多肽及其应用

文献发布时间：2023-06-19 16:12:48

分案说明

本案为申请日为2020年05月11日，申请号为202010392677X，发明名称为“肿瘤靶向多肽及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于生物工程制药技术领域和蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，具体涉及肿瘤靶向多肽及其应用。

背景技术

肿瘤己经成为威胁人类健康和生命的罪魁祸首，因此，肿瘤的早期诊断以及肿瘤的有效治疗显得尤为重要并且迫切。对于肿瘤，常规影像诊断技术主要为B超、CT和MRI，这些影像诊断技术是通过显示组织的功能变化来达到诊断的结果，有较好的应用价值，但在鉴别诊断、全身分期和早期疗效评价上仍存在一定的不足。不可否认，筛选和优化靶向肿瘤的多肽是一种新的途径，可以为肿瘤的诊断、分期以及手术指导开发新型的分子显像药物，可以发现更微小病灶，达到早期诊断的目的。

花菁类染料具有分子量小、毒性低、波长可调范围广、以及摩尔消光系数大等优点，使其广泛地用于荧光标记领域。通过对花菁类染料结构的修饰，使其连接上具有活性的反应基团，然后与特异性靶分子如抗体、蛋白质、短肽、小分子等的氨基或羧基发生反应形成稳定的共价键，形成具有特异性靶向分子探针进行荧光分子活体成像是近红外荧光染料的一个重要用途。单光子发射计算机断层计算机断层扫描(Single-Photon emissiontomography-computerized tomography，SPECT-CT)是近20年来发展起来并在临床上推广的一种新型的核医学显像技术，主要是利用短半衰期放射性核素来标记具有特异性靶向的配体进行示踪显像，可显示活体内物质代谢、细胞增殖、受体分布等信息，用于疾病的诊断和人体生命活动的研究。所以，特异性靶向的配体是荧光成像以及放射性核素显像的关键。

基于以上考虑，申请人设计出了一类新型的肿瘤靶向多肽，这类多肽能特异性的靶向肿瘤，偶联荧光染料可进行光学成像来协助医生在利用分子影像手术导航设备时可以在术中精确定位肿瘤边界，来达到对肿瘤精准切除的目的，从而减少对病人创伤，降低术后复发的风险。除此之外，该靶向多肽还可偶联放射性核素进行核素成像，来达到肿瘤早期诊断和治疗的目的。

发明内容

本发明的首要目的在于提供几种结构新颖，肿瘤特异性靶向的多肽及其序列；

本发明的另一目的在于提供几种肿瘤特异性靶向的荧光探针的制备方法；

本发明的另一目的在于提供几种肿瘤特异性靶向的放射性探针的制备方法；

本发明的再一目的是提供几种所述的探针在光学及SPECT显像中的应用。

肿瘤特异性靶向的多肽，选自以下任一条多肽：

YQGA-2：D-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-D-Phe

YQGA-3：D-Asp-homoArg-Nva-(3-I-Tyr)-Nle-His-Hyp-(4-F-Phe)

YQGA-4：[Sar]-homoArg-Nva-(3-Cl-Tyr)-Nle-His-Hyp-Nle

YQGA-5：D-Asp-Arg-Val-Tyr-NH

YQGA-6：D-Asp-homoArg-Nva-Tyr-NH

YQGA-7：D-Asp-homoArg-Nva-(4-OCH

YQGA-8：Asp-homoArg-Nva-Tyr-NH

YQGA-9：Mpa-D-Asp-Arg-Val-Tyr-Lys-Cys,其中MPA-Cys二硫键成环；

YQGA-10：Mpa-D-Asp-Arg-Val-Tyr-Cys-Lys,其中MPA-Cys二硫键成环；

YQGA-11：β-Ala-D-Asp-Arg-Val-Tyr-Lys-Asp(β-Ala氨基和Asp主链羧基成环)

YQGA-12：β-Ala-D-Asp-Arg-Val-Tyr-Asp-Lys(β-Ala氨基和Asp主链羧基成环)

其中：D-Asp：D型天门冬氨酸；homoArg：高精氨酸；Nva：正缬氨酸；Nle：正亮氨酸；Hyp：羟脯氨酸；4-F-Phe：4-氟-苯丙氨酸；4-OCH

肿瘤特异性靶向的多肽在制备肿瘤诊断试剂中的应用优选在制备肿瘤诊断显像剂中的应用；进一步优选在制备肿瘤边界的精准定位和术中影像导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中的应用；所述的肿瘤特异性靶向的多肽选自以下任意一条多肽：

YQGA-1：Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

YQGA-2：D-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-D-Phe

YQGA-3：D-Asp-homoArg-Nva-(3-I-Tyr)-Nle-His-Hyp-(4-F-Phe)

