博舒替尼在抑制i-motif结构上的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及博舒替尼在抑制i-motif结构上的应用。

背景技术

i-motif结构是一种可在体内酸性条件下形成的DNA高级结构，其由DNA链上多个胞嘧啶(Cytosine,C)连结而成，通过半质子化胞嘧啶碱基对(C·C+)互相嵌入和交替排列形成。i-motif结构长度约20碱基对(bp)，结构通式为：5’-CCCNNNCCCNNNCCCNNNCCCNNN-3’(SEQ ID NO：1)，其中C代表碱基胞嘧啶，N代表任意碱基。在生物信息学的研究中，有超过60％的癌基因启动子上存在着可能形成的i-motif结构。

C-KIT是一种原癌基因编码的III型酪氨酸激酶受体(KIT)，在许多细胞中发挥着不可或缺的作用。该基因转录的失调可以导致疾病或者癌症。KIT的配体是干细胞生长因子(SCF)，SCF-KIT复合物的相互作用涉及到了细胞内的多种信号通路途径和细胞活动，例如细胞增殖，分化，凋亡等过程。

博舒替尼(Bosutinib/Bosulif)，化学式C

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出博舒替尼在抑制i-motif结构上的应用，本发明首次发现了博舒替尼能够在体内和体外环境中抑制i-motif结构的产生和对i-motif结构具有破坏效果，从而可以有效用于抑制原癌基因的表达或破坏原癌基因的表达，为i-motif结构相关疾病的治疗提供了新的思路。

本发明的第一个方面，提供博舒替尼在制备i-motif结构抑制剂中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述i-motif结构包括体内环境产生的i-motif结构和体外环境产生的i-motif结构。

在本发明中，发明人分别通过体外和体内试验验证了博舒替尼对体内环境产生的i-motif结构和体外环境产生的i-motif结构均具有抑制效果，均能够产生抑制i-motif结构的产生和对i-motif结构具有破坏效果的效果。

在本发明的一些实施方式中，所述环境为酸性环境。

在本发明的一些实施方式中，所述环境中的pH小于等于4。

在本发明中，发明人通过试验验证发现，对于C-KIT等原癌基因中的i-motif结构序列，其均在pH小于等于4的条件下才显示出能够转变为i-motif结构的能力。

在本发明的一些实施方式中，所述i-motif结构的原始序列存在于癌基因或正常基因中。

在本发明的一些实施方式中，所述i-motif结构的原始序列存在于癌基因中。

在本发明的一些实施方式中，所述i-motif结构的原始序列存在于癌基因的启动子上。

在本发明的一些实施方式中，所述癌基因包括C-KIT、C-MYC、VEGF、TERT、BCL-2、h-TeloC和Py33。

当然，本领域技术人员应当理解的是，所述癌基因还可以包括其他含有i-motif结构序列的癌基因，包括但不限于上述的C-KIT、C-MYC、VEGF、TERT、BCL-2、h-TeloC和Py33。

在本发明的一些实施方式中，所述癌基因为C-KIT、C-MYC、VEGF、TERT、BCL-2、h-TeloC和Py33。

在本发明的一些实施方式中，所述癌基因为C-KIT。

在本发明的一些实施方式中，所述i-motif结构的原始序列包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12和14所示的序列。

当然，本领域技术人员应当理解的是，所述i-motif结构的原始序列还可以包括其他满足i-motif结构序列特征的序列，包括但不限于上述的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12和14所示的序列，i-motif结构序列的结构通式为：5’-CCCNNNCCCNNNCCCNNNCCCNNN-3’(SEQ IDNO：1)，其中C代表碱基胞嘧啶，N代表任意碱基。60％的癌基因启动子上存在着可能形成的i-motif结构序列。

在本发明的一些实施方式中，所述i-motif结构抑制剂抑制i-motif结构的产生和/或破坏已有的i-motif结构。

在本发明中，发明人通过体外和体内试验验证了博舒替尼对体内环境产生的i-motif结构和体外环境产生的i-motif结构均具有抑制效果，均能够产生抑制i-motif结构的产生和对i-motif结构具有破坏效果的效果。

