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芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器及其制备方法和在检测依替米星中的应用

文献发布时间：2023-06-19 18:35:48

技术领域

本发明涉及芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器及其制备方法和在检测依替米星中的应用。

背景技术

依替米星(Etimicin)是一种半合成的水溶性氨基糖苷类抗生素，抑制敏感菌正常的蛋白质合成，为广谱抗生素，临床上使用硫酸依替米星。虽然硫酸依替米星在联合使用或单独使用时效果不错，但有许多副作用，如肾毒性、耳毒性、肝毒性、多形性红斑、过敏性休克和高热等。尤其值得注意的是耳毒性和肾毒性。当联合用药时，这些不良反应会大大增强。在合理用药的指导思想下，对药物不良反应的发生进行监测以及实时监测血液、尿液中的依替米星浓度是非常必要的。依替米星在不同年龄，不同疾病患者体内的吸收分布，代谢，排泄存在明显差异，治疗中应进行血药浓度的监测以防不良反应的发生。由于依替米星的副作用与剂量密切相关，因此建立快速、有效的分析方法具有重要意义。

然而，已报道的检测依替米星的方法不多，大多为高效液相色谱法(HPLC)。尽管这些仪器方法具有灵敏度和准确性的优点，但是不可避免的存在着成本高、前处理复杂、不能实现实时在线检测等缺点。

因此，非常有必要开发一种快速、操作简单、高灵敏度的方法，实现实时检测依替米星的目的。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明基于芦丁功能化金纳米粒子对依替米星的特异性识别，提供了芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器的制备方法及其在检测依替米星中的应用，以及以芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器结合智能手机平台构建的实时检测依替米星的装置。该传感器能够简便、快捷、灵敏、实时、定量检测依替米星。

本发明的原理如下：

本发明在内滤过效应(IFE)的基础上，建立了关于芦丁功能化的金纳米粒子(Rutin-AuNPs)和7-羟基香豆素混合物(7-Hydroxycoumarin)的荧光比色传感器，实现了对依替米星的快速、灵敏检测。该系统还通过智能手机传感平台成功应用于实际样品。由于芦丁(Rutin)的抗氧化特性，绿色合成的Rutin-AuNPs具有均匀的粒径，良好的单分散性和稳定性，见图1。研究发现，7-羟基香豆素的发射光谱与Rutin-AuNPs的吸收光谱大部分重叠。作为一种良好的荧光受体，Rutin-AuNPs可以有效而快速地淬灭7-羟基香豆素的荧光。Rutin-AuNPs与依替米星之间的作用机制如下。1)由芦丁合成的Rutin-AuNPs带负电。依替米星带正电，两者通过静电力相互作用；2)依替米星通过Ag-N键与Rutin-AuNPs表面结合；3)芦丁和依替米星之间可能存在着类似于糖类之间的亲和力。上述一种或多种机制共同作用，引起了Rutin-AuNPs的大量聚集。依替米星取代了Rutin-AuNPs表面的7-羟基香豆素，导致荧光迅速恢复。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器的制备方法，步骤如下：

(1)将氯金酸溶液和芦丁溶液于60-80℃下混合并搅拌，待溶液颜色由透明逐渐转变为紫红色后，停止加热并冷却，得到芦丁功能化金纳米粒子Rutin-AuNPs；

(2)将步骤(1)制备的芦丁功能化金纳米粒子与7-羟基香豆素溶液混合均匀，得到芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器，其中所述芦丁功能化金纳米粒子的终浓度与所述7-羟基香豆素的终浓度的摩尔比＝0.18-1.10：33.33×10

作为优选，将芦丁溶液在搅拌下一次性快速加入到氯金酸溶液中；

作为优选，当所述7-羟基香豆素的终浓度为33.33μM时，所述芦丁功能化金纳米粒子的终浓度为0.18-1.10nM；

作为优选，所述芦丁功能化金纳米粒子的终浓度与所述7-羟基香豆素的终浓度的摩尔比＝0.82-1.10：33.33×10

一次性加入快速搅拌是为了保证合成的金纳米粒子是均匀稳定分散的。如果分次加入或者缓慢加入或者不搅拌都达不到均匀稳定分散。

步骤(2)中所述混合均匀，优选为涡旋混合30s以上。以使得混合均匀，同时确保合成的纳米粒子大小均一。

作为优选，所述氯金酸的浓度为0.5-1.5g/L；和/或

所述芦丁溶液的浓度为0.2-0.6g/L。

本发明还提供芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器，是应用上述的方法制备得到的。

本发明还提供上述的芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器在检测依替米星含量中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的；作为优选，所述芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器在检测人和动物血清、尿液中依替米星中的应用。

