用于基因编辑的组合物及其应用

文献发布时间：2023-06-19 16:20:42

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及用于基因编辑的组合物及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是来源于古细菌和细菌的一种抵御质粒、噬菌体等外源DNA片段入侵的获得性免疫机制。该系统主要由CRISPR序列和编码Cas蛋白的基因座发挥功能，目前最常用的是Ⅱ型家族的Cas9核酸酶，这一系统只需要单一的效应蛋白就可发挥作用。当外源DNA入侵细菌时,Ⅱ型CRISPR系统首先将入侵DNA整合到CRISPR重复序列之间。随后,包含入侵DNA序列的CRISPR RNA(crRNA)被转录和加工出来。此后，反式激活crRNA(transactivating CRISPR RNA,tracrRNA)与crRNA结合,并最终与Cas9蛋白形成复合物。最后，Cas9蛋白通过其HNH和RuvC样结构域发挥核酸内切酶作用引发DNA双链断裂。DNA的双链断裂会引发损伤修复机制，当有同源模板存在的情况下，细胞会发生精确的同源重组修复，从而可以实现外源序列的插入或替换。迄今，CRISPR/Cas9技术已经在很多领域得以成功应用，显示出广阔的前景。但是，利用同源重组方式进行精确的基因治疗依然面临很多困难，其中一个主要限制因素就是同源重组的效率非常低。虽然有不少研究报道了多种提高同源重组率的方法，但越来越多的证据表明这些方法并不适用于所有类型的细胞且效果也并不一致。因此，在特定细胞中找到有效提高同源重组的方法并筛选高效整合和切割的位点对基于细胞类型的细胞治疗尤为重要。

嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR-T)是近年来兴起的一种新型过继免疫疗法。它将患者T细胞在体外进行基因改造，经过一定扩增后回输至患者体内，从而实现肿瘤的靶向杀伤。目前，已有三款CAR-T产品被美国食品药品监督管理局批准用于血液肿瘤的临床治疗，标志着CAR-T技术的巨大成功。但是，作为新兴的技术，CAR-T技术在各方面依然面临着很多挑战，有巨大的改进空间。首先，现在最常用的方法是利用病毒系统导入外源序列。但是，使用病毒系统存在制备成本高、有随机插入的安全隐患等问题。其次，包括病毒制备在内的传统技术无法实现外源序列在基因组中的精确插入，这样会造成细胞均一性差而影响疗效，也无法对T细胞进行更多的改造。另外，目前CAR-T疗法都是个性化治疗，存在生产成本高、周期长、效果有限等问题。因此，利用CRISPR/Cas9等技术实现CAR等人工改造元件在T细胞中的定点整合，对推动现有T细胞疗法的发展具有重要意义。一方面它可以避免外源序列随机插入带来的不确定性，提高细胞产品的均一性和稳定性。另一方面它可以实现T细胞的多样化改造，既可以一步构建通用型CAR-T细胞，通过调控内源基因构建增强型细胞产品，也可以实现人工元件的动态化表达，对拓展现有技术的应用有很大的帮助。但是，由于T细胞本身细胞类型的特殊性，通过同源重组实现外源序列定点整合的效率一直很低。因此，本领域迫切需要开发一种提高T细胞中同源重组效率的方法，同时也需要筛选高效整合和切割的位点。

发明内容

本发明的目的在于提供提高T细胞中同源重组效率的方法，并提供可特异性结合gRNA的源自PD1基因的靶序列，以及针对这段靶序列可实现高效整合和切割的gRNA位点。

在本发明的第一方面，提供了一种靶序列，所述靶序列选自下组：

(1)SEQ ID NO.:1所示的第40-130位(较佳地第50-122位)的核苷酸序列；

(2)将SEQ ID NO.:1所示的第40-130位(较佳地第50-122位)的核苷酸序列经过一个或多个(≤10个，如2-8个，优选为3-5个)核苷酸的取代、缺失或添加而形成的衍生核苷酸，并且所述靶序列特异性与gRNA结合。

在另一优选例中，所述靶序列选自下组：

(1)具有SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列的多核苷酸；

(2)与SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列的同源性≥95％，较佳地≥98％，更佳地≥99％的多核苷酸；

(3)与上述(1)-(2)互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述靶序列包含如SEQ ID NO.:3-15中任一项所示的序列。

在另一优选例中，所述靶序列来源于PD1基因。

本发明第二方面提供了一种gRNA序列，所述gRNA序列与本发明第一方面所述的靶序列互补。

在另一优选例中，所述gRNA包括crRNA、tracrRNA、sgRNA。

在另一优选例中，所述gRNA包括未修饰和经修饰的gRNA。

在另一优选例中，所述经修饰的gRNA包括碱基的化学修饰。

在另一优选例中，所述化学修饰包括甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰。

在另一优选例中，所述gRNA的靶向序列包含SEQ ID NO.:16-28中任一所示的序列。

本发明第三方面提供了一种基因编辑系统，所述系统包括基因编辑酶和gRNA，所述gRNA与本发明第一方面所述的靶序列互补。

在另一优选例中，所述基因编辑酶选自下组：CRISPR相关蛋白(Cas)多肽、TALEN酶、ZFN酶、或其组合。

在另一优选例中，所述基因编辑酶来源于微生物；优选地来源于细菌。

在另一优选例中，所述基因编辑酶的来源选自下组：酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、犬链球菌(Streptococcus canis)、或其组合。

在另一优选例中，所述基因编辑酶包括野生型或突变型的基因编辑酶。

在另一优选例中，所述基因编辑酶选自下组：Cas9、Cas12、Cas13、Cms1、MAD7、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1、或其组合。

在另一优选例中，所述gRNA包括crRNA、tracrRNA、sgRNA。

在另一优选例中，所述gRNA包括未修饰和经修饰的gRNA。

在另一优选例中，所述经修饰的gRNA包括碱基的化学修饰。

在另一优选例中，所述化学修饰包括甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰。

在另一优选例中，所述的基因编辑包括体内基因编辑、体外基因编辑。

在另一优选例中，所述的基因编辑包括基于CRISPR的基因编辑或定点敲入供体DNA。

在另一优选例中，所述靶序列选自下组的靶位点：PD1。

在另一优选例中，所述gRNA的靶向序列包含SEQ ID NO.:16-28中任一项所示的序列。

在另一优选例中，所述组合物还包括供体DNA。

在另一优选例中，所述供体DNA为双链DNA。

在另一优选例中，所述的供体DNA包括第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一同源臂和第二同源臂能够启动所述供体DNA在基因组的靶位点处由细胞介导的同源重组。

在另一优选例中，所述第一同源臂和第二同源臂的序列长度各自独立的为200-2000bp，较佳地，400-1000bp，更佳地，700-900bp。

在另一优选例中，所述的第一同源臂与基因组的靶位点的切割位点的上游侧(或左侧)序列是同源的，而所述的第二同源臂与基因组的靶位点的切割位点的下游侧(或右侧)序列是同源的。

在另一优选例中，所述靶位点包括PD1。

在另一优选例中，所述供体DNA还包括目的基因。

在另一优选例中，所述目的基因包含嵌合抗原受体或TCR的编码序列。

在另一优选例中，所述供体DNA的序列长度为50bp－5000bp，较佳地，80bp－4000bp。

在另一优选例中，所述目的基因的长度为50bp-3000bp，较佳地，1000bp-2200bp。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体或TCR的编码序列的长度为50bp-3000bp，较佳地，1000bp-2000bp。

