SMN1基因荧光定量检测引物和探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及SMN1基因荧光定量检测引物和探针及试剂盒。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是儿童最常见的神经肌肉病，SMA患者的典型表现是肌无力、肌张力低、肌萎缩，正常站立、行走等运动功能受限等，运动发育显著落后于正常儿童，甚至无法完成如咀嚼、吞咽、呼吸等一些维持生命活动的最基本动作，但智力发育一般正常。SMA患者起病年龄差异大，主要表现为以四肢近端为主的进行性肌无力和肌萎缩，随着疾病进展，可出现呼吸、消化、骨骼等多系统受累。根据起病年龄、运动里程碑及病情进展程度，SMA可分为五型。SMA在新生儿中发病率为1/6000-1/10000，常规人群中，约每40-50人就有1个是SMA致病基因携带者。

随着SMA相关疾病修正药物的出现上市，并进入医保，早筛查、早发现、早用药治疗，成为SMA患儿及其家属的希望，早期的筛查诊断成为SMA关键有效的防控措施，包括针对正常备孕人群、早孕人群进行的携带者筛查和刚出生的新生儿进行的新生儿疾病筛查。

SMA患者的主要致病基因是运动神经元存活基因(survival motor neuron，SMN)。SMN基因位于5号染色体长臂1区3带(5q13)上，具有9个外显子(外显子1,2a，2b，3-8),全长约27kb，编码294个氨基酸的RNA结合蛋白SMN。存在2个高度同源拷贝SMN1和SMN2，端粒侧称SMN[T]或SMN1，着丝粒侧称SMN[C]或SMN2。两者仅在各自的3’端有5个碱基的差别(c.835-44，c.840，INS7+100，INS7+215，c.*239)，其中2个碱基位于外显子7、8，另3个碱基在内含子6、7中。其中，在外显子7的c.840C>T突变最为关键，导致SMN2的外显子剪接增强器功能受到抑制和SMN2外显子7跳跃。第8号外显子中的碱基变化对功能没有明显影响。

自从SMN基因发现以来，SMA的诊断流程发生了改变，可通过DNA分析检测SMN基因突变，从而诊断疾病。一旦发现SMN基因突变，则无需再做其他检查，即可确诊为SMA。SMA患者中，约95％为SMN1基因第7和第8外显子纯合缺失或第7外显子纯合缺失所致，5％为SMN1杂合缺失、点突变或SMN1基因转化为SMN2基因所致。

常用的SMN1基因拷贝数检测方法包括聚合酶链反应(PCR)限制性内切酶方法、Taqman荧光定量法、多重连接探针扩增检测(MLPA)、高通量测序技术、数字PCR以及熔解曲线检测等方法。聚合酶链反应(PCR)限制性内切酶方法只能检测SMN1缺失型患者，不能检测携带者。MLPA和数字PCR、高通量测序技术可以精确检测SMN1和SMN2拷贝数，但是对样本要求高、操作复杂、仪器和试剂成本高，不适合大规模人群得携带者筛查和新生儿筛查。

传统Taqman荧光定量法和熔解曲线检测方法，采用Taqman探针分别针对SMN1基因和内参基因进行扩增检测，操作简单，成本低，对于SMN1基因纯合缺失的患者样本检测效果较好，但是SMN1基因和内参基因使用不同的引物扩增体系，扩增效率的差异会干扰结果分析，特别是对于拷贝数为1的携带者检测，由于拷贝数减少引起的扩增曲线Ct值差异较少，单拷贝缺失的携带者和正常样本区分度不高，容易出现假阳性和假阴性结果，实际操作过程中往往需要对检测样本纯化的DNA进行定量，加入等量DNA模板，尽量降低扩增效率差异。

另外上述常见检测方法都是基于抗凝血样本纯化基因组进行检测，不适合进行新生儿干血斑样本检测和正常人群唾液样本，因此难以应用于新生儿疾病筛查和正常人群唾液无创采样携带者筛查。

发明内容

本发明的目的是提供SMN1基因荧光定量检测引物和探针及试剂盒。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供SMN1基因荧光定量检测引物和探针，包括用于扩增SMN1基因外显子7的上游引物SMN1-F1和下游引物SMN1-R1，以及与所述引物配套使用的三条探针SMN1-P1、SMN1-P2和SMN2-P。