作为优选，所述应用的步骤如下：

(1)建立标准曲线：将不同浓度的依替米星加入到上述的芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器中，在激发波长为340nm的条件下，利用荧光分光光度计测定458nm下的荧光强度，以依替米星的终浓度为横坐标，(F-F0)/F0为纵坐标建立标准曲线；

(2)待测样品中依替米星含量的检测：将待测样品加入到上述的芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器中，在激发波长为340nm的条件下，利用荧光分光光度计测定458nm下的荧光强度，将该荧光强度值代入步骤(1)所述的标准曲线方程，计算待测样品中依替米星的含量；

作为优选，当待测样品为人和动物血清或尿液时，将步骤(1)中的依替米星加入到相应的健康人和动物的血清或尿液中。

作为优选，所述应用的步骤如下：

(1)建立标准曲线：将不同浓度的依替米星加入到上述的芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器中，得到混合溶液，用智能手机在365nm处紫外灯下对混合溶液进行拍照，利用颜色分析器软件将图像的颜色转化成RGB值，以依替米星终浓度为横坐标，R+G+B值为纵坐标建立标准曲线；

(2)待测样品中依替米星含量的检测：将待测样品加入到上述的芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器中，得到混合溶液，用智能手机在365nm处紫外灯下对混合溶液进行拍照，利用颜色分析器软件将图像的颜色转化成RGB值，将该R+G+B值代入步骤(1)所述的标准曲线方程，计算待测样品中依替米星的含量；

作为优选，当待测样品为人和动物血清或尿液时，将步骤(1)中的依替米星加入到相应的健康人和动物的血清或尿液中。

作为优选，检测下限为0.12μM。

本发明还提供一种检测依替米星含量的方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，步骤如下：

作为优选，当待测样品为人和动物血清或尿液时，将步骤(1)中的依替米星加入到相应的健康人和动物的血清或尿液中。

本发明还提供一种检测依替米星含量的方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，步骤如下：

作为优选，当待测样品为人和动物血清或尿液时，将步骤(1)中的依替米星加入到相应的健康人和动物的血清或尿液中。

本发明还提供一种芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器结合智能手机传感平台检测装置，所述装置由上述的芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器，智能手机和颜色分析器应用软件组成。

本发明内滤过效应(IFE)的基础上，建立了芦丁功能化的金纳米粒子(Rutin-AuNPs)和7-羟基香豆素(7-Hydroxycoumarin)混合物的荧光比色传感器，实现了对依替米星的快速、灵敏检测，该传感器被成功地应用于实际样品的检测。本发明以依替米星浓度为横坐标，[(F-F0)/F0]为纵坐标建立标准曲线。F和F0分别是存在和不存在依替米星时的荧光强度。标准曲线为(F-F

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为实施例1制备的Rutin-AuNPs的透射电子显微图。

图2中，A图为Rutin-AuNPs的吸收光谱和7-Hydroxycumarin(7-羟基香豆素)的发射光谱。B图为不同终浓度的Rutin-AuNPs(0,0.18,0.37,0.55,0.73,0.82,0.91,1.10nM)得到的Rutin-AuNPs荧光比色传感器的荧光颜色照片和荧光光谱。

图3为混合溶液中不同浓度(依替米星终浓度为0.20、0.41、0.61、0.82、1.02μM)依替米星存在时荧光颜色的照片、荧光光谱图以及标准曲线。

图4中，A图和B图为尿液样本中不同终浓度(0.41、0.82、2.04、4.08、6.12μM)依替米星存在时荧光颜色的照片、荧光光谱图以及标准曲线；C图和D图为血液样本中不同终浓度(2.04、6.12、8.16、10.20、12.24μM)依替米星存在时荧光颜色的照片、荧光光谱图以及标准曲线。

图5中，A图为本发明的Rutin-AuNPs荧光比色传感器结合智能手机平台检测尿液样品中不同终浓度(0.41、0.82、2.04、4.08、6.12μM)依替米星存在时荧光颜色的照片以及标准曲线。B图为本发明的Rutin-AuNPs荧光比色传感器结合智能手机平台检测血液样本中不同终浓度(2.04、6.12、8.16、10.20、12.24μM)依替米星存在时荧光颜色的照片以及标准曲线。C图是Rutin-AuNPs荧光比色传感器结合智能手机平台将荧光颜色的照片转化为RGB值的示意图。

图6为不同物质(依替米星、克林霉素、磺胺嘧啶、克拉霉素、氨苄西林、青霉素钾、罗红霉素、甲氧苄啶、甲砜霉素、氧氟沙星、四环素、红霉素和阿莫西林)存在时Rutin-AuNPs的照片、荧光光谱图和458nm波长处荧光强度比较柱状图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

