胃癌相关尿蛋白标志物在诊断或监测胃癌治疗中的用途

技术领域

本发明涉及涉及胃癌相关的尿液蛋白标志物，具体而言，本发明涉及利用胃癌患者尿液样品和质谱分析蛋白组学技术获得的胃癌诊断和/或监测相关的尿液蛋白标志物，及其用途。

背景技术

胃癌(gastric cancer，GC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均较高，严重威胁人类的健康。由于胃癌早期缺乏特异性症状，大多数患者初诊时已处于中晚期。研究表明，Ⅰ期胃癌患者的5年生存率大于90％，而Ⅳ期远处转移的5年生存率仅为15％。因此，早期诊断和治疗是提高胃癌患者生存率的关键。目前胃癌诊断的金标准为胃镜结合活检检查，但由于其高侵入性和高时间成本，不适合大规模筛查。

疾病生物标志物是反映疾病发生、发展和预后的一系列物质，在临床上广泛应用于疾病的早期诊断、治疗监测和预后评估。目前临床上常用的胃肠道肿瘤标志物，包括癌胚抗原(CEA)、癌抗原19-9(CA19-9)和癌抗原72-4(CA72-4)，但其在胃癌患者中的阳性率<40％，且在早期胃癌患者中<20％，不足以用于胃癌的早期诊断，目前临床上还没有有效的客观诊断或监测工具。因此开发诊断胃癌并监测胃癌患者疾病治疗效果的生物标志物对于提高患者的生存率至关重要。

尿液可以通过无创的方式大量获得，其作为血液的“滤液”且免受机体稳态机制的调控，可以富集到因疾病产生的比血液更早的变化，是寻找生物标志物的良好来源，具有重大的临床应用前景。

发明内容

鉴于本领域的上述需求，根据本发明提供了针对选自以下蛋白表达水平的鉴定试剂在制备用于监测受试者的胃癌治疗效果的试剂中的用途，血清淀粉样蛋白A1、内皮细胞蛋白C受体、肌浆网富含组氨酸的钙结合蛋白、溶酶体相关膜糖蛋白3、溶质载体家族 2易化葡萄糖转运蛋白成员5、环状同源物4、层粘连蛋白亚基γ-1、血小板源性生长因子α受体、溶酶体相关膜糖蛋白2、WAP四二硫键核心域蛋白2、跨膜蛋白酶丝氨酸2、金属蛋白酶组织抑制剂1、Bro1结构域蛋白BROX、白细胞相关免疫球蛋白样受体-1、跨膜糖蛋白NMB、钙粘蛋白17、Neurotrimin(NTM)蛋白、角蛋白II型细胞骨架6A、神经源性位点缺口同源蛋白3、酪氨酸蛋白激酶受体UFO、酶原颗粒蛋白16同源物B、真核翻译起始因子5、超氧化物歧化酶3、嗅素蛋白4、骨形态发生蛋白2型受体、激活素 A受体1B型、粘连蛋白1、双糖链蛋白聚糖、钙粘蛋白相关家族成员5、Vasorin(VASN) 蛋白、带电多泡体蛋白2b、氧化低密度脂蛋白受体1、N-Ras(NRAS)蛋白、半乳凝集素-9、含EGF纤维蛋白样细胞外基质蛋白1、乳酰谷胱甘肽裂合酶、卵泡抑素相关蛋白 5、假定的跨膜蛋白INAFM2、电压依赖性阴离子选择性通道蛋白2、血小板内皮细胞粘附分子-1、肌酸激酶B、细胞外硫酸酯酶2、Rho相关GTP结合蛋白RhoC、白介素2受体β、去整合素金属蛋白酶9、细胞分裂调控蛋白42同源物、金属蛋白酶组织抑制剂2、甘露糖苷酶α1A类成员1、氯化物细胞内通道蛋白1、甘露糖苷酶α1C类成员1、人足细胞标记蛋白和Ras相关C3肉毒菌毒素底物1种的一种或两种以上的组合；

所述的表达水平为所述蛋白在所述受试者尿液样本中的表达水平。

在具体的实施方式中，在受试者治疗前及治疗后的多个时间点(治疗前至少1个、或至少2个、或至少3个；治疗后至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个)进行取样，根据患者尿液中蛋白标志物的变化情况来监测胃癌的治疗效果情况。技术人员能够理解，治疗前至少采集1个样本，治疗后至少采集一个样本，以便进行比较；当然，不限于一个样本，在更多的时间点采集样本允许动态地监测标记物的变化趋势。然而，也不应过于密集，超出受试者的承受能力；并且过于密集的样本采集，导致样本间的时间间隔太短，难以观察到变化，也会增加监测成本。可以理解，“治疗前”不意味着过于久远，比如受试者尚未患病之时。因此，治疗前，所述的受试者应当已经诊断患有胃癌。在一些实施方式中，治疗前是指，在所述受试者接受治疗之日前的0至 72小时；优选24至48小时；更优选12至24小时。此处，“接受治疗之日前的0小时”是指尚未接受、但马上要接受治疗。