YQGA-4：[Sar]-homoArg-Nva-(3-Cl-Tyr)-Nle-His-Hyp-Nle

YQGA-5：D-Asp-Arg-Val-Tyr-NH

YQGA-6：D-Asp-homoArg-Nva-Tyr-NH

YQGA-7：D-Asp-homoArg-Nva-(4-OCH

YQGA-8：Asp-homoArg-Nva-Tyr-NH

YQGA-9：Mpa-D-Asp-Arg-Val-Tyr-Lys-Cys,其中MPA-Cys二硫键成环；

YQGA-10：Mpa-D-Asp-Arg-Val-Tyr-Cys-Lys,其中MPA-Cys二硫键成环；

YQGA-11：β-Ala-D-Asp-Arg-Val-Tyr-Lys-Asp(β-Ala氨基和Asp主链羧基成环)

YQGA-12：β-Ala-D-Asp-Arg-Val-Tyr-Asp-Lys(β-Ala氨基和Asp主链羧基成环)

其中：D-Asp：D型天门冬氨酸；homoArg：高精氨酸；Nva：正缬氨酸；Nle：正亮氨酸；Hyp：羟脯氨酸；4-F-Phe：4-氟-苯丙氨酸；4-OCH

一种具有肿瘤靶向的荧光成像功能的多肽化合物，结构中含有用于靶向肿瘤的多肽和用于光学成像的红外荧光染料结构，其结构通式如下式(I)所示：

其结构中含有用于靶向肿瘤的多肽R和用于光学成像的近红外荧光染料结构MPA以及起到增加靶向多肽与近红外荧光染料之间的距离并调节体内药代动力学特性的连接剂L。

所述多肽R选自本发明上述肿瘤特异性靶向的多肽YQGA-X(X＝1-12)中的任意一条。

所述的药物连接剂L选自如结构式(II)所示L1、L2、L3及L4；

本发明还提供了制备所述多肽荧光探针的方法，包括：

1)近红外荧光染料MPA的合成

将冰醋酸、对肼基苯磺酸、甲基异丙基酮和醋酸钠混合反应，纯化后得产物2,2,3-三甲基[3H]-吲哚-5-磺酸；再将邻二氯苯加入到2,2,3-三甲基[3H]-吲哚-5-磺酸与1,3-丙磺酸内脂的混合物中，制得2,2,3-三甲基-5-磺酸-1-(3-磺酸-丙基)-[3H]-吲哚。再将该产物与N-[(3-(anilinomethylene)-2-chloro-1-cyclohexen-1-yl)methylene]-anilinemonohydrochloride反应得到绿色碳菁染料，最后将碳菁染料与巯基丙酸及三乙胺反应，制备液相分离纯化得水溶性近红外染料MPA。

2)MPA-L-YQGA-X(X＝1-12)的合成

将分离纯化得到的近红外染料MPA与固相合成的L-YQGA-X(X＝1-12)多肽溶于二甲基亚砜中，加入适量的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温反应过夜，反应完成后经制备液相纯化分离得到目标荧光化合物。

本发明所述的具有肿瘤靶向的荧光成像功能的多肽化合物在制备肿瘤诊断试剂中的应用；优选在制备肿瘤诊断显像剂中的应用；进一步优选在制备肿瘤边界的精准定位和术中影像导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中的应用。

在此基础上，本发明进一步提供一种放射性核素探针，它是放射性核素锝标记的单体多肽配合物以及二聚体多肽配合物，结构式如(III)、(IV)、(V)所示：

单体形式的靶向配合物较二聚体形式制备较简单，其二聚体结构中含有用于靶向肿瘤的多肽YQGA-X和用于放射性标记的双功能螯合剂6-肼基吡啶-3-甲酸(HYNIC)，谷氨酸连接三分子连接剂L的支架(3L-E)，以及起到增加靶向多肽与放射性核素配体N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)和三苯基膦三间磺酸钠盐(TPPTS)之间距离并调节体内药代动力学特性的连接剂L，L选自L1、L2、L3、L4。其中，通过对双功能螯合剂的改变，比如替换成双功能螯合剂DOTA，NOTA、MAG