在另一优选例中，所述第一同源臂的序列长度D1和第二同源臂的序列长度D2之比(D1/D2)为(0.8-1.2):(0.5-1.5)，较佳地(0.9-1.1):(0.7-1.3)，更佳地，1:1。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体含有靶向肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体包括靶向肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域、任选的绞链区、跨膜结构域和细胞内信号传导结合域。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞标志物选自下组：α叶酸受体、5T4、αvβ6整联蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包含ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、存活蛋白、TAG72、TEM、VEGFR2、WT-1、或其组合。

在另一优选例中，所述绞链区为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、Ig(免疫球蛋白)铰链、CD28、或其组合。

在另一优选例中，所述跨膜结构域为选自下组的蛋白的跨膜区：CD8α、CD8β、CD28、CD33、CD37、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、或其组合。

在另一优选例中，所述细胞内信号传导结合域包括共刺激信号分子和/或初级信号传导结构域。

在另一优选例中，所述共刺激信号分子选自下组：OX40、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、LIGHT、DAP10、CDS、ICAM-1、CD278(ICOS)、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD54(ICAM)、CD83、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、ZAP70、或其组合。

在另一优选例中，所述初级信号传导结构域选自下组：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、或其组合。

在另一优选例中，所述供体DNA的序列如SEQ ID NO.:29-31中任一项所示。

本发明第四方面提供了一种细胞，所述细胞经本发明第三方面所述的基因编辑系统进行编辑后获得。

在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。

在另一优选例中，所述的细胞包括原代细胞和传代的细胞。

在另一优选例中，所述细胞包括T细胞，

在另一优选例中，所述细胞包括CD3+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD4+调节T细胞、CD8+T细胞、记忆性T细胞。

本发明第五方面提供了一种组合物，包括：

本发明第三方面所述的系统或本发明第四方面所述的细胞；和

药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物还包括表达复合物，所述表达复合物包括编码外源蛋白质的核酸分子。

在另一优选例中，所述外源蛋白质是能够在细胞中表达的蛋白。

在另一优选例中，所述外源蛋白质是能够在细胞表面上表达的重组受体。

在另一优选例中，所述重组受体包括嵌合抗原受体(CAR)、TCR、嵌合表面受体。

在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物为液态。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括注射剂或针剂。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为静脉注射剂型或瘤内注射剂型。

在另一优选例中，所述的组合物中，本发明第三方面所述的系统或本发明第四方面所述的细胞占所述组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。

本发明第六方面提供了一种药盒，包括：

第一容器，以及活性成分或含有所述活性成分的药物，所述活性成分或所述药物位于所述第一容器中，所述活性成分包含本发明第三方面所述的系统、或本发明第四方面所述的细胞、或本发明第五方面所述的组合物。

在另一优选例中，所述活性成分或所述药物为单方制剂。

在另一优选例中，所述活性成分或所述药物的剂型为注射剂型或针剂。

在另一优选例中，所述活性成分或所述药物的剂型为静脉注射剂型或瘤内注射剂型。在另一优选例中，所述药盒还含有说明书，所述说明书中记载了向施用对象给予所述活性成分或所述药物，从而预防和/或治疗疾病的说明。

在另一优选例中，所述施用对象为细胞。

在另一优选例中，所述施用对象为T细胞。

在另一优选例中，所述施用对象为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述施用为将所述活性成分或所述药物与T细胞接触，或者是将所述活性成分或所述药物通过注射方式注入人体内。

本发明第七方面提供了一种对细胞进行基因编辑的方法，包括将所述细胞接触本发明第三方面所述的基因编辑系统或本发明第五方面所述的组合物或本发明第六方面所述的药盒。

在另一优选例中，所述接触在体外进行。

在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。

在另一优选例中，所述的细胞包括原代细胞和传代的细胞。

在另一优选例中，所述细胞包括T细胞，

在另一优选例中，所述细胞包括CD3+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD4+调节T细胞、CD8+T细胞、记忆性T细胞。

本发明第八方面提供了一种用于基因编辑的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第三方面所述的基因编辑系统或本发明第五方面所述的组合物或本发明第六方面所述的药盒。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括标签或说明书。

在另一优选例中，所述标签或所述说明书中记载了向编辑对象给予所述系统或所述组合物或所述药盒，从而进行基因编辑的说明。

在另一优选例中，所述编辑对象包括细胞。

在另一优选例中，所述细胞包括T细胞，

在另一优选例中，所述细胞包括CD3+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD4+调节T细胞、CD8+T细胞、记忆性T细胞。

本发明第九方面提供了一种本发明第三方面所述的基因编辑系统、本发明第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的组合物或本发明第六方面所述药盒的用途，用于制备用于预防和/或治疗疾病的药物。

在另一优选例中，所述疾病包括癌症。

在另一优选例中，所述癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤。

在另一优选例中，所述癌症包括PD-L1高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述癌症选自下组：白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、脑癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、间皮素瘤、或其组合。

本发明第十方面提供了一种治疗疾病的方法，包括向受试者施用有效量的本发明第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的组合物或本发明第六方面所述的药盒。

在另一优选例中，所述疾病选包括癌症。

在另一优选例中，所述癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤。

在另一优选例中，所述癌症包括PD-L1高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述施用包括注射施用。

在另一优选例中，所述受试者为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

本申请的附图中，“Untreated T”表示未处理的T细胞，“Control”表示只电转了同源模板和Cas9的T细胞，“LV-19bbz”表示用慢病毒制备的CD19-CART细胞，“PD1-19bbz”表示非病毒PD1定点整合型CD19-CART细胞。

图1显示了PD1基因高效整合sgRNA位点筛选，为CD19-CAR序列在PD1位点重组率。

图2显示了PD1基因CRISPR/Cas9高效切割sgRNA位点筛选，为通过ICE方法检测PD1位点敲除率。

图3显示了PD1基因高效整合sgRNA位点筛选，为mTurquoise2荧光蛋白序列在PD1位点重组率。

图4显示了PD1基因高效整合sgRNA位点筛选，为CD19-CAR序列在PD1位点重组率。

图5显示了PD1基因CRISPR/Cas9高效切割sgRNA位点筛选，为通过ICE方法检测PD1位点敲除率。

图6显示了PD1定点整合CD19-CART细胞DNA测序结果。HA代表同源臂。

图7显示了PD1定点整合CD19-CART细胞阳性率和敲除率。A图为不同健康供体T细胞制备的PD1定点整合CD19-CART细胞阳性率；B图为五个代表性的不同健康供体T细胞制备的PD1定点整合CD19-CART细胞阳性率和敲除率；C图为流式分析显示PD1定点整合CD19-CART细胞阳性率，对照组为只电转同源模板和Cas9；D图为PD1定点整合CD19-CART细胞与慢病毒制备CD19-CART细胞的PD1表达比较。

图8显示了PD1定点整合CD19-CART细胞与靶细胞共培养体外扩增。

图9显示了PD1定点整合CD19-CART细胞表面标志物表达。对照组为只电转同源模板和Cas9。

图10显示了PD1定点整合CD19-CART细胞分泌因子检测。对照组为只电转同源模板和Cas9。

图11显示了PD1定点整合CD19-CART细胞体外杀伤。对照组为只电转同源模板和Cas9。

图12显示了PD1定点整合CD19-CART细胞体内杀伤。肿瘤靶细胞为PD-L1过表达的Raji细胞。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外的筛选到了可特异性结合gRNA的源自PD1基因的靶序列，并且针对该靶序列创造性地设计对PD1进行高效基因编辑的gRNA，本发明还首次发现含有该gRNA、基因编辑酶(在某些情况下还含有供体DNA)的基因编辑组合物具有很高的敲除率和重组率。在此基础上完成了本发明。

术语

CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(比如gRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。

此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA(single-guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。