引物SMN1-F1和SMN1-R1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

探针SMN1-P1、SMN1-P2和SMN2-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-5所示。其中，探针SMN1-P1、SMN1-P2的5′端分别带有不同的荧光基团，3′端带有荧光淬灭基团。例如，探针SMN1-P1的5'端为FAM，3'端为MGB，探针SMN1-P2的5'端为HEX，3'端为MGB。

具体地，针对扩增的同源区域，设计Taqman探针，扩增的区域内，选择SMN1与参考序列有差异的序列，分别设计Taqman-MGB探针，SMN1-P1和SMN1-P2在同一同源区域进行竞争结合，SMN1-P1与SMN1序列100％匹配，与SMN1模板结合，SMN1-P2与参考区域序列100％匹配，与参考区域序列结合。

探针SMN2-P为封闭探针，针对SMN1/2基因IVS7+100位点设计，与SMN2基因的IVS7+100位点完全匹配，在差异位点IVS7+100位点进行锁核酸修饰，优先结合SMN2基因，提高Tm值差异，提升封闭效果，3'端进行C3 Spacer修饰处理，防止探针作为引物进行扩增。

探针由上海生工进行合成与修饰。探针干粉使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA pH 8.0)进行溶解，使用超微量分光光度计定量至20μM。

第二方面，本发明提供含有所述引物和探针的检测试剂或试剂盒。

第三方面，本发明提供SMN1基因荧光定量检测试剂，所述检测试剂包含所述的引物和探针，还包含PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTP、dUTP、UDG酶等中的至少一种。

在本发明的一个具体实施方式中，所述检测试剂的组成如下：5×PCR缓冲液5.0μL、5U/μL Hot-Taq酶0.3μL、10mM dNTP 0.4μL、100mM dUTP 0.04μL、2U/μL UDG酶0.06μL、20μM引物SMN1-F1 0.6μL、20μM引物SMN1-R1 0.6μL、20μM探针SMN1-P1 0.25μL、20μM探针SMN1-P2 0.25μL、20μM探针SMN2-P 0.1μL和去离子水0.9μL。

第四方面，本发明提供SMN1基因荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的检测试剂，还包括前处理液。

所述前处理液为：Chelex-100质量百分比3-6％、NP-40体积百分比0.1-0.45％、PVP质量百分比0.05-0.3％和10-40mM NaOH，以水配制。

优选地，所述前处理液为：Chelex-100质量百分比5％、NP-40体积百分比0.25％、PVP质量百分比0.2％和20mM NaOH，以水配制。

第五方面，本发明提供所述检测试剂或所述检测试剂盒在SMN基因拷贝数分析中的应用。

第六方面，本发明提供一种用于检测SMN基因拷贝数的荧光定量PCR(qPCR)检测方法，包括以下步骤：

(1)样本前处理：取待测样本(待测样本为3μL全血、唾液或3mm干血斑)，加入100μL前处理液，95℃孵育10min，然后5000rpm离心3min，收集上清液，即为样本模板溶液。

(2)配制反应体系：将2μL样本模板溶液与8.5μL基因检测液(即SMN1基因荧光定量检测试剂)混合，加入去离子水至25μL，离心去除气泡，即为样本检测反应体系。

