一种同时检测化妆品中多种大麻素类物质的薄层色谱检测方法

技术领域

本发明属于化妆品检测领域，尤其涉及一种同时检测化妆品中多种大麻素类物质的薄层色谱检测方法。

背景技术

大麻(Cannabis sativa L.)亦称火麻或线麻，是桑科大麻属植物，一年生直立草本。大麻中含有一种毒性成分四氢大麻酚(THC)可使人致幻成瘾，可作毒品，曾在相当长时期内禁种。由于大麻的经济、药用价值极高，专供工业用途的原料大麻简称为“工业大麻”，其生长期大麻花叶中的THC含量小于千分之三，不具备提取毒性成分四氢大麻酚的价值或直接作为毒品吸食，可以合法进行规模化种植与工业化开发利用。

工业大麻概念化妆品指的是添加了工业大麻植物来源原料的化妆品。2019年4月5日欧盟最新法规COMMISSION DECISION(EU)2019/701罗列出化妆品标签上可以使用的原材料名字包含有大麻叶提取物。随着国外大麻化妆品的发展，大麻叶提取物中的主要成分为大麻二酚(CBD)成为国外化妆品追捧的对象。CBD是大麻叶提取物全谱油中含量最丰富的大麻素。国际上CBD在护肤领域的应用中，被认为是一种极佳的修复皮肤、抗氧化的成分。

由于严格遵守联合国《1961年麻醉品单一公约》，中国工业大麻概念化妆品起步较晚。国家食品药品监督管理局在2015年12月23日发布了《已使用化妆品原料名称目录(2015版)》，把大麻叶提取物、大麻仁果、大麻籽油3个工业大麻来源的原料列为已使用化妆品原料目录成分。化妆品行业成为国内工业大麻叶应用唯一合法的应用领域。

受国际舆论和产业趋势影响，近期大麻来源原料在化妆品行业的热度也有所增加，尤其是随着2019年初国内工业大麻概念股的火爆和工业大麻化妆品概念科普，越来越多的工业大麻化妆品涌现出来。大麻来源原料在我国化妆品中的使用呈上升趋势，其原料特点和安全风险值得研究。国内大麻概念化妆品主推大麻叶提取物成分，并且大部分品牌以大麻叶面膜、大麻叶精华液、大麻叶喷雾等产品为切入点。

由于大麻二酚尚未列入为已使用化妆品原料目录，宣传CBD概念存在化妆品法规风险。国内大麻化妆品以大麻叶提取物为核心成分，事实上，大麻叶含有大量的大麻素类成分，除了富含CBD外，大麻叶提取物还含有如次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚等大麻素。此外还有大麻黄酮和其他萜烯类成分。

虽然大麻素类化妆品可能在皮肤炎症、瘙痒等方面有一定的应用价值，然而，目前的有效性和安全性数据几乎完全局限于对啮齿动物的初步研究。其作为外用大麻素产品的配方尚不规范，监管也不力，尤其是一些广告经常做出未经证实的宣称，使市场上大麻类化妆品鱼龙混杂，质量参差不齐。这一问题凸显了进一步研究和监管的必要性。美国食品药品监督管理局(FDA)近期测试了在美国市面上售卖的47款CBD(大麻二酚)产品，以判断这些CBD产品的实际含量是否和标注含量一致，有没有存在欺诈消费者的行为。结果显示，只有51％的CBD产品符合要求，更为严峻的是，竟然有11％的产品因为含量为零而不合格。

目前报道的大麻素检测方法主要针对药物、血液或毛发等基于法医或公安物证鉴定领域以及植物食用油、火麻仁及火麻仁油、大麻植物中。虽然大麻叶提取物、大麻仁果以及大麻籽油可以作为化妆品原料使用，但我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)尚未包括其检测分析方法，也未出台相关国家对照品。因此，为进一步开展含有大麻叶提取物化妆品的质量控制和安全评估，建立一种快速准确鉴别大麻概念化妆品中大麻叶提取物的特征大麻素成分的方法迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种同时检测化妆品中多种大麻素类物质的薄层色谱检测方法，以快速检测化妆品中大麻叶提取物的种类，并判定快速检测化妆品中大麻叶提取物的含量是否安全合格。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种同时检测化妆品中多种大麻素类物质的薄层色谱检测方法，包括以下步骤：