作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的gRNA，可靶定任何dsDNA序列，而gRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA。这种技术被称为CRISPR/Cas9基因编辑系统。

靶向整合机制

在本发明的靶向整合策略中，提供了一种含有特定长度的同源臂的线性化供体(即供体DNA或外源核酸)，这种供体是通过PCR扩增或者精确酶切获得的含有一定长度(比如，700-900bp)同源臂的转基因供体；将供体DNA或外源核酸与Cas9蛋白以及guide RNA一起电转到细胞中。本发明提供的靶向整合策略相比于已有的基因靶向策略具有更高的整合效率。

基因编辑系统

本发明提供了一种基因编辑系统，所述系统包括基因编辑酶和gRNA，所述gRNA与来源于PD1基因的靶序列互补。

在一优选实施方式中，所述靶序列选自下组：

(1)SEQ ID NO.1所示的第40-130位(较佳地第50-122位)的核苷酸序列；

(2)将SEQ ID NO.1所示的第40-130位(较佳地第50-122位)的核苷酸序列经过一个或多个(≤10个，如2-8个，优选为3-5个)核苷酸的取代、缺失或添加而形成的衍生核苷酸，并且所述靶序列特异性与gRNA结合。

在一优选实施方式中，所述靶序列选自下组：

(1)具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的多核苷酸；

(2)与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的同源性≥95％，较佳地≥98％，更佳地≥99％的多核苷酸；

(3)与上述(1)-(2)互补的多核苷酸。

在一优选实施方式中，所述靶序列如SEQ ID NO.:3-15所示。

在一优选实施方式中，本发明的基因编辑系统还含有供体DNA。

本发明的基因编辑系统可显著提高敲除率和重组率。

药物组合物和施用方法

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明的基因编辑系统或本发明第四方面所述的细胞；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明的基因编辑系统的剂量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

在一优选实施方式中，所述药物组合物中所述细胞的浓度为1×10

在本发明中，本发明的药物组合物可以细胞治疗剂的形式施用，例如本发明的基因编辑系统可用于改造细胞，然后将改造好的细胞通过静脉或瘤内注射的方式施用于有需要的受试者。在某些实施方式中，本发明的基因编辑系统可用于改造体内的或分离的细胞。在某些实施方式中，所述细胞可以为T细胞，所述改造可以包括基因编辑。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地为静脉用药制剂或瘤内用药注射剂。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明的基因编辑系统可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

在一个实施方式中，所述药物组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的药物组合物优选配制用于静脉内施用。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明的基因编辑系统的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的含有特定gRNA的基因编辑系统可显著提高敲除率和外源核酸的定点整合效率。

(2)通过筛选得到的外源序列高效整合的gRNA位点，本发明能提高外源序列在T细胞中定点整合效率

(3)通过筛选得到的CRISPR/Cas9高效切割的gRNA位点，本发明能提高T细胞基因敲除的效率

(4)使用本发明方法，使定点整合型T细胞产品的制备成为可能，也能更有效地制备基因敲除的T细胞产品

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照《微生物：实验手册》(James Cappuccino和NatalieSherman编，Pearson Education出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本专利涉及实验中使用的人供体细胞都获自上海赛笠生物科技有限公司。

如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。

通用方法

I.电转T细胞

电转T细胞是实现T细胞基因编辑的技术方法，步骤参照Lonza公司P3PrimaryCell

仪器与材料：

①Lonza 4D-Nucleofector

②试剂盒为P3 Primary Cell 4D-Nucleofector

③CD3/CD28磁珠刺激后2-4天的T细胞

④商品化spCas9蛋白(5ug/ul)(TrueCut

⑤合成的sgRNA(将合成的sgRNA溶解于TE缓冲液中，稀释成终浓度10ug/uL)

⑥含同源模板的线性化双链DNA

具体操作步骤：

适用于100μl规格的电转杯：

(1)按照82μl Solution+18μl supplement/每个电转杯，按电转总数，配置一个电转液混合液，混匀，放室温。

(2)将Cas9蛋白和sgRNA9进行共孵育，室温放置10min，形成RNP。

(3)RNP中加入线性化的同源模板双链DNA，室温孵育2min。

所述CD19-CART包括靶向CD19的胞外结构域，选自CD8α的跨膜区以及选自CD3ζ和CD137的胞内信号传导结构域；

(4)收集激活状态的T细胞，计数为5×106进行一个电转反应。

(5)将细胞与“RNP+同源模板”充分混合重悬，加入电转杯。

(6)打开电转仪，将电转杯放入槽孔，选择相应程序EO115进行电转。

(7)将细胞加入已预热的细胞培养基中，于细胞培养箱中培养。

II.外源序列重组率检测

1)取1×106细胞于无菌的1.5ml离心管中，离心后弃掉上清；

2)向细胞沉淀中加入流式缓冲液(含2％血清的PBS)清洗细胞；

3)置于室温离心机中，离心后尽量吸尽上清；

4)与检测抗体或蛋白进行共孵育，冰上孵育30分钟；

5)用流式缓冲液清洗细胞两次，离心后尽量吸尽上清；

6)用合适体积流式缓冲液重悬细胞，进行流式上机分析；

III.敲除率检测

(1)使用“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒”(TIANGEN，DP304)提取未处理和电转后T细胞基因组DNA

(2)通过PCR扩增切割位点区域DNA

(3)使用“普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒”(TIANGEN，DP209)纯化PCR产物

(4)将纯化的PCR产物进行一代测序

(5)通过ICE工具(Synthego)分析敲除率

在某些实施方式中，本发明的靶序列可以如下所示，即SEQ ID NO.:1：

GCTCACCTCCGCCTGAGCAGTGGAGAAGGCGGCACTCTGGTGGGGCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCTGCTCCCGGGCCGCACGAGGGACAATAGGAGCCAGGCGCACCGGCCAGCCCCTGAAGGAGGACCCCTCAGCCGTGCCTGTGTTCTCTGTGGACTATGGGGAGCTGGATTTCCAGTGGCGAGAGAAGACCCCGGAGCCCCCCGTGCCCTGTGTCCCTGAGCAGACGGAGTATGCCACCATTGTCTTTCCTAGCGGAATGGGCACCTCATCCCCCGCCCGCAGGGGCTCAGCTGACGGCCCTCGGAGTGCCCAGCCACTGAGGCCTGAGGATGGACACTGCTCTTGGCCCCTCTGACCGGCTTCCTTGGCCACCAGTGTTCTGCAGACCCTCCACCATGAGCCCGGGTCAGCGCATTTCCTCAGGAGAAGCAGGCAGGGTGCAGGCCATTGCAGGCCGTCCAGGGGCTGAGCTGCCTGGGGGCGACCGGGGCTCCAGCCTGCACCTGCACCAGGCACAGCCCCACCACAGGACTCATGTCTCAATGCCCACAGTGAGCCCAGGCAGCAGGTGTCACCGTCCCCTACAGGGAGGGCCAGATGCAGTCACTGCTTCAGGTCCTGCCAGCACAGAGCTGCCTGCGTCCAGCTCCCTGAATCTCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCCTGCGGCCCGGGGCTGAAGGCGCCGTGGCCCTGCCTGACGCCCCGGAGCCTCCTGCCTGAACTTGGGGGCTGGTTGGAGATGGCCTTGGAGCAGCCAAGGTGCCCCTGGCAGTGGCATCCCGAAACGCCCTGGACGCAGGGCCCAAGACTGGGCACAGGAGTGGGAGGTACATGGGGCTGGGGACTCCCCAGGAGTTATCTGCTCCCTGCAGGCCTAGAGAAGTTTCAGGGAAGGTCAGAAGAGCTCCTGGCTGTGGTGGGCAGGGCAGGAAACCCCTCCACCTTTACACATGCCCAGGCAGCACCTCAGGCCCTTTGTGGGGCAGGGAAGCTGAGGCAGTAAGCGGGCAGGCAGAGCTGGAGGCCTTTCAGGCCCAGCCAGCACTCTGGCCTCCTGCCGCCGCATTCCACCCCAGCCCCTCACACCACTCGGGAGAGGGACATCCTACGGTCCCAAGGTCAGGAGGGCAGGGCTGGGGTTGACTCAGGCCCCTCCCAGCTGTGGCCACCTGGGTGTTGGGAGGGCAGAAGTGCAGGCACCTAGGGCCCCCCATGTGCCCACCCTGGGAGCTCTCCTTGGAACCCATTCCTGAAATTATTTAAAGGGGTTGGCCGGGCTCCCACCAGGGCCTGGGTGGGAAGGTACAGGCGTTCCCCCGGGGCCTAGTACCCCCGCCGTGGCCTATCCACTCCTCACATCCACACACTGCACCCCCACTCCTGGGGCAGGGCCACCAGCATCCAGGCGGCCAGCAGGCACCTGAGTGGCTGGGACAAGGGATCCCCCTTCCCTGTGGTTCTATTATATTATAATTATAATTAAATATGAGAGCATGCTAA。