(3)qPCR检测：采用荧光定量PCR仪对上述检测反应体系进行PCR扩增和熔解曲线分析。

PCR扩增程序：

50℃2min；

95℃10min；

95℃20s，58℃60s(收集各个荧光基团的荧光信号)，50个循环。

(4)结果分析：

采用ΔCt值法相对定量分析方法，计算待测样本的ΔCt＝(待测样本SMN1 Ct-待测样本内参Ct)，通过单拷贝和双拷贝缺失的对照样本，确定ΔCt值范围。

正常对照FAM与HEX均出现扩增信号，且ΔCt(正常对照样本SMN1 Ct-正常对照样本内参Ct)<0.5。

阴性对照FAM与HEX均无扩增信号。

待测样本HEX出现扩增信号，且Ct<35检测数据合格，Ct超过35说明检测浓度过低。计算待测样本的ΔCt＝(待测样本SMN1 Ct-待测样本内参Ct)，

待测样本ΔCt<0.5，SMN1拷贝数为2及以上；

待测样本2.8<ΔCt<3.5，SMN1拷贝数为1；

待测样本15<ΔCt，SMN1拷贝数为0。

第七方面，本发明提供所述引物及探针在制备试剂盒中的应用。

所述试剂盒的功能为如下(a)～(c)任一项：

(a)检测SMN1基因突变；

(b)筛查脊髓性肌萎缩症患者；

(c)筛查脊髓性肌萎缩症携带者。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的试剂盒可以从微量样本快速检测SMN1基因双拷贝缺失、单拷贝携带。本发明提供的试剂盒，采用同源区域竞争性扩增，排除扩增效率差异，提高检测特异性。现有的基因检测试剂需要较多血样并纯化基因组DNA，不适合于新生儿干血斑筛查。本发明提供的试剂盒，直接对微量样本(3μl血液或3mm干血斑)进行前处理，处理液直接进行后续扩增检测，无需进行基因组DNA纯化等繁琐步骤，节约了成本和时间，适合新生儿干血斑筛查检测。本发明提供的试剂盒可以针对唾液(10μl)微量样本进行SMN1基因携带者检测，适合正常人群、备孕人群进行携带者筛查，有效进行SMA的三级防控。具体优点如下：

(一)单管PCR扩增反应，检测成本低，通量高，操作便捷，耗时短(2.5小时完成检测)。

(二)实现微量干血斑直接检测，有利于进行新生儿筛查。

(三)实现微量唾液样本直接检测，有利于通过无创形式进行大规模人群的SMN1基因携带者筛查。

(四)采用同源基因竞争性扩增联合Taqman探针比对分析，与传统Taqman探针法相比，通过提高阳性结果区分度增加检测特异性。

附图说明

图1为本发明SMN1基因外显子7区域扩增原理示意图。

图2为本发明较佳实施例中正常样本(SMN1拷贝数为2)、SMN1携带者样本(SMN1拷贝数为1)以及SMA患者样本(SMN1拷贝数为0)检测效果。

图3为本发明较佳实施例中实验组检测唾液样本。

图4为本发明中对照组检测唾液样本。

图5为本发明较佳实施例中使用阻滞引物和封闭探针的实验组，SMA患者样本(SMN1拷贝数为0)检测效果。

图6为本发明较佳实施例中仅使用阻滞引物不使用封闭探针，SMA患者样本(SMN1拷贝数为0)检测效果。

图7为本发明较佳实施例中使用普通引物扩增，SMA患者样本(SMN1拷贝数为0)检测效果。

图8为本发明较佳实施例中SMN2外显子7常见不同拷贝数对SMN1外显子7拷贝数检测的干扰。

具体实施方式

本发明旨在提供一种检测脊髓性肌萎缩症致病基因SMN1的引物探针组以及试剂盒。本发明提供的试剂盒克服了现有技术不足和缺陷，采用基因组同源序列竞争性扩增联合Taqman探针分析，SMN1不同拷贝数的样本区分度明显提高，提高SMN1单拷贝检测的特异性和准确性，实现干血斑、唾液微量样本检测，具有操作便捷、特异性和灵敏度高、成本低的优势，适合大规模人群新生儿疾病筛查和携带者筛查。

本发明提供的检测试剂盒的工作原理如图1所示。

为了解决SMN1基因和内参基因扩增效率不一致的问题，采用同源基因竞争扩增对比分析方法，在SMN1基因外显子7区域附近选择目标区域，进行全基因组比对，筛选SMN1的同源区域作为参考区域，设计上下游引物同时可以扩增SMN1和同源参考区域，下游扩增引物利用根据SMN1基因和SMN2基因的差异位点INS7+100(SMN1为INS7+100A，SMN2为INS7+100G)设计阻滞引物，并设计封闭探针(封闭探针覆盖INS7+100位点和引物3'端位置，封闭探针与SMN2基因INS7+100G完全匹配，并在INS7+100G碱基采用锁苷酸修饰，确保封闭探针优先与SMN2基因结合，避免SMN2基因干扰)，确保扩增SMN1靶区，防止扩增SMN2基因靶区，排除SMN2基因的干扰。