材料/试剂：氯金酸(HAuCl

一、本发明的芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器(Rutin-AuNPs荧光比色传感器)的制备如下：

取10-30mg氯金酸溶于20mL水中，搅拌并加热至60-80℃。将1-3mg芦丁加入到5mL水中充分溶解，在搅拌下一次性快速加入到氯金酸溶液中，加热搅拌10min后，溶液颜色由透明逐渐转变为紫红色，停止加热并室温静置待产物溶液冷却。得到的紫红色溶液即为芦丁功能化金纳米粒子(Rutin-AuNPs)。

取一定体积的Rutin-AuNPs与7-羟基香豆素溶液(终浓度为33.33μM)涡旋混合30s以上，以使得混合均匀，同时确保合成的纳米粒子大小均一，加水使得混合液中Rutin-AuNPs的终浓度为0.18-1.10nM，即得Rutin-AuNPs荧光比色传感器。

Rutin-AuNPs的浓度对于制备芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器至关重要。Rutin-AuNPs可以有效而快速地淬灭7-羟基香豆素的荧光。当7-羟基香豆素的终浓度为33.33μM时，随着Rutin-AuNPs的终浓度由0.18nM增加到1.10nM)，7-羟基香豆素的荧光强度逐渐降低，荧光颜色逐渐变暗。结果表明，Rutin-AuNPs对7-羟基香豆素具有良好的淬灭性能。当Rutin-AuNPs的浓度小于0.18nM时，对7-羟基香豆素的淬灭效果较低，荧光恢复效率和系统的敏感性降低。当Rutin-AuNPs的浓度大于1.10nM时，对7-羟基香豆素的淬灭效果极强，后续恢复其荧光较为困难，荧光恢复效率和系统的敏感性也降低。综上，选择Rutin-AuNPs荧光比色传感器中Rutin-AuNPs的终浓度为0.18-1.10nM作为淬灭剂的最佳浓度。

实施例1

一、本发明的芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器(Rutin-AuNPs荧光比色传感器)的制备如下：

取20mg氯金酸溶于20mL水中，搅拌并加热至70℃。将2mg芦丁加入到5mL水中充分溶解，搅拌下一次性加入到上述氯金酸溶液中，在反应过程中，溶液的颜色逐渐由浅黄色变为紫红色。整个反应持续搅拌并加热10分钟后，停止加热并冷却至室温。得到芦丁功能化金纳米粒子(Rutin-AuNPs)，根据朗伯比尔定律计算得Rutin-AuNPs的浓度为1.15nM(A＝εcl,ε＝3.6×10

取30μL(终浓度33.33μM)7-羟基香豆素溶液加入到345μLRutin-AuNPs(终浓度0.82nM)溶液中混合均匀，加水至总体积为480μL，得到芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器。倒入三角瓶或烧杯，放置在4℃冰箱中进行保存备用。

终浓度的含义为：7-羟基香豆素和Rutin-AuNPs混合溶液中，各组分的物质的量浓度。

图1为实施例1制备的Rutin-AuNPs的透射电子显微图。

二、加入不同浓度的Rutin-AuNPs得到的芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器在荧光比色检测中的能力

由于Rutin-AuNPs的浓度会影响对7-羟基香豆素的淬灭能力，继而影响荧光恢复效率和系统的敏感性，因此需要测定不同浓度的Rutin-AuNPs得到的芦丁功能化金纳米粒子荧光比色传感器在荧光比色检测中的能力。

材料/试剂：按照步骤一的Rutin-AuNPs荧光比色传感器的合成方法，在保持其他条件不变的情况下，改变Rutin-AuNPs的终浓度(0,0.18,0.37,0.55,0.73,0.82,0.91,1.10nM)，得到不同的Rutin-AuNPs荧光比色传感器。

方法：将不同体积的Rutin-AuNPs与30μL的7-羟基香豆素涡旋混合30s，得到Rutin-AuNPs的终浓度分别为0,0.18,0.37,0.55,0.73,0.82,0.91,1.10nM的Rutin-AuNPs荧光比色传感器，在紫外灯365nm处记录荧光颜色，用荧光分光光度计记录荧光强度，荧光分光光度计激发波长340nm,发射波长458nm，结果见图2。

图2中，A图为Rutin-AuNPs的吸收光谱和7-羟基香豆素的发射光谱。B图为不同终浓度的Rutin-AuNPs(0,0.18,0.37,0.55,0.73,0.82,0.91,1.10nM)得到的Rutin-AuNPs荧光比色传感器的荧光颜色照片和荧光光谱。