在其他实施方式中，本发明的靶序列可以如下所示，即SEQ ID NO.:2：

TCCAGGCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGA。

在另一些实施方式中，本发明的靶序列可以包含如SEQ ID NO.:3-15中任一项所示的序列：

DNA-sg1(即SEQ ID NO.:3)：ACAGGCGCCCTGGCCAGTCG。

DNA-sg2(即SEQ ID NO.:4)：CAGGCGCCCTGGCCAGTCGT。

DNA-sg3(即SEQ ID NO.:5)：GGGCGCCTGTGGGATCTGCA。

DNA-sg4(即SEQ ID NO.:6)：TGGCCAGTCGTCTGGGCGGT。

DNA-sg5(即SEQ ID NO.:7)：GGCCAGTCGTCTGGGCGGTG。

DNA-sg6(即SEQ ID NO.:8)：GTGGGATCTGCATGCCTGGA。

DNA-sg7(即SEQ ID NO.:9)：GGCATGCAGATCCCACAGGC。

DNA-sg8(即SEQ ID NO.:10)：GCCCAGTTGTAGCACCGCCC。

DNA-sg9(即SEQ ID NO.:11)：CCAGCCCAGTTGTAGCACCG。

DNA-sg10(即SEQ ID NO.:12)：GGCCGCCAGCCCAGTTGTAG。

DNA-sg11(即SEQ ID NO.:13)：TCCTGGCCGCCAGCCCAGTT。

DNA-sg12(即SEQ ID NO.:14)：AGTTGTAGCACCGCCCAGAC。

DNA-sg13(即SEQ ID NO.:15)：GTTGTAGCACCGCCCAGACG。

在某些实施方式中，本发明的gRNA的靶向序列可以包含如SEQ ID NO.:16-28中任一项所示的序列：

PD1-sg1(即SEQ ID NO.:16)：CGACTGGCCAGGGCGCCTGT。

PD1-sg2(即SEQ ID NO.:17)：ACGACTGGCCAGGGCGCCTG。

PD1-sg3(即SEQ ID NO.:18)：TGCAGATCCCACAGGCGCCC。

PD1-sg4(即SEQ ID NO.:19)：ACCGCCCAGACGACTGGCCA。

PD1-sg5(即SEQ ID NO.:20)：CACCGCCCAGACGACTGGCC。

PD1-sg6(即SEQ ID NO.:21)：TCCAGGCATGCAGATCCCAC。

PD1-sg7(即SEQ ID NO.:22)：GCCTGTGGGATCTGCATGCC。

PD1-sg8(即SEQ ID NO.:23)：GGGCGGTGCTACAACTGGGC。

PD1-sg9(即SEQ ID NO.:24)：CGGTGCTACAACTGGGCTGG。

PD1-sg10(即SEQ ID NO.:25)：CTACAACTGGGCTGGCGGCC。

PD1-sg11(即SEQ ID NO.:26)：AACTGGGCTGGCGGCCAGGA。

PD1-sg12(即SEQ ID NO.:27)：GTCTGGGCGGTGCTACAACT。

PD1-sg13(即SEQ ID NO.:28)：CGTCTGGGCGGTGCTACAAC。

实施例1sgRNA的筛选实验

首先选择了一组PD1位点，在刺激后的T细胞中导入spCas9(TrueCut

之后，又选择了另一组PD1位点，在刺激后的T细胞中导入spCas9(TrueCut

本实施例中提到的序列SEQ ID NO.:29-31中的任一项具体如下：

SEQ ID NO.:29，即PD1第一组位点(PD1-sg1到PD1-sg7)检测使用的含CAR序列的供体DNA序列，在该序列中，第1-800位的核苷酸为第一同源臂序列，第2954-3753位的核苷酸为第二同源臂序列：