S1：取不同的对照品，分别用甲醇或无水乙醇溶解，配制不同的对照品溶液；

S2：取不同的待测化妆品样品，分别加入提取溶剂，混匀，超声提取，得混合溶液，净化过滤，得不同的待测化妆品样品溶液；

S3：点样：取S1制得的不同的对照品溶液和S2制得的不同的待测化妆品样品溶液各5～15μL，依次点样于同一硅胶薄层板的同一水平线的不同位置；

S4：展开：使用石油醚-乙醚或环己烷-丙酮展开，其中，石油醚与乙醚或者环己烷与丙酮的体积比为4:1～6:1。

S5：显色：对晾干的硅胶薄层板，喷以固蓝B盐显色试液；

S6：检视：对硅胶薄层板的斑点进行检视。

优选地，所述大麻素类物质包括大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚及四氢大麻酚的一种或几种。

优选地，所述大麻素类物质同时包括：大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚和四氢大麻酚。

优选地，所述展开的展距为8～9cm。

优选地，所述化妆品样品提取溶剂为甲醇或无水乙醇，所述提取溶剂为甲醇或无水乙醇，每种所述待测化妆品样品的质量与所述提取溶剂的体积之比为1:3～1:10。

优选地，步骤S2中，所述待测化妆品样品溶液的浓度以待测化妆品样品计为2～10g/mL。

优选地，步骤S2中，所述超声提取的超声功率为为30～50KHz。

优选地，步骤S2中，所述超声提取的提取时间为5～15分钟。

优选地，步骤S4中，所述展开在双槽薄层色谱层析缸中并按照以下步骤进行：

1)准确量取适量的石油醚和乙醚溶液，按照体积比4:1～5:1混合均匀，得到展开剂；将展开剂置于干燥洁净的双槽薄层色谱层析缸的第一个槽中；

2)将S3中点样后的薄层板置于上述步骤(1)的双槽薄层色谱层析缸的第二个槽中，密闭缸盖，预饱和5～30min后，将上述双槽薄层色谱层析缸第一个槽的展开剂转移至放置有薄层色谱板的第二个槽中进行展开，展开剂液面不应高于点样的水平线，层析距离为8～9cm，待结束层析，取出薄层硅胶板，晾干，优选地，预饱和20～30min。

优选地，步骤S5中，固蓝B盐显色试液浓度为：0.5％～1％固蓝B盐的0.1N氢氧化钠溶液。

优选地，所述过滤包括以下步骤：室温条件下，采用LUMTECH MPFC-QuEChERS高脂类超滤型净化柱对待提取混合溶液进行净化，并经0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液，再加甲醇10ml冲洗净化柱，合并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为待测化妆品样品溶液。

本发明所用的硅胶G薄层板可以是自制薄层硅胶板，也可以是从市售途径得到的。薄层层析用的硅胶板放在105度环境中烘30min即可完成活化。刚打开的塑料封装的可以不活化，打开放置一段时间后再用则需要活化。

本发明的有益效果为：

使用本发明的方法能够完全分离出化妆品中的大麻叶提取物，尤其是大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚和四氢大麻酚，通过本发明方法配制的展开剂展开后，在固蓝B盐显色作用下，得到的斑点清晰，以使本发明方法能够快速地同时检测多种化妆品中含有的大麻叶提取物的种类及是否合格。因此，本发明方法专属性强，操作方便。薄层色谱中大麻叶的主要特征成分斑点清晰，分离完全，可用于同时快速准确鉴别化妆品中大麻叶提取物所含的大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚和四氢大麻酚，精准判定大麻类化妆品中是否含有大麻叶提取物，促进了相关产品质量对照品规范和完善。

附图说明

图1为实施例1的薄层色谱图。

图2为实施例2的薄层色谱图。

图3为对比例1的薄层色谱图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

一种同时检测化妆品中多种大麻素类物质的薄层色谱检测方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：依次精密称取大麻二酚对照品10.2mg、次大麻二酚对照品10.4mg、大麻萜酚对照品10.1mg，次四氢大麻酚对照品10.3mg和四氢大麻酚对照品10.4mg，分别置于5个10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得不同对照品的甲醇原液。分别精密量取1ml不同的对照品的甲醇原液，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成大麻二酚浓度为0.102mg/mL、次大麻二酚浓度为0.104mg/mL、大麻萜酚浓度为0.101mg/mL、次四氢大麻酚浓度为0.103mg/mL和四氢大麻酚浓度为0.104mg/mL的对照品溶液。

