一种护肝保肾肉苁蓉酵素及其制备方法

技术领域

本发明属于食品加工酵素技术领域，具体涉及一种保肝护肾肉苁蓉酵素及其制备方法。

背景技术

植物酵素通常以一种或多种新鲜的水果、蔬菜、谷类、菌菇类或其他药食两用草本类为发酵原料，通过微生物发酵后而得到的，富含多种营养生物活性物质，如酶、多酚类化合物、矿物质、有机酸等的功能性产品。酵素是公认的纯天然保健产品，酵素中微生物在发酵过程中不仅可产生多种功效酶、氨基酸、短链脂肪酸、醇类、酯类等次级代谢产物，还可能将发酵原材料的某些成分转化成高活性物质。通过有益微生物发酵产生的酵素中，超氧化物歧化酶(SOD)活性增多，具有较好的抗氧化能力。我国的果蔬加工都以加工果蔬汁饮料为主，现在逐渐开发新类型的果蔬酵素饮品，但是，国内的植物酵素产品种类相对单一且质量参差不齐，对于复杂的发酵过程及加工工艺的研究不够深入，如有关肉苁蓉酵素的研究报道较少。

肉苁蓉又被称为金笋、地精、寸芸、疆芸，是列当科多年寄生草本植物肉苁蓉的干燥肉质茎，多生于藜科Chenopodiaceae梭梭属Haloxylon植物梭梭(盐木)H.ammodendron和白梭梭H.persicum的根部，具有很强的抗旱、抗寒、耐盐碱特性，是我国有名的一种中药材，具有“沙漠人参”的美称。肉苁蓉入药始载于《神农本草经》，南北朝时期，现代的药理学证明，它含有多种药用成分，具有抗肝损伤、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗凝血、抗氧化及免疫调节等多种生物活性，具有极高的药用价值。目前关于肉苁蓉的研究多集中于其有效化学成分的提取药理作用及其相关产品的开发应用。在新药、保健品、食品和饮品等领域中的开发、应用比较欠缺。目前已开发出流通于市场的产品有苁蓉酒、苁蓉养生液、养肾液、苁蓉口服液、苁蓉茶、苁蓉胶囊、苁蓉片、苁蓉颗粒和肉苁蓉煎丸等药品、保健品。肉苁蓉也常作为食品、保健品出现在人们的饮食中，较为常见的有肉苁蓉粥、苁蓉麻子仁膏、肉苁蓉酒、肉苁蓉枸杞酒和苁蓉菟丝酒等。因此对肉苁蓉进行更深入细致的研究，开发其药用保健价值，增加肉苁蓉产品价值，是肉苁蓉生产和研究机构迎来的新的机遇。

关于肉苁蓉酵素目前研究较少，中国专利CN104784261A记载了一种肉苁蓉酵素及其制备工艺，其采用肉苁蓉与谷物、蔬菜、水果、坚果等为原料，采用厌氧菌种、好氧菌种或厌氧与好氧菌种兼用发酵获得，酵素应用于口服液、片剂、胶囊和茶包具有明显改善免疫力和记忆力的功能，另外还有中国专利CN110250507A报道的一种肉苁蓉酵素为了提高肉苁蓉的利用率也是将肉苁蓉与水果、中草药混合后采用萃取结合发酵工艺制备，获得的酵素SOD活性为1100-1300U/g。中国专利CN109601799A报道了一种肉苁蓉酵素饮品的制备方法，接种根霉菌、红曲米菌种后密封发酵3-6个月得到饮品。

虽然均对肉苁蓉酵素进行了报道，为了提高肉苁蓉的利用率，均采用肉苁蓉与其他水果或者中药材结合的主原料，但采用的菌种复杂，由于液体深层发酵技术的关键在于培养基，需要考虑不同食用菌要用不同的培养基进行培养，另外还需考虑发酵及环境条件等，发酵控制环节多且复杂，不易控制。同时发酵阶段需要分阶段进行，第一阶段为好氧阶段，需控制无菌空气通气量，第二阶段为厌氧阶段，需关闭通气并控制发酵温度，造成其制备工艺复杂，增加污染杂菌的可能性，发酵周期长，制备成本增加。且现有专利和文献未见有以肉苁蓉为原料发酵保肝护肾肉苁蓉酵素的报道。