针对选定的同源区域内部差异位点分别设计Taqman探针，通过曲线Ct反映模板拷贝数数量，通过SMN1区域和参考区域的扩增曲线Ct值差异的变化，判断SMN1的拷贝数的变化，实现SMN1不同拷贝数的检测(0，1，2)。正常样本，SMN1和内参区域都是2个拷贝，因此SMN1和内参区域的Taqman探针检测曲线Ct一致，对于SMN1双拷贝缺失的患者，只出现内参区域的扩增曲线，SMN1无扩增曲线。对于SMN1单拷贝的携带者，SMN1和内参区域的拷贝数比值由正常样本的2:2变成1:2，拷贝数比例改变，造成SMN1的扩增曲线Ct值与内参区域扩增曲线发生差异，因为扩增引物相同，而扩增体系不变的情况下，SMN1和同源区域是竞争性扩增，这种差异相对于传统的Taqman扩增更大，因为SMN1基因和内参扩增不同的区域，SMN1携带者只是SMN1扩增曲线Ct值增大，内参扩增曲线Ct值不变。而本发明选择竞争性扩增，SMN1和参考区域使用同一对引物，当SMN1基因拷贝数降低，造成SMN1基因扩增曲线Ct增大，同时会导致参考区域的扩增曲线Ct值变小(因为拷贝数比例增加，会占用更多引物，提高扩增效率)，从而SMN1基因与参考区域的Ct值差异相对于传统的Taqman扩增更大，从而有效提高检测特异性和准确性，避免假阳性和假阴性。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 SMN1基因检测试剂盒的制备及使用方法

一、引物及探针的设计、筛选和制备

选择SMN1基因外显子7区域到IVS7+100位点的之间序列，在全基因组上其他区域进行同源区检索，结果发现除SMN2基因之外，存在一个同源区域。SMN1基因IVS7+21—IVS7+126之间的序列，染色体位置为Chr5:70951950-70952192；基因组上的同源序列位于Chr9:20332239-20332475，作为SMN1参考序列。根据同源序列比对信息，设计上下游扩增引物，上游引物SMN1-F1选择100％同源的序列，在5’端添加ccgc外部碱基序列，增加引物Tm值提高扩增效率。下游引物SMN1-R1,针对SMN1基因IVS7+100设计阻滞引物，引物3’端倒数第4个碱基将野生型T变成g,对应SMN1基因IVS7+98位点，同时在5’端增加cgc外部序列增加Tm值，SMN1-R1与SMN2在3’端有两个位点不能结合，从而避免非特异扩增。

引物由上海生工(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行合成。引物干粉使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA pH8.0)进行溶解，使用超微量分光光度计定量至20μM。

引物的相关信息以及核苷酸序列：

上游引物序列(5’→3’)SMN1-F1：ccgcAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAA(SEQ ID NO:1)；

下游引物序列(5’→3’)SMN1-R1：cgcTGTTTTACATTAACCTTTCAACTgTTT(SEQ ID NO:2)。

二、探针的制备

针对扩增的同源区域，设计Taqman探针，扩增的区域内，选择SMN1与参考序列有差异的序列，分别设计Taqman-MGB探针，SMN1-P1和SMN1-P2在同一同源区域进行竞争结合，SMN1-P1与SMN1序列100％匹配，与SMN1模板结合，SMN1-P2与参考区域序列100％匹配，与参考区域序列结合。

探针SMN2-P为封闭探针，针对SMN1/2基因IVS7+100位点设计，与SMN2基因的IVS7+100位点完全匹配，在差异位点IVS7+100位点进行锁核酸修饰，优先结合SMN2基因，提高Tm值差异，提升封闭效果，3'端进行C3 Spacer修饰处理，防止探针作为引物进行扩增。

探针由上海生工进行合成与修饰。探针干粉使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA pH 8.0)进行溶解，使用超微量分光光度计定量至20μM。

探针的相关信息以及核苷酸序列见表1(SEQ ID NO:3-5)。

表1探针的相关信息以及核苷酸序列

三、SMN1基因检测试剂盒的制备

SMN1基因检测试剂盒(100人份)由如下组件组成：12ml前处理液、860μl基因扩增检测液、标准对照、200μl阴性对照液。

前处理液：5％(质量百分比)Chelex-100、0.25％(体积百分比)NP-40，0.2％PVP(质量百分比)，20mM NaOH，余量为水。Chelex-100购自Biorad公司，NP-40、PVP和NaOH试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1人份(8.5μl)基因扩增检测液的组成见表2。