(2)待测化妆品样品溶液的制备：准确称取某品牌大麻类待测化妆品样品：大麻叶修护精华液3g、大麻叶洁面乳3g、大麻叶舒缓水3g、大麻叶洗手液3g，分别置于25ml具塞离心管中，加入甲醇10ml，在涡旋混匀器上高速振荡30s，使待测化妆品样品与提取溶剂充分混匀，得四组不同的待提取样品溶液。密塞离心管，对四组不同的待提取样品溶液超声提取(功率250W，频率40kHz)10分钟，静置至室温，采用LUMTECH MPFC-QuEChERS(高脂类)超滤型净化柱对超声提取后的四组不同的样品溶液分别进行如下净化过滤处理：净化，并经微孔滤膜(0.22μm)过滤，收集滤液，再加甲醇10ml冲洗净化柱，合并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为待测化妆品样品溶液；

(3)点样：使用定量毛细管分别吸取各对照品溶液和四组待测化妆品样品溶液10μL，依次点样于同一硅胶G薄层板的同一水平线的不同位置；

(4)展开：双槽薄层色谱层析缸。以石油醚-乙醚(体积比5:1)的混合液为展开剂，置于干燥洁净的双槽薄层色谱层析缸的第一个槽中；将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱层析缸的第二个槽中，密闭缸盖，预饱和20min后，展开，展距为8cm，待层析结束后，将硅胶薄层板取出，晾干；

(5)显色：喷以0.5％固蓝B盐的0.1N氢氧化钠溶液进行显色；

(6)检视：对硅胶薄层板的斑点进行检视，鉴别化妆品中大麻叶提取物所含的大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚和四氢大麻酚；

(7)结果判定：样品溶液所得色谱图中大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚4个主斑点的颜色和迁移率与对照品溶液所得色谱图中主斑点的颜色和迁移率一致，同时样品色谱中在与四氢大麻酚对照品相对应位置未显示斑点，则判定该产品含大麻叶提取物主要特征成分，合格；反之，判定为不合格。

实施例2

一种同时检测化妆品中多种大麻素类物质的薄层色谱检测方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：依次精密称取大麻二酚对照品10.2mg、次大麻二酚对照品10.4mg、大麻萜酚对照品10.1mg，次四氢大麻酚对照品10.3mg和四氢大麻酚对照品10.4mg，分别置于5个10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得不同对照品的甲醇原液。分别精密量取1ml不同的对照品的甲醇原液，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成大麻二酚浓度为0.102mg/mL、次大麻二酚浓度为0.104mg/mL、大麻萜酚浓度为0.101mg/mL、次四氢大麻酚浓度为0.103mg/mL和四氢大麻酚浓度为0.104mg/mL的对照品溶液。

(2)待测化妆品样品溶液的制备：准确称取某品牌大麻类待测化妆品样品：大麻叶修护精华液5g、大麻叶洁面乳5g、大麻叶舒缓水5g、大麻叶洗手液5g，分别置于100ml具塞离心管中，加入无水乙醇50ml，在涡旋混匀器上高速振荡30s，使待测化妆品样品与提取溶剂充分混匀，得四组不同的待提取样品溶液。密塞离心管，对四组不同的待提取样品溶液超声提取(功率250W，频率50kHz)15分钟，静置至室温，采用LUMTECH MPFC-QuEChERS(高脂类)超滤型净化柱对超声提取后的四组不同的样品溶液分别进行如下净化过滤处理：，并经微孔滤膜(0.22μm)过滤，收集滤液，再加甲醇10ml冲洗净化柱，合并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为待测化妆品样品溶液；

(3)点样：使用定量毛细管分别吸取各对照品溶液和四组待测化妆品样品溶液5μL，依次点样于同一硅胶G薄层板的同一水平线的不同位置；

(4)展开：双槽薄层色谱层析缸。以石油醚-乙醚(体积比8:2)混合液为展开剂，置于干燥洁净的双槽薄层色谱层析缸的第一个槽中；将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱层析缸的第二个槽中，密闭缸盖，预饱和30min后，展开，展距为9cm，待层析结束后，将硅胶薄层板取出，晾干；