发明内容

针对现有肉苁蓉酵素制备工艺多与水果或中药材为主原料萃取发酵获得造成制备工艺复杂，制备菌种筛选困难等问题，需要考虑不同菌种采用不同的培养基进行培养，另外还需考虑发酵及环境条件等，发酵控制环节多且复杂，不易控制的现实情况，且未见有专利和文献报道有关肉苁蓉直接发酵制备保肝护肾肉苁蓉酵素的技术现状。本发明旨在于提供一种保肝护肾肉苁蓉酵素及其制备方法，以肉苁蓉为原料，不含任何添加剂，采用微生物发酵法生产SOD，发酵条件易于控制，且发酵周期短。SOD活性从最初的401.26U/mL提高到了625.03U/mL，对羟自由基的清除率达到65.02％，对超氧阴离子的清除率达到85.98％，DPPH自由基清除率达到93.68％，并且发酵改善了肉苁蓉的风味，发酵过程中有机酸的大量产生使肉苁蓉酵素具有特有的酸味，整体酸甜可口，感官评分从84.10±1.14提高到94.00±0.77，具有极高的食用和保健价值。因此肉苁蓉酵素将有巨大的市场潜力，并在一定程度上扩大肉苁蓉的应用范围，使肉苁蓉这一宝贵资源有更可观的发展前景。

为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种具有护肝保肾功效的肉苁蓉酵素，该酵素的制备方法具体包括如下步骤：

(1)分别将购买得到的罗伊氏乳杆菌、戊糖片球菌、嗜热链球菌、动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的冻干粉在无菌操作台上倒入装有无菌MRS液体培养基的锥形瓶中，封口放置到37℃恒温培养箱中活化24h～48h得到菌悬液，用血球计数板在显微镜下计数，菌悬液的菌密度约为10

(2)将经过挑选的肉苁蓉切片称重后清洗，按照体积比肉苁蓉：水＝1：7～10的比例加水，煎煮30min～60min，待冷却后打浆，得到肉苁蓉浆液。

(3)取步骤(2)所得肉苁蓉浆液，加入肉苁蓉切片重量的0.4％～0.8％的果胶酶、0.2％～0.4％的纤维素酶和0.2％～0.4％的半纤维素酶充分搅拌，于50～60℃条件下酶解2h～3.5h。酶解反应结束后测定肉苁蓉酶解液的可溶性固形物含量；调整肉苁蓉酶解液的糖度，使糖白利度为9～13°Bx。

(4)将步骤(3)所得肉苁蓉酶解液于80～100℃灭酶灭菌10～15min后，冷却至室温待用。

(5)将步骤(1)得到的菌悬液分别按照一定体积比接种量为2*10

(6)将步骤(5)所得肉苁蓉发酵液于18～25℃低温过滤后，经100～121℃杀菌20～30min灌装封口包装，低温储藏，得肉苁蓉酵素成品。

本发明提供保肝护肾肉苁蓉酵素的制备中，所述菌悬液为罗伊氏乳杆菌、戊糖片球菌、嗜热链球菌、动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的菌悬液按照体积比30％～34％、14％～18％、15％～19％、10％～14％、12％～16％、7％～11％混合获得，该菌悬液的活菌数≥10

本发明提供保肝护肾肉苁蓉酵素的制备中，所述菌种的培养时间为36h，培养温度为37℃。

本发明提供保肝护肾肉苁蓉酵素的制备中，所述肉苁蓉与煎煮水的体积比为1：8，煎煮时间为40min。

本发明提供保肝护肾肉苁蓉酵素的制备中，所述酶为果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，酶的添加量分别为肉苁蓉切片重量的0.6％、0.3％和0.3％，酶解时间为3.0h，酶解温度为55℃。