治疗后是指，在所述受试者接受治疗之日后的5至20天，优选6至15天，更优选 7至14天。

在一些实施方式中，治疗前12至72小时内(包含端点数值，全文同)采集1个样本，并且治疗后7至14天采集一个样本。

在另一些实施方式中，治疗前12至24小时内采集1个样本，并且治疗后5至8天采集一个样本，治疗后12至20天再次采集一个样本。

根据一些实施方式中，治疗是指任何本领域中已知的以及未来的针对胃癌的治疗，包括但不限于有创治疗、无创治疗；包括但不限于：化学疗法、辐射疗法、物理切除、生物免疫疗法、中医中药疗法。在一个具体的实施方式中，治疗是指物理切除。技术人员应当理解，本发明中，蛋白表达水平和最终的治疗效果之间的关联性，不因具体的治疗方法而受到影响。这意味着，无论采取何种治疗方法，本发明中蛋白标记物的表达水平均能够用来评价治疗的效果如何。

在一些实施方式中，效果如何是指治愈。

本发明中，治愈体现为选自以下的任一项或组合：肿瘤切除干净、肢体活动自如、无头痛、无呕吐、无视物不清、无言语不利。

适用于本发明的鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段、探针或引物。在具体的实施方式中，抗体是单克隆抗体。本发明对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。

在具体的实施方式中，抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mimi抗体。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本发明。

在具体的实施方式中，表达水平选自核酸水平和蛋白质水平，尤其是蛋白质水平。

根据另一些实施方式，还提供了一种用于诊断和/或预后胃癌或用于评价对胃癌的治疗效果的试剂盒或芯片，其包含选自以上的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以上的蛋白的鉴定试剂组成。

在一些实施方式中，试剂盒中包含上述蛋白的鉴定试剂。在另一些实施方式中，芯片上固定有上述蛋白的鉴定试剂。在一些实施方式中，所述鉴定试剂是抗体或其抗原结合片段。

附图说明

图1：偏最小二乘法判别分析结果；GC_pre：胃癌术前；GC_post：胃癌术后7天；

图2为筛选的52个差异蛋白的功能注释和通路富集分析；其中，图2A为筛选的 52个差异蛋白GO生物过程注释分析；GO：基因本论；图中圆圈颜色代表富集显著性P 值；圆圈大小代表实际的功能类中差异表达蛋白参与个数；图2B为筛选的52个差异蛋白GO细胞成分注释分析，图中圆圈颜色代表富集显著性P值；圆圈大小代表实际的功能类中差异表达蛋白参与个数，图中圆圈颜色代表富集显著性P值；圆圈大小代表实际的功能类中差异表达蛋白参与个数；图2C为筛选的52个差异蛋白GO分子功能注释分析；图2D为筛选的52个差异蛋白KEGG通路富集分析；KEGG：京都基因与基因组百科全书，圆圈颜色代表富集显著性P值；圆圈大小代表实际的通路中差异表达蛋白参与个数。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验和方法，除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

以下实施例中的质谱定量试验，均在样本鉴定中间穿插HeLa标准品进行质谱数据的质量控制，并加入iRT标记肽进行保留时间的控制。

胃癌尿液样本来自空军军医大学第一附属医院的住院病人，样本采集和使用经医院伦理委员会批准，胃癌患者纳入标准是内窥镜活检组织学经过至少两位资深病理专家诊断为腺癌，在研究前均未进行胃癌手术、化疗、放疗等治疗，且所有患者无肿瘤转移或其他肿瘤病史。

实施例1：胃癌患者手术前后尿液的收集及分析

1.获取行肿瘤切除术的胃癌患者术前及术后恢复一周的晨尿样品，通过术前术后患者尿液蛋白组的比较，观察患者术前患病与术后恢复的变化，对临床上诊断或监测胃癌疾病具有重要的指导意义。

2.材料与试剂

(1)仪器：

Orbitrap Q Exactive HF质谱仪购自Thermo Fisher公司；

高效液相色谱仪EASY-nLC 1200购自Thermo Fisher公司。

(2)主要试剂：

色谱级乙腈、丙酮为Merk公司生产；甲酸为Thermo Fisher公司生产；甲酸铵为Sigma 公司生产；iST 96X试剂盒从PreOmics公司购买。

3.肽段样品的获得

3.1尿液样本的收集

收集28例胃癌患者肿瘤切除手术前和手术后一周的晨起空腹中段尿液，即56个尿液样本，离心后-80℃保存。具体收集流程如下：患者晨起中段尿液收集于50ml离心管中，1000g，4℃离心10min。随后在超净台内，将尿液上清分装新的一次性2.0ml无菌管中，12000g，4℃离心10min。离心好的尿液上清分装于冻存管中，并做好标记和记录， -80℃冰箱保存，所有过程在冰上进行，避免反复冻融。