CCCTGCCACCGCCCCAGCCCCCCCGTCAGGCTGTTGCAGGCATCACACGGTGGAAAGATCTGGAACTGTGGCCATGGTGTGAGGCCATCCACAAGGTGGAAGCTTTGAGGGGGAGCCGATTAGCCATGGACAGTTGTCATTCAGTAGGGTCACCTGTGCCCCAGCGAAGGGGGATGGGCCGGGAAGGCAGAGGCCAGGCACCTGCCCCCAGCAGGGGCAGAGGCTGTGGGCAGCCGGGAGGCTCCCAGAGGCTCCGACAGAATGGGAGTGGGGTTGAGCCCACCCCTCACTGCAGCCCAGGAACCTGAGCCCAGAGGGGGCCACCCACCTTCCCCAGGCAGGGAGGCCCGGCCCCCAGGGAGATGGGGGGGATGGGGGAGGAGAAGGGCCTGCCCCCACCCGGCAGCCTCAGGAGGGGCAGCTCGGGCGGGATATGGAAAGAGGCCACAGCAGTGAGCAGAGACACAGAGGAGGAAGGGGCCCTGAGCTGGGGAGACCCCCACGGGGTAGGGCGTGGGGGCCACGGGCCCACCTCCTCCCCATCTCCTCTGTCTCCCTGTCTCTGTCTCTCTCTCCCTCCCCCACCCTCTCCCCAGTCCTACCCCCTCCTCACCCCTCCTCCCCCAGCACTGCCTCTGTCACTCTCGCCCACGTGGATGTGGAGGAAGAGGGGGCGGGAGCAAGGGGCGGGCACCCTCCCTTCAACCTGACCTGGGACAGTTTCCCTTCCGCTCACCTCCGCCTGAGCAGTGGAGAAGGCGGCACTCTGGTGGGGCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGTCGAGGCCGCGGATCCTTCGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTGAAGGGCGTCGTAGGTGTCCTTGGTGGCTGTACTGAGACCCTGGTAAAGGCCATCGTGCCCCTTGCCCCTCCGGCGCTCGCCTTTCATCCCAATCTCACTGTAGGCCTCCGCCATCTTATCTTTCTGCAGTTCATTGTACAGGCCTTCCTGAGGGTTCTTCCTTCTCGGCTTTCCCCCCATCTCAGGGTCCCGGCCACGTCTCTTGTCCAAAACATCGTACTCCTCTCTTCGTCCTAGATTGAGCTCGTTATAGAGCTGGTTCTGGCCCTGCTTGTACGCGGGGGCGTCTGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAGCTACAGCCATCTTCCTCTTGAGTAGTTTGTACTGGTCTCATAAATGGTTGTTTGAATATATACAGGAGTTTCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTGACAGGAGAAGGACCCCACAAGTCCCGGCCAAGGGCGCCCAGATGTAGATATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCTCGTGTGCACTGCGCCCCCCGCCGCTGGCCGGCACGCCTCTGGGCGCAGGGACAGGGGCTGCGACGCGATGGTGGGCGCCGGTGTTGGTGGTCGCGGCGCTGGCGTCGTGGTTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCATAGCTACCACCGTAGTAATAATGTTTGGCACAGTAGTAAATGGCTGTGTCATCAGTTTGCAGACTGTTCATTTTTAAGAAAACTTGGCTCTTGGAGTTGTCCTTGATGATGGTCAGTCTGGATTTGAGAGCTGAATTATAGTATGTGGTTTCACTACCCCATATTACTCCCAGCCACTCCAGACCCTTTCGTGGAGGCTGGCGAATCCAGCTTACACCATAGTCGGGTAATGAGACCCCTGAGACAGTGCATGTGACGGACAGGCTCTGTGAGGGCGCCACCAGGCCAGGTCCTGACTCCTGCAGTTTCACCTCAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGTGATCTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTGTACGGAAGCGTATTACCCTGTTGGCAAAAGTAAGTGGCAATATCTTCTTGCTCCAGGTTGCTAATGGTGAGAGAATAATCTGTTCCAGACCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACTCCTGAGTGTAATCTTGATGTATGGTAGATCAGGAGTTTAACAGTTCCATCTGGTTTCTGCTGATACCAATTTAAATATTTACTAATGTCCTGACTTGCCCTGCAACTGATGGTGACTCTGTCTCCCAGAGAGGCAGACAGGGAGGATGTAGTCTGTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTGGAGCAGCAAGGCCAGCGGCAGGAGCAAGGCGGTCACTGGTAAGGCCATGGTGGCTCTAGAGTAGGCGCCGGTCACAGCTTGGATCTGTAACGGCGCAGAACAGAAAACGAAACAAAGACGTAGAGTTGAGCAAGCAGGGTCAGGCAAAGCGTGGAGAGCCGGCTGAGTCTAGGTAGGCTCCAAGGGAGCGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTTTAAACTTACCTAGACGGCGGACGCAGTTCAGGAGGCACCACAGGCGGGAGGCGGCAGAACGCGACTCAACCGGCGTGGATGGCGGCCTCAGGTAGGGCGGCGGGCGCGTGAAGGAGAGATGCGAGCCCCTCGAAGCTTCAGCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCCGTTCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGGTAGGTGGGGTCGGCGGTCAGGTGTCCCAGAGCCAGGGGTCTGGAGGGACCTTCCACCCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGAGGCGGGCCTGGCCCTGGCAGCCCAGGGGTCCCGGAGCGAGGGGTCTGGAGGGACCTTTCACTCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGTGGCAGGCCCAGCCTTGGCCCCCAGCTCTGCCCCTTACCCTGAGCTGTGTGGCTTTGGGCAGCTCGAACTCCTGGGTTCCTCTCTGGGCCCCAACTCCTCCCCTGGCCCAAGTCCCCTCTTTGCTCCTGGGCAGGCAGGACCTCTGTCCCCTCTCAGCCGGTCCTTGGGGCTGCGTGTTTCTGTAGAATGACGGGTCAGGCTGGCCAGAACCCCAAACCTTGGCCGTGGGGAGTCTGCGTGGCGGCTCTGCCTTGCCCAGGCATCCTTGGTCCTCACTCGAGTTTTCCTAAGGATGGGATGAGCCCCATGTGGGACTAACCTTGGCTTTACGACGTCAAAGTTTAGATGAGCTGGTGATATTTTTCTCATTATATCCAAAGTGTACCTGTTCGAGTGAGGACAGTTCTTCTGTCTCCAGGATCCCTCCTGGGTGGGGATTGTGCCCGCCTGGGTCTCTGCCCAGATTCCAGGGCTCTCCCCGAGCCCTGTTCAGACCATCCGTGGGGGAGGCCTTGGCCTCACTCTCCCGGATCGAGGAGAGAGGGAGCCTCTTCCTGG。

SEQ ID NO.:30，即PD1第二组位点(PD1-sg8到PD1-sg13)检测使用的含mTurquoise2序列的供体DNA序列，在该序列中，第1-800位的核苷酸为第一同源臂序列，第2213-3012位的核苷酸为第二同源臂序列：

AGGCATCACACGGTGGAAAGATCTGGAACTGTGGCCATGGTGTGAGGCCATCCACAAGGTGGAAGCTTTGAGGGGGAGCCGATTAGCCATGGACAGTTGTCATTCAGTAGGGTCACCTGTGCCCCAGCGAAGGGGGATGGGCCGGGAAGGCAGAGGCCAGGCACCTGCCCCCAGCAGGGGCAGAGGCTGTGGGCAGCCGGGAGGCTCCCAGAGGCTCCGACAGAATGGGAGTGGGGTTGAGCCCACCCCTCACTGCAGCCCAGGAACCTGAGCCCAGAGGGGGCCACCCACCTTCCCCAGGCAGGGAGGCCCGGCCCCCAGGGAGATGGGGGGGATGGGGGAGGAGAAGGGCCTGCCCCCACCCGGCAGCCTCAGGAGGGGCAGCTCGGGCGGGATATGGAAAGAGGCCACAGCAGTGAGCAGAGACACAGAGGAGGAAGGGGCCCTGAGCTGGGGAGACCCCCACGGGGTAGGGCGTGGGGGCCACGGGCCCACCTCCTCCCCATCTCCTCTGTCTCCCTGTCTCTGTCTCTCTCTCCCTCCCCCACCCTCTCCCCAGTCCTACCCCCTCCTCACCCCTCCTCCCCCAGCACTGCCTCTGTCACTCTCGCCCACGTGGATGTGGAGGAAGAGGGGGCGGGAGCAAGGGGCGGGCACCCTCCCTTCAACCTGACCTGGGACAGTTTCCCTTCCGCTCACCTCCGCCTGAGCAGTGGAGAAGGCGGCACTCTGGTGGGGCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGTCGAGGCCGCGGATCCTTCGAATTCTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGCTTGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCCGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTGGCCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCGGTGATATAGACGTTGTCGCTGAAGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGGCGAAGCACTGCACGCCCCAGCTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCTCTAGAGTAGGCGCCGGTCACAGCTTGGATCTGTAACGGCGCAGAACAGAAAACGAAACAAAGACGTAGAGTTGAGCAAGCAGGGTCAGGCAAAGCGTGGAGAGCCGGCTGAGTCTAGGTAGGCTCCAAGGGAGCGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTTTAAACTTACCTAGACGGCGGACGCAGTTCAGGAGGCACCACAGGCGGGAGGCGGCAGAACGCGACTCAACCGGCGTGGATGGCGGCCTCAGGTAGGGCGGCGGGCGCGTGAAGGAGAGATGCGAGCCCCTCGAAGCTTCAGCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCCGTTCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGGTAGGTGGGGTCGGCGGTCAGGTGTCCCAGAGCCAGGGGTCTGGAGGGACCTTCCACCCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGAGGCGGGCCTGGCCCTGGCAGCCCAGGGGTCCCGGAGCGAGGGGTCTGGAGGGACCTTTCACTCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGTGGCAGGCCCAGCCTTGGCCCCCAGCTCTGCCCCTTACCCTGAGCTGTGTGGCTTTGGGCAGCTCGAACTCCTGGGTTCCTCTCTGGGCCCCAACTCCTCCCCTGGCCCAAGTCCCCTCTTTGCTCCTGGGCAGGCAGGACCTCTGTCCCCTCTCAGCCGGTCCTTGGGGCTGCGTGTTTCTGTAGAATGACGGGTCAGGCTGGCCAGAACCCCAAACCTTGGCCGTGGGGAGTCTGCGTGGCGGCTCTGCCTTGCCCAGGCATCCTTGGTCCTCACTCGAGTTTTCCTAAGGATGGGATGAGCCCCATGTGGGACTAACCTTGGCTTTACGACGTCAAAGTTTAGATGAGCTGGTGATATTTTTCTCATTATATCCAAAGTGTACCTGTTCGAGTGAGGACAGTTCTTCTGTCTCCAGGATCCCTCCTGGGTGGGGATTGTGCCCGCCTGGGTCTCTGCCCAGATTCCAGGGCTCTCCCCGAGCCCTGTTCAGACCATCCGTGGGGGAGGCCTTGGCCTCACTCTCCCGGATCGAGGAGAGAGGGAGCCTCTTCCTGGGCTGCCCGTGACCCTGGGCCCTCTGTGTACACTGTGA。