本发明提供保肝护肾肉苁蓉酵素的制备中，所述发酵温度为32℃，发酵时间为24h。

本发明提供保肝护肾肉苁蓉酵素的制备中，所述灭菌灭酶温度为90℃，灭菌灭酶时间为12min。

本发明同时提供一种肉苁蓉酵素在保肝护肾中的应用。

通过以上技术方案，本发明取得如下技术效果：

(1)本发明制得的肉苁蓉酵素，功能性成分含量较高，同时采用微生物生产法生产超氧化物歧化酶，SOD为625.03U/mL，改善了肉苁蓉的风味与口感，生成有机酸和芳香物质，感官评分为94.00±0.77分。同时，对羟自由基的清除率达到65.02％，对超氧阴离子的清除率达到85.98％，DPPH自由基清除率达到93.68％，相比未接种发酵时都有显著的提高。因为氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，也被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素，所以本发明制得的肉苁蓉酵素在一定程度上兼有养心通脉、保肝护肾、疏通肠道、抗衰老抗氧化、调节免疫等功效。

(2)本发明提供的肉苁蓉酵素不需要与水果或中药材复合发酵来改善风味，且制备工艺简单易操作，同时改善了肉苁蓉的风味与口感，富含超氧化物歧化酶且具有保肝护肾、疏通肠道、抗衰老抗氧化等功效，不仅开阔了肉苁蓉精深加工的途径，而且增加了酵素的新品种，具有新产品的典型性特点。

(3)本发明采用的罗伊氏乳杆菌、戊糖片球菌、嗜热链球菌、动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌尽管都是通过公众渠道购买获得，如采用这六种菌种常见的培养基应用本发明实施，需考虑肉苁蓉酵素的发酵及环境条件等，发酵控制环节多且复杂，不易控制的现实情况，制备的肉苁蓉酵素不能很好体现本发明制备的肉苁蓉酵素SOD含量，以及制备的肉苁蓉酵素对羟自由基的清除率达、对超氧阴离子的清除率及DPPH自由基清除率都不如采用本发明提供的统一制备方法获得效果好。

附图说明

图1为本发明肉苁蓉酵素水煎时间和酶解时间对肉苁蓉酵素SOD活性的影响图。

图2为本发明肉苁蓉酵素水煎时间和发酵时间对肉苁蓉酵素SOD活性的影响图。

图3为本发明肉苁蓉酵素酶解时间和发酵时间对肉苁蓉酵素SOD活性的影响图。

图4为本发明肉苁蓉酵素水煎时间和酶解时间对肉苁蓉酵素感官评分的影响图。

图5为本发明肉苁蓉酵素水煎时间和发酵时间对肉苁蓉酵素感官评分的影响图。

图6为本发明肉苁蓉酵素酶解时间和发酵时间对肉苁蓉酵素感官评分的影响图。

图7为不同浓度的肉苁蓉酵素对细胞存活率的影响图。

图8为不同浓度肉苁蓉酵素对酒精损伤细胞存活率的影响图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而行业内人士应该理解，本发明并不应局限于这里所阐述的实施方式，而且在不偏离本发明的中心和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明采用的罗伊氏乳杆菌、戊糖片球菌、嗜热链球菌、动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌都可通过公众渠道购买获得。

实施例1：保肝护肾肉苁蓉酵素的制备

本实施例提供一种保肝护肾肉苁蓉酵素通过如下的制备方法获得：

(1)分别将购买得到的罗伊氏乳杆菌、戊糖片球菌、嗜热链球菌、动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的冻干粉在无菌操作台上倒入装有无菌MRS液体培养基的锥形瓶中，封口放置到37℃恒温培养箱中活化24h～48h得到菌悬液，用血球计数板在显微镜下计数，菌悬液的菌密度约为10

(2)将经过挑选的肉苁蓉切片称重后清洗，按照体积比肉苁蓉：水＝1：7～10的比例加水，煎煮30min～60min，待冷却后打浆，得到肉苁蓉浆液。

(3)取步骤(2)所得肉苁蓉浆液，加入肉苁蓉切片重量的0.4％～0.8％的果胶酶、0.2％～0.4％的纤维素酶和0.2％～0.4％的半纤维素酶充分搅拌，于50～60℃条件下酶解2h～3.5h。酶解反应结束后测定肉苁蓉酶解液的可溶性固形物含量；调整肉苁蓉酶解液的糖度，使糖白利度为9～13°Brix度(°Bx)。