3.2 56个真空抽干的肽段样品的获得

获得每个冻干的肽段样品的具体步骤如下：

(1)28例胃癌患者手术前和手术后一周的尿液样本从-80℃冰箱中取出，置于冰上溶解后各取300μl原液于2.0ml离心管中。

(2)加入5倍体积-20℃预冷的丙酮于步骤(1)中，混合均匀后置于-20℃过夜沉淀。

(3)完成步骤(2)后，4℃条件下，12000g离心30min弃掉上清液。

(4)参照Preomics公司iST 96X试剂盒优化后的步骤进行操作。步骤(3)中加入 50μl LYSE试剂溶解蛋白质沉淀，涡旋混匀后95℃，1000rpm加热10min。

(5)将步骤(4)加热的样品冷却至室温，加入50μl配制好的DIGEST，37℃，500rpm酶解2h。

(6)步骤(5)酶解结束后加入100μl STOP溶液，室温500rpm震荡1min终止酶解反应。

(7)使用试剂盒配置的ADAPTER，将CARTRIDGE安装在1.5离心管上并做好标记，将步骤(6)酶解液瞬时离心后转移至连接好的CARTRIDGE中，3800g离心1min。

(8)步骤(7)中分别加入200μl WASH 0，WASH 1和WASH 2，依次3800g离心1min，弃去废液。

(9)使用ADAPTER将CARTRIDGE安装在新的1.5ml离心管中，加入100μl ELUTE，3800g离心1min，洗脱肽段，重复操作一次并将两次的洗脱液合并。

(10)取步骤(9)收集的洗脱液置于旋转真空干燥仪中真空抽干，得到抽干的肽段样品置于-80℃保存。

4.辅助诊断或监测胃癌的52个蛋白的发现

4.1 DDA谱图库的建立

(1)将56个真空抽干的肽段样品分别用0.1％(v/v)甲酸水溶液复溶，用Nanodrop仪器测量肽段浓度。

(2)完成步骤(1)后，将56个样品的稀释液取等量混合，制备用于分级的混合样本。

(3)完成步骤(2)后，取所述混合样本，通过安捷伦高效液相(HPLC)进行分级，得到66个洗脱馏分，最后合并为18个馏分，置于旋转真空干燥仪中真空抽干后重溶于20μl0.1％(v/v)甲酸水中。然后对分级的l8个馏分、用于质量控制的HeLa标准品、及56 个独立样本分别加入iRT(Biognosys)进行保留时间的统一。

对18个分级样品进行数据依赖性采集(DDA)模式的质谱鉴定。DDA模式质谱鉴定的方法为：将5μl样本通过Thermo EASY-nLC 1200液相系统分离，流动相由0.1％甲酸水溶液(A)和含0.1％甲酸的80％乙腈溶液(B)组成，流速为0.35μL/min，洗脱时间为120min，使用的梯度洗脱条件具体如下(％均为体积百分比)：0–2min,2-8％ B；2– 25min,8–9％B；25–70min,9–20％B；70–90min,20–25％B；90–110min,25– 32％B，110–113min,32–40％B，113–116min,40–95％B，116–120min,95％ B。洗脱下的肽段用Orbitrap Q Exactive HF质谱仪进行分析，获得Raw文件。一级质谱的数据采集范围为350-1500m/z，分辨率为60,000。二级扫描的分辨率为15,000， HCD碰撞能量为27％。

之后将Raw文件通过Spectronaut 15(Biognosys)软件合并搜库分析，采用软件默认的参数建库。序列数据库采用UniProt Proteome人类蛋白质组数据库(2020/02)。设置Trypsin酶解。根据母离子和碎片离子的信息及其精确保留时间设定好需要鉴定样本的数据依赖采集(DIA)的可变窗口和质谱方法，对样本进行质谱鉴定。

4.2 DIA数据采集与分析

(1)DIA模式的质谱鉴定的方法为：在与DDA同样的液相系统参数条件下，设定60个可变窗口。一级质谱采集的扫描范围是350-1250m/z，分辨率为120,000。二级扫描的分辨率为30,000，HCD碰撞能量为27％。