(5)显色：喷以1％固蓝B盐的0.1N氢氧化钠溶液进行显色；

(6)检视：对硅胶薄层板的斑点进行检视，鉴别化妆品中大麻叶提取物所含的大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚和四氢大麻酚；

(7)结果判定：样品溶液所得色谱图中大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚4个主斑点的颜色和迁移率与对照品溶液所得色谱图中主斑点的颜色和迁移率一致，同时样品色谱中在与四氢大麻酚对照品相对应位置未显示斑点，则判定该产品含大麻叶提取物主要特征成分，合格；反之，判定为不合格。

实施例3

一种同时检测化妆品中多种大麻素类物质的薄层色谱检测方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：依次精密称取大麻二酚对照品10.2mg、次大麻二酚对照品10.4mg、大麻萜酚对照品10.1mg，次四氢大麻酚对照品10.3mg和四氢大麻酚对照品10.4mg，分别置于5个10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得不同对照品的甲醇原液。分别精密量取1ml不同的对照品的甲醇原液，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成大麻二酚浓度为0.102mg/mL、次大麻二酚浓度为0.104mg/mL、大麻萜酚浓度为0.101mg/mL、次四氢大麻酚浓度为0.103mg/mL和四氢大麻酚浓度为0.104mg/mL的对照品溶液。

(2)待测化妆品样品溶液的制备：准确称取某品牌大麻类待测化妆品样品：大麻叶修护精华液1g、大麻叶洁面乳1g、大麻叶舒缓水1g、大麻叶洗手液1g，分别置于10ml具塞离心管中，加入无水乙醇5ml，在涡旋混匀器上高速振荡30s，使待测化妆品样品与提取溶剂充分混匀，得四组不同的待提取样品溶液。密塞离心管，对四组不同的待提取样品溶液超声提取(功率250W，频率30kHz)5分钟，静置至室温，采用LUMTECH MPFC-QuEChERS(高脂类)超滤型净化柱对超声提取后的四组不同的样品溶液分别进行如下净化过滤处理：并经微孔滤膜(0.22μm)过滤，收集滤液，再加甲醇10ml冲洗净化柱，合并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为待测化妆品样品溶液；

(3)点样：使用定量毛细管分别吸取各对照品溶液和待测化妆品样品溶液5μL，依次点样于同一硅胶G薄层板的同一水平线的不同位置；

(4)展开：双槽薄层色谱层析缸。以石油醚-乙醚(体积比4.0:0.8)混合液为展开剂，置于干燥洁净的双槽薄层色谱层析缸的第一个槽中；将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱层析缸的第二个槽中，密闭缸盖，预饱和25min后，展开，展距为9cm，待层析结束后，将硅胶薄层板取出，晾干；

(5)显色：喷以0.5％固蓝B盐的0.1N氢氧化钠溶液进行显色；

(6)检视：对硅胶薄层板的斑点进行检视，鉴别化妆品中大麻叶提取物所含的大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚和四氢大麻酚；

(7)结果判定：样品溶液所得色谱图中大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚4个主斑点的颜色和迁移率与对照品溶液所得色谱图中主斑点的颜色和迁移率一致，同时样品色谱中在与四氢大麻酚对照品相对应位置未显示斑点，则判定该产品含大麻叶提取物主要特征成分，合格；反之，判定为不合格。

对比例1

(1)对照品溶液的制备：依次精密称取大麻二酚对照品10.2mg、次大麻二酚对照品10.4mg、大麻萜酚对照品10.1mg，次四氢大麻酚对照品10.3mg和四氢大麻酚对照品10.4mg，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得不同对照品的甲醇原液。精密量取1ml不同的对照品的甲醇原液，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成大麻二酚浓度为0.102mg/mL、次大麻二酚浓度为0.104mg/mL、大麻萜酚浓度为0.101mg/mL、次四氢大麻酚浓度为0.103mg/mL和四氢大麻酚浓度为0.104mg/mL的混合对照品溶液。