结果：从图2可以看出，随着Rutin-AuNPs的终浓度由0.18nM增加到1.10nM，7-羟基香豆素的荧光强度逐渐降低，荧光颜色逐渐变暗。结果表明，Rutin-AuNPs可以有效而快速地淬灭7-羟基香豆素的荧光。当Rutin-AuNPs的终浓度小于0.18nM时，荧光强度很高，对7-羟基香豆素的淬灭效果极弱，荧光恢复效率和系统的敏感性降低。当Rutin-AuNPs的终浓度大于1.10nM时，荧光强度很高，对7-羟基香豆素的淬灭效果极强，对后续恢复荧光造成困难，荧光恢复效率和系统的敏感性也降低。综上，Rutin-AuNPs溶液终浓度为0.18nM-1.10nM时均可以有效淬灭7-羟基香豆素的荧光。

三、Rutin-AuNPs荧光比色传感器对不同浓度依替米星的检测及标准曲线的建立

材料/试剂：Rutin-AuNPs；依替米星购买于北京高教研科技有限公司。

方法：取6个离心管，向每个离心管中加入480μL步骤一制备的Rutin-AuNPs荧光比色传感器，然后分别加入不同浓度(终浓度为0.20、0.41、0.61、0.82、1.02μM)，10μL的依替米星水溶液，得到混合溶液，将混合溶液涡旋混匀30s后，在紫外灯365nm处记录荧光颜色，用荧光分光光度计记录荧光强度，荧光分光光度计激发波长340nm，发射波长458nm，结果见图3。

图3为混合溶液中不同浓度(依替米星终浓度为0.20、0.41、0.61、0.82、1.02μM)依替米星存在时荧光颜色的照片、荧光光谱图以及标准曲线。

结果：由图3可知，当依替米星终浓度从0.20μM增加到1.02μM时，溶液荧光强度逐渐增强，同时颜色也从黑色变为蓝色。

以依替米星的终浓度为横坐标，(F-F0)/F0为纵坐标建立标准曲线。F和F0分别是存在和不存在依替米星时，检测波长为458nm时的荧光强度。建立的标准曲线方程为：(F-F

四、Rutin-AuNPs荧光比色传感器对实际样品的检测及标准曲线的建立

为了证实Rutin-AuNPs荧光比色传感器检测实际样品中依替米星的能力，需要对Rutin-AuNPs荧光比色传感器对实际样品中依替米星的响应情况进行考察。因为金纳米粒子会受到实际样品基质的干扰，故检测实际样品时，需要重新建立标准曲线。

材料/试剂：Rutin-AuNPs；依替米星购买于北京高教研科技有限公司；人血清、尿液样本采集自某高校的健康志愿者。

1、标准曲线的建立：

方法：受试者(某高校的健康志愿者)取2mL尿液和2mL血液样本。样本前处理：样本在14,000rpm下离心10分钟，上清液通过0.22μm的膜过滤。将尿液样品和血液样本稀释20倍，分别加入依替米星配置成1mM的依替米星溶液。取12个离心管，分成血液样本组和尿液样本组，向每组的每个离心管中加入480μL步骤一制备的Rutin-AuNPs荧光比色传感器，然后分别加入不同浓度(尿液样本组依替米星终浓度为0.41、0.82、2.04、4.08、6.12μM，血液样本组依替米星终浓度为2.04、6.12、8.16、10.20、12.24μM)，10μL的依替米星水溶液，得到混合溶液，将混合溶液涡旋混匀30s后，在紫外灯365nm处记录荧光颜色，用荧光分光光度计记录荧光强度，荧光分光光度计激发波长340nm，发射波长458nm，结果见图4。

结果：由图4可知，随着实际样品中尿液(图4A和B)和血液(图4C和D)中依替米星终浓度分别从0.41到6.12μM、2.04到12.24μM增加，溶液荧光强度逐渐增强，同时荧光颜色也从黑色变为蓝色。结果表明，该荧光检测系统的灵敏度很高，相关系数均为0.99。该检测系统可以与样品建立良好的线性关系。

2、实际样品的检测：

方法：受试者(某医院住院病人)静脉滴注硫酸依替米星(创成)200mg(用5％葡萄糖注射液100mL溶解，1小时滴注完成)，于滴注完1小时，取2mL血液和2mL尿液样本。样本前处理：样本在14,000rpm下离心10分钟，上清液通过0.22μm的膜过滤。

取1个离心管，向离心管中加入480μL步骤一制备的Rutin-AuNPs荧光比色传感器和10μL的血液样本。将混合溶液涡旋混匀30s以上后，在紫外灯365nm处记录荧光颜色，用荧光分光光度计记录荧光强度，荧光分光光度计激发波长340nm，发射波长458nm。