SEQ ID NO.:31，即PD1第二组位点(PD1-sg8到PD1-sg13)检测使用的含CAR序列的供体DNA序列，在该序列中，第1-800位的核苷酸为第一同源臂序列，第2954-3753位的核苷酸为第二同源臂序列：

AGGCATCACACGGTGGAAAGATCTGGAACTGTGGCCATGGTGTGAGGCCATCCACAAGGTGGAAGCTTTGAGGGGGAGCCGATTAGCCATGGACAGTTGTCATTCAGTAGGGTCACCTGTGCCCCAGCGAAGGGGGATGGGCCGGGAAGGCAGAGGCCAGGCACCTGCCCCCAGCAGGGGCAGAGGCTGTGGGCAGCCGGGAGGCTCCCAGAGGCTCCGACAGAATGGGAGTGGGGTTGAGCCCACCCCTCACTGCAGCCCAGGAACCTGAGCCCAGAGGGGGCCACCCACCTTCCCCAGGCAGGGAGGCCCGGCCCCCAGGGAGATGGGGGGGATGGGGGAGGAGAAGGGCCTGCCCCCACCCGGCAGCCTCAGGAGGGGCAGCTCGGGCGGGATATGGAAAGAGGCCACAGCAGTGAGCAGAGACACAGAGGAGGAAGGGGCCCTGAGCTGGGGAGACCCCCACGGGGTAGGGCGTGGGGGCCACGGGCCCACCTCCTCCCCATCTCCTCTGTCTCCCTGTCTCTGTCTCTCTCTCCCTCCCCCACCCTCTCCCCAGTCCTACCCCCTCCTCACCCCTCCTCCCCCAGCACTGCCTCTGTCACTCTCGCCCACGTGGATGTGGAGGAAGAGGGGGCGGGAGCAAGGGGCGGGCACCCTCCCTTCAACCTGACCTGGGACAGTTTCCCTTCCGCTCACCTCCGCCTGAGCAGTGGAGAAGGCGGCACTCTGGTGGGGCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGTCGAGGCCGCGGATCCTTCGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTGAAGGGCGTCGTAGGTGTCCTTGGTGGCTGTACTGAGACCCTGGTAAAGGCCATCGTGCCCCTTGCCCCTCCGGCGCTCGCCTTTCATCCCAATCTCACTGTAGGCCTCCGCCATCTTATCTTTCTGCAGTTCATTGTACAGGCCTTCCTGAGGGTTCTTCCTTCTCGGCTTTCCCCCCATCTCAGGGTCCCGGCCACGTCTCTTGTCCAAAACATCGTACTCCTCTCTTCGTCCTAGATTGAGCTCGTTATAGAGCTGGTTCTGGCCCTGCTTGTACGCGGGGGCGTCTGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAGCTACAGCCATCTTCCTCTTGAGTAGTTTGTACTGGTCTCATAAATGGTTGTTTGAATATATACAGGAGTTTCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTGACAGGAGAAGGACCCCACAAGTCCCGGCCAAGGGCGCCCAGATGTAGATATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCTCGTGTGCACTGCGCCCCCCGCCGCTGGCCGGCACGCCTCTGGGCGCAGGGACAGGGGCTGCGACGCGATGGTGGGCGCCGGTGTTGGTGGTCGCGGCGCTGGCGTCGTGGTTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCATAGCTACCACCGTAGTAATAATGTTTGGCACAGTAGTAAATGGCTGTGTCATCAGTTTGCAGACTGTTCATTTTTAAGAAAACTTGGCTCTTGGAGTTGTCCTTGATGATGGTCAGTCTGGATTTGAGAGCTGAATTATAGTATGTGGTTTCACTACCCCATATTACTCCCAGCCACTCCAGACCCTTTCGTGGAGGCTGGCGAATCCAGCTTACACCATAGTCGGGTAATGAGACCCCTGAGACAGTGCATGTGACGGACAGGCTCTGTGAGGGCGCCACCAGGCCAGGTCCTGACTCCTGCAGTTTCACCTCAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGTGATCTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTGTACGGAAGCGTATTACCCTGTTGGCAAAAGTAAGTGGCAATATCTTCTTGCTCCAGGTTGCTAATGGTGAGAGAATAATCTGTTCCAGACCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACTCCTGAGTGTAATCTTGATGTATGGTAGATCAGGAGTTTAACAGTTCCATCTGGTTTCTGCTGATACCAATTTAAATATTTACTAATGTCCTGACTTGCCCTGCAACTGATGGTGACTCTGTCTCCCAGAGAGGCAGACAGGGAGGATGTAGTCTGTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTGGAGCAGCAAGGCCAGCGGCAGGAGCAAGGCGGTCACTGGTAAGGCCATGGTGGCTCTAGAGTAGGCGCCGGTCACAGCTTGGATCTGTAACGGCGCAGAACAGAAAACGAAACAAAGACGTAGAGTTGAGCAAGCAGGGTCAGGCAAAGCGTGGAGAGCCGGCTGAGTCTAGGTAGGCTCCAAGGGAGCGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTTTAAACTTACCTAGACGGCGGACGCAGTTCAGGAGGCACCACAGGCGGGAGGCGGCAGAACGCGACTCAACCGGCGTGGATGGCGGCCTCAGGTAGGGCGGCGGGCGCGTGAAGGAGAGATGCGAGCCCCTCGAAGCTTCAGCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCCGTTCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGGTAGGTGGGGTCGGCGGTCAGGTGTCCCAGAGCCAGGGGTCTGGAGGGACCTTCCACCCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGAGGCGGGCCTGGCCCTGGCAGCCCAGGGGTCCCGGAGCGAGGGGTCTGGAGGGACCTTTCACTCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGTGGCAGGCCCAGCCTTGGCCCCCAGCTCTGCCCCTTACCCTGAGCTGTGTGGCTTTGGGCAGCTCGAACTCCTGGGTTCCTCTCTGGGCCCCAACTCCTCCCCTGGCCCAAGTCCCCTCTTTGCTCCTGGGCAGGCAGGACCTCTGTCCCCTCTCAGCCGGTCCTTGGGGCTGCGTGTTTCTGTAGAATGACGGGTCAGGCTGGCCAGAACCCCAAACCTTGGCCGTGGGGAGTCTGCGTGGCGGCTCTGCCTTGCCCAGGCATCCTTGGTCCTCACTCGAGTTTTCCTAAGGATGGGATGAGCCCCATGTGGGACTAACCTTGGCTTTACGACGTCAAAGTTTAGATGAGCTGGTGATATTTTTCTCATTATATCCAAAGTGTACCTGTTCGAGTGAGGACAGTTCTTCTGTCTCCAGGATCCCTCCTGGGTGGGGATTGTGCCCGCCTGGGTCTCTGCCCAGATTCCAGGGCTCTCCCCGAGCCCTGTTCAGACCATCCGTGGGGGAGGCCTTGGCCTCACTCTCCCGGATCGAGGAGAGAGGGAGCCTCTTCCTGGGCTGCCCGTGACCCTGGGCCCTCTGTGTACACTGTGA。