(4)将步骤(3)所得肉苁蓉酶解液于80～100℃灭酶灭菌10～15min后，冷却至室温待用。

(5)将步骤(1)得到的菌悬液分别按照一定体积比接种量为2*10

(6)将步骤(5)所得肉苁蓉发酵液于18～25℃低温过滤后，经100～121℃灭菌20～30min灌装封口包装，低温储藏，得肉苁蓉酵素成品。

菌悬液为罗伊氏乳杆菌、戊糖片球菌、嗜热链球菌、动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的菌悬液按照体积比30％～34％、14％～18％、15％～19％、10％～14％、12％～16％、7％～11％混合获得，该菌悬液的活菌数≥10

实施例2：保肝护肾肉苁蓉酵素的制备

本实施例在实施例1的基础上，提供一种保肝护肾肉苁蓉酵素的制备方法，其中，肉苁蓉与煎煮水的体积比为1：8，煎煮时间为40min；果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，酶的添加量分别为肉苁蓉切片重量的0.6％、0.3％和0.3％，酶解时间为3.0h，酶解温度为55℃，发酵温度为32℃，发酵时间为24h。

实施例3：保肝护肾肉苁蓉酵素的制备

本实施例在实施例1的基础上，提供一种保肝护肾肉苁蓉酵素的制备方法，其中，肉苁蓉与煎煮水的体积比为1：7，煎煮时间为30min；果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，酶的添加量分别为肉苁蓉切片重量的0.4％、0.2％和0.2％，酶解时间为2.0h，酶解温度为50℃，发酵温度为30℃，发酵时间为12h。

实施例4：保肝护肾肉苁蓉酵素的制备

本实施例在实施例1的基础上，提供一种保肝护肾肉苁蓉酵素的制备方法，其中，肉苁蓉与煎煮水的体积比为1：10，煎煮时间为60min；果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，酶的添加量分别为肉苁蓉切片重量的0.8％、0.4％和0.4％，酶解时间为3.5h，酶解温度为60℃，发酵温度为37℃，发酵时间为36h。

实施例5：保肝护肾肉苁蓉酵素的制备

本实施例在实施例1的基础上，提供一种保肝护肾肉苁蓉酵素的制备方法，其中，肉苁蓉与煎煮水的体积比为1：9，煎煮时间为50min；果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，酶的添加量分别为肉苁蓉切片重量的0.5％、0.3％和0.3％，酶解时间为3.0h，酶解温度为55℃，发酵温度为35℃，发酵时间为26h。

实施例6：保肝护肾肉苁蓉酵素制备的优化

本实施例在实施例1-5的基础上，对本发明提供的工艺参数进行面相应分析，主要考察煎煮时间(A)、酶解时间(B)、发酵时间(C)对保肝护肾肉苁蓉酵素SOD活性(R1)、感官评分(R2)的影响，并建立制备工艺参数各因素与保肝护肾肉苁蓉酵素的品质指标的数学模型，响应面试验因素与水平件附表1，Box-bohnkeb试验设计与结果参见附表2及附图1至附图6所示。

表1：响应面试验因素水平表

表2：Box-bohnken实验设计结果

根据响应面数据分析，本发明保肝护肾肉苁蓉酵素的最佳工艺条件为：煎煮时间为40min，酶解时间为3.0h，发酵时间为24h，在此工艺条件下得到的保肝护肾肉苁蓉酵素SOD活性最高，且感官评分最高。在验证试验中，选择工艺条件为煎煮时间为40min，酶解时间为3.0h，发酵时间为24h，得到的保肝护肾肉苁蓉酵素的SOD活性为625.03U/mL，感官评分为94.68，实测值与预估值基本一致，工艺模型具有较好的效果。

实施例7：保肝护肾肉苁蓉酵素的应用

本实施例在实施例1-6的基础上，对本发明提供的保肝护肾肉苁蓉酵素的性能进行了测试对比，主要考察本发明提供的肉苁蓉酵素体外护肝活性及其感官评价。

1.肉苁蓉酵素的体外护肝活性

(1)肉苁蓉酵素样品对WRL68肝细胞的细胞毒性试验

将对数期的WRL68肝细胞接种于96孔板(1×10

由附图7数据可知，同浓度的酵素样品对细胞均无明显的毒性作用，相反，均对细胞有一定的增殖作用，10mL/L和20mL/Lmg/g的浓度下，对细胞的增殖作用不大，40mL/L-100mL/L浓度时，细胞存活率逐渐增大，在一定浓度下，酵素样品对细胞的增殖作用可达到1.6倍。