取1个离心管，向离心管中加入480μL步骤一制备的Rutin-AuNPs荧光比色传感器和10μL的尿液样本。将混合溶液涡旋混匀30s以上后，在紫外灯365nm处记录荧光颜色，用荧光分光光度计记录荧光强度，荧光分光光度计激发波长340nm，发射波长458nm。

结果：通过图4标准曲线和稀释倍数计算，血液中依替米星的浓度为18.98μg/mL，尿液中依替米星的浓度为25.66μg/mL，这表明此方法能够测定血液和尿液中依替米星的浓度。

五、Rutin-AuNPs荧光比色传感器结合智能手机平台对实际样品的检测及标准曲线的建立

材料/试剂：Rutin-AuNPs；依替米星购买于北京高教研科技有限公司；任意一款智能手机；颜色分析器(可任意浏览器搜索下载该手机软件)；人血清、尿液样本：使用步骤四-1“标准曲线的建立”中的已加入Rutin-AuNPs荧光比色传感器和依替米星，并涡旋混匀的血液样本和尿液样本；以及使用步骤四-2“实际样品的检测”中的已加入Rutin-AuNPs荧光比色传感器并涡旋混匀的血液样本和尿液样本。

方法：用智能手机在紫外灯365nm下分别拍摄(避太阳光拍摄)步骤四-1“标准曲线的建立”中的血液样本和尿液样本两个组的荧光照片，并分别通过颜色分析器软件获得RGB值。

以依替米星终浓度为横坐标，R+G+B值为纵坐标建立标准曲线，从而能够检测实际样品中依替米星的浓度。

结果：图5A和B分别展示了R+G+B值与尿液样本和血液样本中添加的依替米星的终浓度之间存在良好的线性关系。结果显示，该传感平台高度敏感，相关系数为0.99。因此，该智能手机传感平台可以定量、方便、直观、灵敏地检测实际样品中的依替米星。

本申请发明人进一步采用了不同款手机的原相机进行拍摄，所得到的照片颜色误差较小，证明了本发明的方法具有可行性。需要注意的是：拍摄时要保证避光环境，以免产生误差。

实际样品的检测：

方法：分别用智能手机在紫外灯365nm下分别拍摄(避太阳光拍摄)步骤四-2“实际样品的检测”中的血液样本和尿液样本两个组的荧光照片，并通过颜色分析器软件获得RGB值。

结果：通过图5标准曲线和稀释倍数计算，血液中依替米星的浓度为18.66μg/mL，尿液中依替米星的浓度为25.86μg/mL，与步骤四中的计算结果相似，这表明此方法能够对血液和尿液中依替米星浓度进行测定。该方法可以用于现场检测依替米星。

六、实验体系的验证：

材料/试剂：Rutin-AuNPs荧光比色传感器。磺胺嘧啶、氨苄西林、青霉素钾、氧氟沙星、甲氧苄啶、红霉素和克拉霉素购自上海麦克林生物化学有限公司。依替米星购自高加索科技有限公司(中国北京)。克林霉素和磺胺嘧啶购自源叶生物技术有限公司。罗红霉素购自索莱宝生命科学有限公司。四环素和甲砜霉素购自上海迈瑞尔化学科技有限公司。

选择性实验

向离心管中加入480μL的Rutin-AuNPs荧光比色传感器，然后分别加入10μL目标物(依替米星、克林霉素、磺胺嘧啶、克拉霉素、氨苄西林、青霉素钾、罗红霉素、甲氧苄啶、甲砜霉素、氧氟沙星、四环素、红霉素和阿莫西林)，涡旋混合30s。用荧光分光光度计记录荧光强度，荧光分光光度计激发波长340nm，测定其在458nm波长下的荧光光谱。计算上述检测样品在458nm处的荧光强度与空白对照的差值，建立柱状图进行比较。结果：如图6所示，只有在依替米星存在时，Rutin-AuNPs荧光比色传感器产生了肉眼可明显观察到的荧光颜色和荧光光谱图形状变化，与空白样品在458nm波长处的荧光强度差值远远大于其他样品，说明这些物质并不会对检测依替米星的实验结果产生干扰。

图6为不同物质(依替米星、克林霉素、磺胺嘧啶、克拉霉素、氨苄西林、青霉素钾、罗红霉素、甲氧苄啶、甲砜霉素、氧氟沙星、四环素、红霉素和阿莫西林)存在时Rutin-AuNPs的照片和458nm波长处荧光强度比较柱状图。

实施例2