本发明还提供了制备所述单体和二聚体放射性核素探针制备的方法，包括：

1)双功能螯合剂HYNIC-L-NHS的合成

将6-氯烟酸和80％水合肼加入到乙醇中，加热回流反应，反应完成后减压旋蒸溶剂，得到的粘稠物加入到蒸馏水中，调PH＝5.5左右，析出固体，抽滤烘干得到黄色固体，产品经ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为6-联肼烟酸。得到的6-联肼烟酸和对氨基苯甲醛加入到二甲基亚砜(DMSO)中，加热反应5-6小时，反应完成后加入到水中析出，抽滤得固体，此固体烘干后与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一起加入到DMSO中室温反应，反应完成后加入水中析出固体，此固体通过硅胶柱纯化后经ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为中间体HYNIC-NHS，然后此中间体和连接剂L在碱性条件下反应，最后用活化剂EDCI和NHS活化，纯化后得到HYNIC-L-NHS固体待用。

2)支架(2L-E)的合成

取适量的Boc-谷氨酸溶于DMSO中，加入2倍摩尔量的EDCI和NHS 60度加热反应30min后HPLC分析谷氨酸双活化酯已生成，然后往溶液中加入2倍摩尔量的连接剂L和3倍摩尔量的DIPEA 60℃加热反应30min后HPLC分析2个PEG

3)中间体3L-E-HYNIC-NHS的合成

将制备得到的支架2L-E溶于DMSO中，然后加入相同摩尔量的HYNIC-L-NHS，再加入3倍摩尔量的DIPEA，室温反应2小时，反应完成后通过制备液相分离纯化并通过质谱对目标化合物进行确证,纯化后的产物用EDCI和NHS活化，纯化后得到3L-E-HYNIC-NHS待用。

4)(YQGA-X)

将纯化的中间体3L-E-HYNIC-NHS溶于DMSO中，加入0.5摩尔量的靶向肽YQG-X，然后再加入2摩尔量的DIPEA，室温反应1小时，反应完成后通过制备液相进行分离纯化并通过质谱确证。

5)放射性探针

分别配制浓度为100.0mg/mL的TPPTS(三苯基磷三间磺酸钠)溶液，浓度为130.0mg/mL的Tricine(三甲基甘氨酸)，浓度为102.4mg/mL丁二酸-丁二酸钠缓冲液(其中丁二酸77.0mg，丁二酸钠25.4mg)，分别取10.0uL TPPTS溶液，10.0uL Tricine溶液，10.0uL丁二酸-丁二酸钠缓冲液分别和10.0uL(1.0mg/mL)所述HYNIC-3L-E-(YQGA-X)

本发明所述的放射性核素探针在制备肿瘤诊断试剂中的应用；优选在制备肿瘤诊断显像剂中的应用；进一步优选在制备肿瘤边界的精准定位和术中影像导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中的应用。

本发明所述的多肽化合物可特异性靶向至肿瘤部位，并且在肿瘤部位有良好的摄取和滞留能力，具有较高的靶/非靶比值，适合用作荧光肿瘤显像剂以及放射性核素显像剂及治疗剂，并可用于制备肿瘤术中影像导航及肿瘤边界精准定位的光学显像药物。

本发明所述的新型多肽及以此系列多肽构建的荧光以及放射性核素探针与现有技术相比的有益效果为：

1、本发明发现的YQGA-X系列多肽是低分子量多肽，并且此系列多肽有几个或多个氨基酸是经修饰的非天然氨基酸，非天然氨基酸的引入可极大地提高此系列多肽在活体内的稳定性。

2、YQGA-X系列多肽经体内光学和放射性核素显像结果证实对多种肿瘤具有优异的显像效果，包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、宫颈癌等。此系列多肽构建的探针能特异性靶向肿瘤部位的性质将有可能实现对恶性肿瘤的核医学诊断、治疗以及光学成像指导外科医生进行手术导航，达到对病灶的精准切除。

3、本发明中使用了稳定性以及水溶性更理想的近红外荧光染料MPA作为光学显像基团，改善了药物在体内的药代动力学。

4、本发明中引入了多个水溶性的PEG

5、本发明中使用HYNIC作为双功能螯合剂，同时使用Tricine和TPPTS作为协同配体从而使“

以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为实施例1制备的荧光化合物MPA-PEG

图2为实施例2制备的

图3为实施例4制备的放射性化合物

图4为实施例8制备的放射性化合物

图5为实施例9制备的放射性化合物

图6为实施例10制备的放射性化合物

图7为实施例14制备的放射性化合物

图8为实施例14制备的放射性化合物

图9为实施例22制备的放射性化合物

图10为实施例23制备的荧光化合物MPA-Aca-YQGA-6在荷瘤鼠体内的荧光成像：A为在肝癌HepG2荷瘤鼠体内的荧光成像；B为在乳腺癌MCF-7荷瘤鼠体内的荧光成像。