(2)肉苁蓉酵素对酒精损伤肝细胞的修复作用

实验分为空白组、对照组、模型组和实验组，每组设6个复孔。空白组每孔只加入100μL培养基，对照组和模型组加入100μL密度为1×10

由附图8数据可知，模型组成活率为58.82％。当样品浓度为50～150mL/L时，与模型组相比，肉苁蓉酵素能显著提高肝细胞存活率(P<0.01)。但细胞存活率不表现出浓度依赖性。而当肉苁蓉酵素浓度达到150mL/L时，WRL68细胞存活率从120.35％下降到108.86％。这是因为样品在一定浓度时有利于肝细胞存活，但当浓度高到足以影响细胞微环境时，细胞存活率受到抑制。综上所述，肉苁蓉酵素样品浓度在50～150mL/L时，与模型组比较有显著差异，对酒精损失的肝细胞有一定的修复作用，表明肉苁蓉酵素具有体外肝保护作用。

(3)肉苁蓉酵素对损伤细胞的修复作用的机制研究

将细胞以2×10

由表3数据可知，与阴性对照组相比，模型对照组中的SOD和GSH-Px活力显著降低，而MDA的含量显著上升；相比模型对照组，细胞经50-150mL/L的酵素样品处理后，能提高SOD、GSH-PX活力和降低MDA的含量。当样品的浓度达到100mL/L时，SOD和GSH-PX活力从模型组的(8.45±1.11)U/mgprot、(21.82±1.34)U/mgprot分别增加到(16.17±0.42)U/mgprot和(22.62±0.79)U/mgprot，而MDA含量从模型组的(1.19±0.15)nmol/mgprot降低到(0.72±0.05)nmol/mgprot。上述结果表明，肉苁蓉酵素是通过增加SOD、GSH-PX活力和降低MDA含量来修复乙醇诱导细胞的损伤。

表3：肉苁蓉酵素对乙醇诱导WRL68细胞损伤后SOD、MDA和GSH-Px活力的影响

2.肉苁蓉酵素的感官评价试验

选取上述实施例1中的肉苁蓉酵素和未接菌发酵的肉苁蓉原液进行感官评价，方法参照文献并稍作修改。感官评价小组由经过训练的10名成员组成，从气味、滋味、色泽和组织状态四个方面对肉苁蓉原液和肉苁蓉酵素进行感官评价，总分100分，评分标准见表4。

表4：感官评价表

感官评价结果如表5所示，肉苁蓉酵素的总评分为94.00±0.77，肉苁蓉原液的总评分为84.10±1.14，两者的色泽都均匀一致且自然明亮，无杂质沉淀，状态均匀。经过混菌发酵后，肉苁蓉酵素发酵风味纯正，有浓郁的芳香气味，口感酸甜适中，味道柔和协调，明显优于肉苁蓉原液。

表5：感官评价结果

综上数据分析可知，本发明以肉苁蓉为原料，不含任何添加剂，采用微生物发酵法生产SOD，发酵条件易于控制，且发酵周期短。SOD活性从最初的401.26U/mL提高到了625.03U/mL，并且发酵改善了肉苁蓉酵素的风味，发酵过程中产生大量有机酸使肉苁蓉酵素具有特有的酸味，整体酸甜可口，感官评分从84.10±1.14提高到94.00±0.77，具有极高的食用和保健价值。因此肉苁蓉酵素将有巨大的市场潜力，并在一定程度上扩大肉苁蓉的应用范围，使肉苁蓉这一宝贵资源有更可观的发展前景。

上述实施例采用的罗伊氏乳杆菌、戊糖片球菌、嗜热链球菌、动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌尽管都是通过公众渠道购买获得，如采用这六种菌种常见的培养基应用本发明实施，需考虑肉苁蓉酵素的发酵及环境条件等，发酵控制环节多且复杂，不易控制的现实情况，制备的肉苁蓉酵素不能很好体现本发明制备的肉苁蓉酵素SOD含量，以及制备的肉苁蓉酵素对羟自由基的清除率达、对超氧阴离子的清除率及DPPH自由基清除率都不如采用本发明提供的统一制备方法获得效果好。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。