在本发明的一些实施方式中，所述博舒替尼的有效浓度大于等于0.5μM。

在本发明的一些实施方式中，所述博舒替尼的有效浓度大于等于3.0μM。

在本发明的一些实施方式中，所述博舒替尼的有效浓度为0.5～50μM。

在本发明中，发明人发现，50μM的浓度下的博舒替尼能够破坏任意癌基因的i-motif结构。

本发明的第二个方面，提供博舒替尼在制备癌细胞基因治疗试剂中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述癌细胞基因治疗试剂抑制或破坏原癌基因的表达。

本发明的有益效果是：

本发明首次发现了博舒替尼能够在体内和体外环境中抑制i-motif结构的产生和对i-motif结构具有破坏效果，从而可以有效用于抑制原癌基因的表达或破坏原癌基因的表达，为i-motif结构相关疾病的治疗提供了新的思路。

附图说明

图1为不同pH条件对C-KIT癌基因启动子上i-motif结构的形成的影响。

图2为不同pH条件下博舒替尼处理后的i-motif结构条带凝胶电泳图。

图3为博舒替尼与i-motif结构的相互作用对比图。

图4为50μM博舒替尼处理后的i-motif结构条带凝胶电泳图。

图5为不同癌基因中i-motif结构与博舒替尼的相互作用对比图，其中A～F分别为C-MYC、VEGF、TERT、BCL-2、h-TeloC和Py33基因。

图6为PGL3-basic空载质粒图谱。

图7为WT-C-KIT-P-Luc，质粒图谱。

图8为MuT-C-KIT-P-Luc质粒图谱。

图9为博舒替尼体内在细胞内对i-motif结构抑制作用。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

C-KIT癌基因启动子上i-motif结构的形成

圆二色谱法可以检测体外i-motif结构是否形成。i-motif结构在pH酸性条件下形成的CD吸收峰一般在约260nm处有一最高负峰，在约290nm处有一最高峰，因此，通过对比相关特征峰即可确定i-motif结构的形成与否。

具体检测步骤为：

配置200μL i-motif结构CD检测液，其中包含终浓度为10μM的C-KIT i-motif探针(具体序列组成为：C-KIT i-motif：5’-CCCTCCTCCCAGCGCCCTCCCT-3’(SEQ ID NO：2))和50mM的不同pH(pH分别为4、6和8)的Tris-醋酸盐缓冲液，ddH

表1圆二色谱i-motif检测混合液体系

将孵育后的含有高级结构的CD检测液(200μL)置于CD检测石英比色皿中，将其置于CD检测口中(确保每次检测时石英比色皿方向不变)，调整波长为220nm-360nm，带宽1.0nm，反应时间0.5s，扫描速度为100nm/min，重复扫描3次取平均值。

结果如图1所示。

可以发现，仅在pH 4的条件下，其可以形成i-motif结构，但在其他pH条件下的峰形显示没有形成i-motif结构。该结果与i-motif结构特性的理论分析一致，i-motif结构中的两个半质子化的胞嘧啶碱基对互相嵌入和交替排列形成i-motif结构，因此，仅在酸性条件下，尤其是pH 4或更低的条件下，才会有利于形成i-motif结构。

进一步使用电泳迁移率检测进行验证，具体步骤为：配置20μL i-motif结构博舒替尼结合电泳迁移率检测液，其中包含终浓度为5μM的C-KIT i-motif探针(SEQ ID NO：2)、50mM的pH为4的Tris-醋酸盐缓冲液、以及2μL 10×EMSA上样缓冲液。其中，C-KIT i-motif探针经过退火处理(使C-KIT i-motif探针(序列)形成高级结构的步骤，参考上述实施例)且使用5-FAM标签进行标记。将该检测液在12％非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，冰上以100V分离1.5h。使用等量的DMSO(二甲基亚砜)替代博舒替尼以作为阴性对照组。DMSO可以破坏i-motif结构。

结果如图2所示。

从图2中，同样可以发现在pH 4条件下具有明显的i-motif结构条带出现，而其他不同的pH下相应的i-motif结构条带较弱。因此证明C-KIT癌基因启动子上可以形成i-motif结构。