图11为实施例25制备的放射性化合物

图12为实施例26制备的放射性化合物

图13为实施例28制备的放射性化合物

图14为实施例29制备的放射性化合物

图15为实施例30制备的放射性化合物

图16为实施例31制备的放射性化合物

具体实施方式

以下通过具体的实施例和应用例来进一步说明本发明：其中合成步骤中所使用的化学物质均为现有物质或市售商品。各实施例中所涉及的多肽均委托杭州固拓生物科技有限公司合成。

实施例1制备的荧光化合物MPA-PEG

称取委托杭州固拓生物科技有限公司固相合成的PEG

实施例2制备的放射性化合物

1)双功能螯合剂HYNIC-PEG

将1g 6-氯烟酸和2.0mL 80％水合肼加入到10mL乙醇中，加热回流反应4小时，反应完成后减压旋蒸溶剂，得到的粘稠物加入到蒸馏水中，调pH＝5.5左右，析出固体，抽滤烘干得到黄色固体0.86g，产品经ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为6-联肼烟酸。得到的0.86g 6-联肼烟酸和0.61g对氨基苯甲醛加入到3.0mL二甲基亚砜(DMSO)中，加热反应5-6小时，反应完成后加入到水中析出，抽滤，烘干得固体1.2g。此烘干的1.2g固体后与2.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)以及1.5g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一起加入到DMSO中室温反应，反应完成后加入水中析出固体，此固体通过硅胶柱纯化后干燥，称重1.3g，经ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为目标产物，ESI-MS：[M+H]＝382.1508。此产物纯化后加入1摩尔量的PEG

2)将纯化的5mg中间体HYNIC-PEG

3)放射性化合物

4)放射性化合物

实施例3制备的放射性化合物

实施例2制备的放射性化合物

实施例4制备的放射性化合物

参照实施例2方法制备放射性化合物

实施例5制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例6制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例7制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例8制备的放射性化合物

参考实施例2方法制备放射性化合物

实施例9制备的放射性化合物

参考实施例2方法制备放射性化合物

实施例10制备的放射性化合物

参考实施例2方法制备放射性化合物

实施例11制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例12制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例13制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例14制备的放射性化合物

参照实施例2方法制备放射性化合物

实施例15制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例16制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例17制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例18制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例19制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例20制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例21制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例22制备的放射性化合物

制备的放射性药物

1)双功能螯合剂HYNIC-PEG

2)支架(PEG

将5.0g叔丁氧羰基(t-Butyloxy carbony)保护的谷氨酸，8.3g二环己基碳二亚胺(DCC)以及4.6g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到100mL有机溶剂四氢呋喃(THF)中，室温搅拌过夜进行双羧基活化，反应完成后抽滤，滤液用THF进行洗涤，洗涤完成后不进一步纯化，直接加入到50mL的二甲基亚砜(DMSO)中溶解，然后加入10g PEG

3)中间体(PEG

将制备得到的0.5g支架(PEG

4)HYNIC-3PEG

将纯化的5mg中间体3PEG

6)按实施例3相同方法将

实施例23制备的荧光化合物MPA-Aca-YQGA-6在肝癌HepG2荷瘤鼠体内的荧光成像

按实施例1制备荧光化合物MPA-Aca-YQGA-6并配制成生理盐水溶液(100nmol/mL)，取0.1mL(约10nmol)分别注射于3只肝癌HepG2荷瘤裸鼠(体重约22克)尾静脉，并于给药后1h、2h、4h、8h、10h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物MPA-Aca-YQGA-6在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从2h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显摄取,并且可以推断出此探针主要通过肾脏代谢(图10A)。

实施例24制备的荧光化合物MPA-Aca-YQGA-6在乳腺癌MCF-7荷瘤鼠体内的荧光成像

按实施例1制备荧光化合物MPA-Aca-YQGA-6并配制成生理盐水溶液(100nmol/mL)，取0.1mL(约10nmol)分别注射于3只乳腺癌MCF-7荷瘤裸鼠(体重约22克)尾静脉，并于给药后1h、2h、4h、8h、10h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物MPA-Aca-YQGA-6在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从2h的成像图中(图10B)可以看出探针已经在肿瘤中有明显摄取,并且可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。

实施例25制备的放射性化合物

参照实施例2方法制备放射性化合物

实施例26制备的放射性化合物

参照实施例2相同方法制备放射性化合物

实施例27制备的放射性化合物

按实施例3相同方法将

实施例28制备的放射性化合物

参照实施例2方法制备放射性化合物

实施例29制备的放射性化合物

参照实施例2方法制备放射性化合物

实施例30制备的放射性化合物

参照实施例2方法制备放射性化合物

实施例31制备的放射性化合物

参照实施例2方法制备放射性化合物

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该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：顾月清;涂远彪;刘培飞;王芳;
专利申请人：中国药科大学;