实施例2使用本发明方法构建非病毒PD1定点整合型CD19-CART细胞，并对其功能进行检测

使用本发明PD1-sg1序列，使用不同健康供者的T细胞成功构建了PD1定点整合型CD19-CART细胞(其中用到的供体DNA序列如SEQ ID NO.:29所示)，并进行了测序验证(图6)，总阳性率大约在10％-30％(图7A、C)，敲除率大约在80％-95％(图7B)，PD1表达水平明显下降(图7D)，体现出了较好的制备稳定性。在此基础上，对PD1定点整合型CD19-CART的生物学功能进行了检测。实验结果显示，与PD-L1高表达肿瘤靶细胞(本实施例以慢病毒感染的PD-L1稳定过表达Raji肿瘤靶细胞为例)接触后，PD1定点整合型CD19-CART细胞具有比慢病毒制备的CAR-T细胞更强的扩增能力(图8)。与慢病毒制备的CD19-CART细胞相似，PD1定点整合型CD19-CART细胞能响应PD-L1高表达肿瘤靶细胞(本实施例以慢病毒感染的PD-L1稳定过表达Raji肿瘤靶细胞为例)的刺激而激活表面标志物CD69、CD137、CD25的表达(图9A-C)，其中CD137表达水平的上升更为明显。相一致地，PD1定点整合型CD19-CART细胞与PD-L1高表达肿瘤靶细胞(本实施例以慢病毒感染的PD-L1稳定过表达Raji肿瘤靶细胞为例)接触后能大量分泌细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ(图10A-C)，其中IFN-γ分泌水平的上升更为显著。最后，通过体内外实验证明了与慢病毒制备的CD19-CART细胞相比，使用本发明构建的PD1定点整合型CD19-CART细胞具有对PD-L1高表达肿瘤靶细胞(本实施例以慢病毒感染的PD-L1稳定过表达Raji肿瘤靶细胞为例)更强的肿瘤杀伤能力(图11、12)。

综上，使用本发明序列并利用CRISPR/Cas9基因编辑工具可成功构建PD1定点整合型CAR-T细胞。本发明证明了与现有技术相比，使用本发明序列制备的定点整合型CAR-T细胞具有较高的阳性率，并可以有效地发挥功能。该技术方法与传统慢病毒制备方法相比，可减少CAR-T制备过程中使用病毒带来的高昂成本，并减少病毒随机插入带来的安全隐患，也提高了CAR-T产品的均一性。另外，该方法还可实现CAR-T细胞的多样化改造，增强CAR-T细胞的抗肿瘤能力。该举例证明了本发明提供的提高T细胞中外源序列定点整合的方法，以及保护的T细胞中高效整合、切割gRNA位点和DNA靶序列的重要性和价值，但不限于PD1定点整合CAR-T细胞的制备，可拓展到其他T细胞免疫疗法的开发。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东师范大学

上海邦耀生物科技有限公司

<120> 用于基因编辑的组合物及其应用

<130> P2021-0002

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2097

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

gctcacctcc gcctgagcag tggagaaggc ggcactctgg tggggctgct ccaggcatgc 60

agatcccaca ggcgccctgg ccagtcgtct gggcggtgct acaactgggc tggcggccag 120

gatggttctt agactcccca gacaggccct ggaacccccc caccttctcc ccagccctgc 180

tcgtggtgac cgaaggggac aacgccacct tcacctgcag cttctccaac acatcggaga 240

gcttcgtgct aaactggtac cgcatgagcc ccagcaacca gacggacaag ctggccgcct 300

tccccgagga ccgcagccag cccggccagg actgccgctt ccgtgtcaca caactgccca 360

acgggcgtga cttccacatg agcgtggtca gggcccggcg caatgacagc ggcacctacc 420

tctgtggggc catctccctg gcccccaagg cgcagatcaa agagagcctg cgggcagagc 480

tcagggtgac agagagaagg gcagaagtgc ccacagccca ccccagcccc tcacccaggc 540

cagccggcca gttccaaacc ctggtggttg gtgtcgtggg cggcctgctg ggcagcctgg 600

tgctgctagt ctgggtcctg gccgtcatct gctcccgggc cgcacgaggg acaataggag 660

ccaggcgcac cggccagccc ctgaaggagg acccctcagc cgtgcctgtg ttctctgtgg 720

actatgggga gctggatttc cagtggcgag agaagacccc ggagcccccc gtgccctgtg 780

tccctgagca gacggagtat gccaccattg tctttcctag cggaatgggc acctcatccc 840

ccgcccgcag gggctcagct gacggccctc ggagtgccca gccactgagg cctgaggatg 900

gacactgctc ttggcccctc tgaccggctt ccttggccac cagtgttctg cagaccctcc 960

accatgagcc cgggtcagcg catttcctca ggagaagcag gcagggtgca ggccattgca 1020

ggccgtccag gggctgagct gcctgggggc gaccggggct ccagcctgca cctgcaccag 1080

gcacagcccc accacaggac tcatgtctca atgcccacag tgagcccagg cagcaggtgt 1140

caccgtcccc tacagggagg gccagatgca gtcactgctt caggtcctgc cagcacagag 1200

ctgcctgcgt ccagctccct gaatctctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgcctg 1260

cggcccgggg ctgaaggcgc cgtggccctg cctgacgccc cggagcctcc tgcctgaact 1320

tgggggctgg ttggagatgg ccttggagca gccaaggtgc ccctggcagt ggcatcccga 1380

aacgccctgg acgcagggcc caagactggg cacaggagtg ggaggtacat ggggctgggg 1440

actccccagg agttatctgc tccctgcagg cctagagaag tttcagggaa ggtcagaaga 1500

gctcctggct gtggtgggca gggcaggaaa cccctccacc tttacacatg cccaggcagc 1560

acctcaggcc ctttgtgggg cagggaagct gaggcagtaa gcgggcaggc agagctggag 1620

gcctttcagg cccagccagc actctggcct cctgccgccg cattccaccc cagcccctca 1680

caccactcgg gagagggaca tcctacggtc ccaaggtcag gagggcaggg ctggggttga 1740

ctcaggcccc tcccagctgt ggccacctgg gtgttgggag ggcagaagtg caggcaccta 1800

gggcccccca tgtgcccacc ctgggagctc tccttggaac ccattcctga aattatttaa 1860

aggggttggc cgggctccca ccagggcctg ggtgggaagg tacaggcgtt cccccggggc 1920

ctagtacccc cgccgtggcc tatccactcc tcacatccac acactgcacc cccactcctg 1980

gggcagggcc accagcatcc aggcggccag caggcacctg agtggctggg acaagggatc 2040

ccccttccct gtggttctat tatattataa ttataattaa atatgagagc atgctaa 2097

<210> 2

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

tccaggcatg cagatcccac aggcgccctg gccagtcgtc tgggcggtgc tacaactggg 60

ctggcggcca gga 73

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

acaggcgccc tggccagtcg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

caggcgccct ggccagtcgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

gggcgcctgt gggatctgca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

tggccagtcg tctgggcggt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

ggccagtcgt ctgggcggtg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

gtgggatctg catgcctgga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

ggcatgcaga tcccacaggc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

gcccagttgt agcaccgccc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

ccagcccagt tgtagcaccg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

ggccgccagc ccagttgtag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

tcctggccgc cagcccagtt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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agttgtagca ccgcccagac 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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gttgtagcac cgcccagacg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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cgactggcca gggcgcctgt 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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acgactggcc agggcgcctg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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tgcagatccc acaggcgccc 20