博舒替尼与i-motif结构的相互作用

配置200μL i-motif结构博舒替尼结合CD检测液，其中包含终浓度为10μM的C-KITi-motif探针(SEQ ID NO：2)、50mM的pH为4的Tris-醋酸盐缓冲液以及终浓度为50μM博舒替尼。同时，使用C-KIT i-motif结构突变序列(C-KIT i-motif MT：5’-CACTCCTCACAGCGCACTCACT-3’(SEQ ID NO：3))以替换上述体系中的C-KIT i-motif探针作为对照组。按照上述实施例中的方法进行CD检测。

结果如图3所示。

可以发现，在固定缓冲液pH值为4的条件下，在i-motif结构突变组(使用C-KIT i-motif结构突变序列的对照组)中，290nm处的吸收峰出现了降低和偏移，这一结果标志着突变组中没有形成i-motif结构。而在博舒替尼处理组中，其与i-motif结构突变组一致，在相对波长下的峰值也出现了明显的降低说明在博舒替尼处理组中也没有i-motif结构的存在，结合上述实施例中的结果，可以有效证明博舒替尼可以抑制产生或者破坏i-motif结构。

进一步使用电泳迁移率检测进行验证，具体步骤为：配置20μL i-motif结构博舒替尼结合电泳迁移率检测液，其中包含终浓度为5μM的C-KIT i-motif探针(SEQ ID NO：2)、50mM的pH为4的Tris-醋酸盐缓冲液、终浓度为50μM博舒替尼以及2μL 10×EMSA上样缓冲液(如表2所示)。其中，C-KIT i-motif探针经过退火处理(使C-KIT i-motif探针(序列)形成高级结构的步骤，参考上述实施例)且使用5-FAM标签进行标记。将该检测液在12％非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，冰上以100V分离1.5h。使用等量的DMSO(二甲基亚砜)替代博舒替尼以作为阴性对照组。DMSO可以破坏i-motif结构。

表2 i-motif结构上样体系

其中，C-KIT i-motif探针的退火处理体系如表3所示。

表3 5’-FAM i-motif结构退火体系

反应程序为：95℃退火10min后，置于95℃热水中常温下冷却至室温(至少4h)。

其中，所使用的聚丙烯酰胺凝胶按照表4配制，待等其凝固约40min后，装槽倒入1×TBE缓冲液，液面高度需没过胶板，小心轻轻拔去梳子，用针筒吸取槽内的缓冲液并冲向上样孔内，重复3次，将孔内的废弃胶的残留冲洗干净。

表4 EMSA电泳PAGE胶配方

准备上样前，往孵育好的i-motif结构上样体系内加入2μL 10×EMSA LoadingBuffer轻轻吹打混匀。上样完毕后，冰上电泳100V 1.5h。电泳完毕，于Chemidoc TouchImages凝胶成像系统拍照。

结果如图4所示。

可以发现，对比阴性对照组，使用50μM博舒替尼处理后的i-motif结构条带同样出现了变少，这一结果与CD检测的结果相吻合，证明了博舒替尼可以破坏已经形成的i-motif结构。

博舒替尼对其他癌基因上已知的i-motif结构抑制效果

在上述实施例已经验证了在癌基因C-KIT启动子上存在i-motif结构，且药物博舒替尼可以抑制该i-motif结构的基础上，为了证明博舒替尼抑制i-motif结构的普适性，发明人进一步选择了6个已知癌基因上的i-motif结构进行重复验证。

其中，在本实施例中，所选的6个已知癌基因及其i-motif结构序列如表5所示。

表5不同癌基因i-motif探针及其对应的高级结构

其中，i-motif探针和突变序列均由擎科生物(北京)按照表5所示序列合成。

实验方法参考上述实施例，以对应的突变序列作为对照组，进行圆二色谱检测。

结果如图5所示。

在本领域中，上述表1中的i-motif结构序列已被充分证明了其是对应于C-MYC、VEGF、TERT、BCL-2、h-TeloC和Py33基因中的可形成i-motif结构的序列。通过对比对照组，可以发现上述6种来自于其他癌基因的i-motif结构序列，均会被50μM浓度的博舒替尼所破坏。因此，可以证实博舒替尼对i-motif结构普遍具有抑制或者破坏作用。