(2)待测化妆品样品溶液的制备：准确称取某品牌大麻类待测化妆品样品：大麻叶修护精华液3g、大麻叶洁面乳3g、大麻叶舒缓水3g，分别置于25ml具塞离心管中，加入甲醇10ml，在涡旋混匀器上高速振荡30s，使待测化妆品样品与提取溶剂充分混匀，得三组不同的待提取样品溶液。密塞离心管，对三组不同的待提取样品溶液超声提取(功率250W，频率40kHz)10分钟，静置至室温，采用LUMTECH MPFC-QuEChERS(高脂类)超滤型净化柱对超声提取后的四组不同的样品溶液分别进行如下净化过滤处理：净化，并经微孔滤膜(0.22μm)过滤，收集滤液，再加甲醇10ml冲洗净化柱，合并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为待测化妆品样品溶液；

(3)点样：使用定量毛细管分别吸取对照品溶液和三组待测化妆品样品溶液各10μL，依次点样于同一硅胶G薄层板的同一水平线的不同位置；

(4)展开：双槽薄层色谱层析缸。以环己烷-乙酸乙酯(体积比5:1)的混合液为展开剂，置于干燥洁净的双槽薄层色谱层析缸的第一个槽中；将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱层析缸的第二个槽中，密闭缸盖，预饱和20min后，展开，展距为8cm，待层析结束后，将硅胶薄层板取出，晾干；

(5)显色：喷以0.5％固蓝B盐的0.1N氢氧化钠溶液进行显色；

(6)检视：对硅胶薄层板的斑点进行检视，鉴别化妆品中大麻叶提取物所含的大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚和四氢大麻酚；

(7)结果判定：样品溶液所得色谱图中大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚4个主斑点的颜色和迁移率与对照品溶液所得色谱图中主斑点的颜色和迁移率一致，同时样品色谱中在与四氢大麻酚对照品相对应位置未显示斑点，则判定该产品含大麻叶提取物主要特征成分，合格；反之，判定为不合格。

实验结果及结论：

图1为实施例1的薄层色谱图。图中，Sam1,Sam2,Sam3,Sam4分别为某品牌大麻类化妆品大麻叶修护精华液、大麻叶洁面乳、大麻叶舒缓水、大麻叶洗手液的样品，CBDV为次大麻二酚对照品，CBD为大麻二酚对照品、THCV为次四氢大麻酚对照品，CBG为大麻萜酚对照品，THC为四氢大麻酚对照品。结果显示，待测化妆品样品和对照品色谱中各主要斑点均得到了良好的分离，且显色清晰。

图2为实施例2的薄层色谱图。图中，Sam1,Sam2,Sam3,Sam4分别为某品牌大麻类化妆品大麻叶修护精华液、大麻叶洁面乳、大麻叶舒缓水、大麻叶洗手液的样品，CBD为大麻二酚对照品、CBDV为次大麻二酚对照品，THCV为次四氢大麻酚对照品，CBG为大麻萜酚对照品，THC为四氢大麻酚对照品。结果显示，待测化妆品样品和对照品色谱中各主要斑点均得到了良好的分离，且显色清晰。

图3为对比例1的薄层色谱图。图中，Sam1,Sam2,Sam3分别为某品牌大麻类化妆品大麻叶修护精华液、大麻叶洁面乳、大麻叶舒缓水的样品，CBD为大麻二酚对照品、CBDV为次大麻二酚对照品，THCV为次四氢大麻酚对照品，CBG为大麻萜酚对照品，THC为四氢大麻酚对照品。结果显示，待测化妆品样品和对照品色谱中各斑点分离效果较差，其中CBD和CBDV没有完全分离，CBG和THCV没有完全分离。

本发明提供了用于大麻概念化妆品中大麻叶提取物的薄层色谱快速鉴别方法，通过对大麻叶提取物化妆品的鉴别试验表明，大麻叶提取物中的5种特征成分分离完全，斑点清晰。本发明选用体积比为4:1～5:1的石油醚和乙醚作为展开剂，各成分分离良好，显色清晰。本发明方法专属性强，操作方便。可同时快速准确鉴别化妆品中大麻叶提取物所含的大麻二酚、次大麻二酚、大麻萜酚、次四氢大麻酚和四氢大麻酚等大麻素特征成分，精准判定大麻类化妆品中是否含有大麻叶提取物，促进了相关产品质量对照品规范和完善，为国家市场监督管理部门和禁毒局提供了有力的技术保障，值得推广运用。

本说明书中各个实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。