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<212> DNA

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<400> 19

accgcccaga cgactggcca 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

caccgcccag acgactggcc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

gcctgtggga tctgcatgcc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

gggcggtgct acaactgggc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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cggtgctaca actgggctgg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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ctacaactgg gctggcggcc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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aactgggctg gcggccagga 20

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<212> DNA

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<400> 27

gtctgggcgg tgctacaact 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

cgtctgggcg gtgctacaac 20

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<211> 3753

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

ccctgccacc gccccagccc ccccgtcagg ctgttgcagg catcacacgg tggaaagatc 60

tggaactgtg gccatggtgt gaggccatcc acaaggtgga agctttgagg gggagccgat 120

tagccatgga cagttgtcat tcagtagggt cacctgtgcc ccagcgaagg gggatgggcc 180

gggaaggcag aggccaggca cctgccccca gcaggggcag aggctgtggg cagccgggag 240

gctcccagag gctccgacag aatgggagtg gggttgagcc cacccctcac tgcagcccag 300

gaacctgagc ccagaggggg ccacccacct tccccaggca gggaggcccg gcccccaggg 360

agatgggggg gatgggggag gagaagggcc tgcccccacc cggcagcctc aggaggggca 420

gctcgggcgg gatatggaaa gaggccacag cagtgagcag agacacagag gaggaagggg 480

ccctgagctg gggagacccc cacggggtag ggcgtggggg ccacgggccc acctcctccc 540

catctcctct gtctccctgt ctctgtctct ctctccctcc cccaccctct ccccagtcct 600

accccctcct cacccctcct cccccagcac tgcctctgtc actctcgccc acgtggatgt 660

ggaggaagag ggggcgggag caaggggcgg gcaccctccc ttcaacctga cctgggacag 720

tttcccttcc gctcacctcc gcctgagcag tggagaaggc ggcactctgg tggggctgct 780

ccaggcatgc agatcccaca taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 840

gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 900

tataagctgc aataaacaag ttgtcgaggc cgcggatcct tcgaattctt agcgaggggg 960

cagggcctgc atgtgaaggg cgtcgtaggt gtccttggtg gctgtactga gaccctggta 1020

aaggccatcg tgccccttgc ccctccggcg ctcgcctttc atcccaatct cactgtaggc 1080

ctccgccatc ttatctttct gcagttcatt gtacaggcct tcctgagggt tcttccttct 1140

cggctttccc cccatctcag ggtcccggcc acgtctcttg tccaaaacat cgtactcctc 1200

tcttcgtcct agattgagct cgttatagag ctggttctgg ccctgcttgt acgcgggggc 1260

gtctgcgctc ctgctgaact tcactctcag ttcacatcct ccttcttctt cttctggaaa 1320

tcggcagcta cagccatctt cctcttgagt agtttgtact ggtctcataa atggttgttt 1380

gaatatatac aggagtttct ttctgccccg tttgcagtaa agggtgataa ccagtgacag 1440

gagaaggacc ccacaagtcc cggccaaggg cgcccagatg tagatatcac aggcgaagtc 1500

cagccccctc gtgtgcactg cgccccccgc cgctggccgg cacgcctctg ggcgcaggga 1560

caggggctgc gacgcgatgg tgggcgccgg tgttggtggt cgcggcgctg gcgtcgtggt 1620

tgaggagacg gtgactgagg ttccttggcc ccagtagtcc atagcatagc taccaccgta 1680

gtaataatgt ttggcacagt agtaaatggc tgtgtcatca gtttgcagac tgttcatttt 1740

taagaaaact tggctcttgg agttgtcctt gatgatggtc agtctggatt tgagagctga 1800

attatagtat gtggtttcac taccccatat tactcccagc cactccagac cctttcgtgg 1860

aggctggcga atccagctta caccatagtc gggtaatgag acccctgaga cagtgcatgt 1920

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cccaagtccc ctctttgctc ctgggcaggc aggacctctg tcccctctca gccggtcctt 3360

ggggctgcgt gtttctgtag aatgacgggt caggctggcc agaaccccaa accttggccg 3420

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<210> 30

<211> 3012

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

aggcatcaca cggtggaaag atctggaact gtggccatgg tgtgaggcca tccacaaggt 60

ggaagctttg agggggagcc gattagccat ggacagttgt cattcagtag ggtcacctgt 120

gccccagcga agggggatgg gccgggaagg cagaggccag gcacctgccc ccagcagggg 180

cagaggctgt gggcagccgg gaggctccca gaggctccga cagaatggga gtggggttga 240

gcccacccct cactgcagcc caggaacctg agcccagagg gggccaccca ccttccccag 300

gcagggaggc ccggccccca gggagatggg ggggatgggg gaggagaagg gcctgccccc 360

acccggcagc ctcaggaggg gcagctcggg cgggatatgg aaagaggcca cagcagtgag 420

cagagacaca gaggaggaag gggccctgag ctggggagac ccccacgggg tagggcgtgg 480

gggccacggg cccacctcct ccccatctcc tctgtctccc tgtctctgtc tctctctccc 540

tcccccaccc tctccccagt cctaccccct cctcacccct cctcccccag cactgcctct 600

gtcactctcg cccacgtgga tgtggaggaa gagggggcgg gagcaagggg cgggcaccct 660

cccttcaacc tgacctggga cagtttccct tccgctcacc tccgcctgag cagtggagaa 720

ggcggcactc tggtggggct gctccaggca tgcagatccc acaggcgccc tggccagtcg 780

tctgggcggt gctacaactg taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 840

gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 900

tataagctgc aataaacaag ttgtcgaggc cgcggatcct tcgaattctc acttgtacag 960

ctcgtccatg ccgagagtga tcccggcggc ggtcacgaac tccagcagga ccatgtgatc 1020

gcgcttctcg ttggggtctt tgctcagctt ggactgggtg ctcaggtagt ggttgtcggg 1080

cagcagcacg gggccgtcgc cgatgggggt gttctgctgg tagtggtcgg cgagctgcac 1140

gccgccgtcc tcgatgttgt ggcggatctt gaagttggcc ttgatgccgt tcttctgctt 1200

gtcggcggtg atatagacgt tgtcgctgaa gtagttgtac tccagcttgt gccccaggat 1260

gttgccgtcc tccttgaagt cgatgccctt cagctcgatg cggttcacca gggtgtcgcc 1320

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gccctcgccc tcgccggaca cgctgaactt gtggccgttt acgtcgccgt ccagctcgac 1620

caggatgggc accaccccgg tgaacagctc ctcgcccttg ctcaccatgg tggctctaga 1680

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tggcggcctc aggtagggcg gcgggcgcgt gaaggagaga tgcgagcccc tcgaagcttc 1980

agctgtgttc tggcggcaaa cccgttgcga aaaagaacgt tcacggcgac tactgcactt 2040

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cagtttaccc cgcgccacct tctctaggca cccgttcaat tgccgacccc tccccccaac 2160

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tgtacactgt ga 3012

<210> 31

<211> 3753

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31