博舒替尼在细胞内对i-motif结构抑制作用的研究

在上述实施例充分确定了体外条件下博舒替尼具有抑制i-motif结构的作用后，发明人进一步研究其在体内条件下的抑制效果。

本领域公知，在C-KIT癌基因启动子上游序列中存在i-motif结构，为了研究该序列对启动子的活性效果，发明人合成C-KIT癌基因启动子序列(+84bp至-995bp范围，共约1081bp的序列)并将其构建到PGL-3荧光载体(PGL3-basic空载质粒图谱如图6所示)上，转化到DH5-α感受态细胞，从而得到了含有C-KIT i-motif结构序列的重组质粒载体(WT-C-KIT-P-Luc，质粒图谱如图7所示)。

其中，C-KIT启动子序列来自PubMed数据库，编号为NG_007456.1。具体序列为：

其中，加粗且标有下划线的部分为C-KIT启动子基因中可形成i-motif结构的序列部分。

同时，根据SEQ ID NO：16所示序列，将可形成i-motif结构的序列部分替换为SEQID NO：3所示的突变序列，按照同样的方法构建得到重组质粒(MuT-C-KIT-P-Luc质粒图谱如图8所示)。

提取WT-C-KIT-P-Luc和MuT-C-KIT-P-Luc，将其转染至293T细胞内，并加入梯度浓度的博舒替尼，转染48小时后，裂解细胞，对裂解产物进行荧光素酶活性强度检测。以加入等量DMSO替代博舒替尼的组作为对照组(阴性对照)。

具体方法为：

使用FuGENE HD Transfection Reagent(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)作为转染试剂，当然，本领域技术人员也可以选择其他常规的转染试剂。具体使用操作参考使用说明书，以24孔板为例，需要约1μg质粒样品(WT-C-KIT-P-Luc或MuT-C-KIT-P-Luc)以及1μL转染试剂进行转染。

在本实施例中，具体步骤如下：

在24孔板中接种约70％细胞密度的293T细胞(人肾上皮细胞，购自中国科学院细胞库，使用的培养基为含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基)，静置3h，待其贴壁后进行转染实验。进行转染实验前，将转染试剂以及无血清培养基放置于37℃培养箱中预热。将1μg上述重组质粒、1μL预热的转染试剂和不同浓度的博舒替尼在1.5mL的EP管中配置转染混合液，然后加入无血清培养基至50μL(体系如表6所示)，静置15分钟。然后向在24孔培养板的细胞培养孔中加入50μL/孔的转染混合液，于培养箱中继续培养48h，得到实验组293T细胞。DMSO对照组的操作同本方法，区别在于使用等量DMSO替代博舒替尼。

表6转染混合液体系

其中，荧光素酶活性强度检测采用双荧光素酶报告基因试剂盒(购自上海翌圣生物)进行，使用方法参考使用说明书。

具体步骤为：

在转染48h后，吸尽细胞培养液，在24孔板中加入200μL细胞裂解液裂解细胞，在4℃冰箱中孵育10min，使其充分裂解细胞。12000rpm离心1min，取上清液。

取20μL细胞裂解液加入到96孔板中，设计3个孔的重复。同时按照上述分组布置实验组孔、对照组孔和背景组孔。其中实验组所转染的质粒是经过博舒替尼处理的，对照组为加入等量的DMSO处理的，背景组为未经过转染的293T细胞。

按照试剂盒的说明，配置萤火虫荧光素酶工作液(F液)以及海肾荧光素酶工作液(R液)。将萤火虫萤光素酶底物(50×)和海肾萤光素酶底物(50×)分别用对应的缓冲液稀释至1×工作液。室温孵育。在上述每个孔中加入100μL F液，摇晃混匀，使用酶标仪检测发光强度，并记录数值。然后向上述的每个孔中加入100μL R液，摇晃混匀，再次使用酶标仪检测发光强度，并记录数值。按下述公式表达倍数比值。

其中F代表加入萤火虫荧光素酶工作液后检测的数值，R代表加入海肾荧光素酶工作液后检测的数值。

结果如图9所示。

可以发现，加入梯度浓度的博舒替尼后，随着博舒替尼的浓度升高，在浓度达到2.0μM时，WT-C-KIT-P-Luc实验组的荧光素酶活性强度开始出现降低，而浓度达到3.0μM时，对比DMSO对照组出现了显著性的差异。而对于转染了MuT-C-KIT-P-Luc的实验组，随着博舒替尼浓度升高，荧光素酶的活性强度并没有显著的变化。上述结果说明了博舒替尼同样可以在体内抑制i-motif结构。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。