(2)采用Spectronaut15软件默认参数进行DIA数据分析。基于分级样本的建库结果，将56个样品和质量控制样本Raw件的导入软件后进行蛋白的数据检索分析。根据iRT肽段，软件将根据iRT校准和梯度稳定性动态地确定理想的提取窗口。Spectronaut 进行自动校正，采用局部归一化策略进行数据归一化处理。小于1％ FDR的前3个肽段的峰面积的平均值用来进行蛋白group的定量。对软件导出的定量结果，剔除样本中缺失数据超过50％的蛋白质，随后再对剩余蛋白进行缺失值的填充，最后对填充后的定量数据进行Log2转化。

(3)两组间定量结果的统计分析采用双尾配对t检验计算p值。依据蛋白质定量水平，当差异倍数(FC)＞1.5或FC＜0.67，且经统计p值<0.05时，视为差异表达蛋白。

(4)通过对质控样本(QC)的蛋白质组学数据进行变异系数(CV)的计算、所有样本的蛋白质组数据进行PLS-DA分析，再对所有的术后下调差异蛋白进行Pubmed数据库文献查阅、Uniprot数据库对蛋白功能的查询、The human protein atalas(THPA)蛋白组织特异性查询、Kaplan-Meier Plotter数据库对蛋白预后信息查询，筛选潜在的生物标志物。最后对筛选得到的差异蛋白进行基因本论(GO)分析(生物过程、细胞成分、分子功能来源David数据库)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析(David数据库)。

4.3实验结果如下：

4.3.1胃癌患者手术前后的尿蛋白质组学变化

收集28例确诊的胃癌患者手术前后共56个尿液样品，在母离子和蛋白鉴定FDR<1％的条件下，共鉴定到蛋白数1221个蛋白质。

对样本中缺失值超过50％的蛋白质进行剔除，剩余蛋白质的缺失值进行填充后得到 1667个蛋白质。

将胃癌术前组设为对照组，对胃癌患者手术前后的总蛋白进行比较，筛选条件为双尾配对t检验结果p<0.05，FC＞1.5或＜0.67，共获得479个差异蛋白，其中术后下调的蛋白质有182个。

将筛选得到182个术后下调差异蛋白通过Pubmed、Uniprot、THPA和Kaplan-MeierPlotter数据库对蛋白信息进行汇总，根据蛋白的功能、预后信息、组织特异性和文献汇总共筛选出52个潜在的生物标志物。

52个差异蛋白的信息如表1所示，均为术后下调差异蛋白，且FC<0.67，P<0.05。其中超过半数的蛋白被报道直接或间接促进胃癌的发生发展或在胃癌体液标志物研究中高表达，但这些蛋白在胃癌尿液蛋白标志物研究中均无相关报道。

表1：52个蛋白在Pubmed相关研究报道以及胃癌患者手术前后尿液中的蛋白表达变化趋势、P-值和变化倍数。

表1

4.3.2 QC样本的质控分析

QC样本的变异系数(CV)用于评估资料中各观测值变异程度，即组内定量结果的重复性。本次实验过程中前后共有11个HeLa样本作为QC样，蛋白质组数据QC样本的平均 CV值为6.31％低于10％，说明本次实验仪器的检测系统稳定性较好，数据质量可靠。

4.3.3尿液样本PLS-DA模型分析结果

为了观察各个样本间的总体分布情况，基于所有样本(n＝56)定量到的总蛋白进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，来可视化胃癌手术前后之间的尿蛋白谱的差异。

分析结果见图1，结果表明，胃癌手术前后定量到的总尿蛋白可以明显得将两组区分，说明存在区分两组的蛋白，其中一组为：胃癌术前(GC_pre)；另一组为：胃癌术后7天(GC_post)。

4.3.4差异蛋白的功能注释和通路富集分析

利用David数据库对筛选的52个差异蛋白分别进行生物学过程、细胞成分和分子功能方面的功能注释。

p值<0.05的部分生物学过程如图2-A所示。结果表明，可以看出富集到最显著的且差异蛋白数最多的生物学过程是细胞粘附；还富集到细胞迁移、血管重塑、凋亡过程负调控、信号转导等与胃癌发生关系密切的过程。

p值<0.05的部分细胞成分如图2-B所示。结果表明，富集到最显著且差异蛋白数最多的细胞成分为细胞外泌体，P值为3.62E-20，远远超过其他所有细胞成分；还富集到细胞外空间、细胞外区域、质膜、受体复合物等。

p值<0.05的分子功能如图2-C所示。结果表明，富集到最显著的功能为钙粘蛋白结合，还有蛋白结合、生长因子结合、整合素结合、肝素结合、大分子复合物结合等。

通过David数据库对筛选的52个差异蛋白进行通路富集，结果如图2-D所示，最显著富集且差异蛋白数最多的通路为癌症通路，除此之外还涉及到多条与癌症相关的通路，如VEGF信号通路、PI3K-AKT信号通路、Ras信号通路等。