表2

标准对照：正常人干血斑(SMN1基因和SMN2基因均为野生型)。

阴性对照液：去离子水。

四、试剂盒的使用方法

1、前处理

取待测样本(待测样本为：3μl全血、唾液或者3mm干血斑)，加入100μl前处理液，95℃孵育10min，然后5000rpm离心3min，收集上清液，即为样本模板溶液。

取标准对照，加入100μl前处理液，95℃孵育10min，然后5000rpm离心3min，收集上清液，即为标准对照溶液。

2、制备检测反应体系

将2μl样本模板溶液与8.5μl基因检测液混合，加入去离子水至25μl，离心去除气泡，即为样本检测反应体系。

3、检测

采用荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司SLAN-96S)对上述检测反应体系进行PCR扩增和熔解曲线分析。

PCR扩增程序：

50℃2min；

95℃10min；

95℃20s，58℃60s(收集各个荧光基团的荧光信号)，50个循环。

4、结果分析：

采用ΔCt值法相对定量分析方法，计算待测样本的ΔCt＝(待测样本SMN1 Ct-待测样本内参Ct)，通过单拷贝和双拷贝缺失的对照样本，确定ΔCt值范围。

正常对照FAM与HEX均出现扩增信号，且ΔCt(正常对照样本SMN1 Ct-正常对照样本内参Ct)<0.5。

阴性对照FAM与HEX均无扩增信号。

待测样本HEX出现扩增信号，且Ct<35检测数据合格，Ct超过35说明检测浓度过低。计算待测样本的ΔCt＝(待测样本SMN1 Ct-待测样本内参Ct)，

待测样本ΔCt<0.5，SMN1拷贝数为2及以上；

待测样本2.8<ΔCt<3.5，SMN1拷贝数为1；

待测样本15<ΔCt，SMN1拷贝数为0。

实施例2临床样本检测

本实施例选择正常样本(SMN1拷贝数为2)、SMN1携带者样本(SMN1拷贝数为1)以及SMN1缺失、只有SMN2基因的临床样本(SMN1拷贝数为0)，将抗凝血液样本制作成干血斑样本。

扩增反应体系分为实验组和对照组，实验组按照实施例1中的基因突变检测液准备扩增体系，实验组采用实施例1制备的SMN1基因突变检测试剂对待测样本进行检测。

对照组采用传统Taqman探针检测，内参选择Actin，扩增SMN1和内参不同的区域进行对比。

SMN1基因扩增区域，针对SMN1基因c.840和INS7+100位点设计上下游引物SMN1-F2和SMN1-R2，设计Taqman-MGB探针：SMN1-P3。

Actin内参扩增区域，根据Actin序列设计上下游引物Actin-F，Actin-R，设计Taqman-MGB探针Actin-P。

引物及探针序列为：

引物SMN1-F2：5′-TTTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3′

引物SMN1-R2：5′-GATTGTTTTACATTAACCTTTCAACTTT-3′

探针SMN1-P3：5′-FAM-AAGAAGGAAGGTGCTCACAT-MGB-3′；

引物Actin-F：5′-AATGAGCTGCGTGTGGCT-3′

引物Actin-R：5′-CAACACTGTCTTAGACACCTAGTC-3′

探针Actin-P：5′-FAM-ACCCAGGTGAGTGGCCCGCTA-BHQ1-3′

对照组基因扩增检测液组成如表3所示。

表3

将2μl样本模板液分别与8.5μl实验组和对照组基因扩增检测液混合，加入去离子水至25μl，离心去除气泡，即为样本检测反应体系，实验组和对照组按照实施例1中的SMN1基因检测程序进行检测。

结果如图2所示，实验组和对照组能有效区分SMN1拷贝数为2样本(正常样本)、SMN1拷贝数为1样本(携带者样本)和SMN1拷贝数为0样本(患者样本)。但本发明的实验组方案对各种类型样本区分度更好。

在实验组中，采用阻滞引物和锁核酸修饰的封闭探针，对于SMN1外显子7缺失的样本，有效抑制SMN2非特异扩增，不出现扩增信号，正常人样本和携带者样本以及缺失样本ΔCt差异显著，区分度和特异性明显增强。

对照组检测体系中，正常样本和携带者样本，以及携带者样本和缺失样本ΔCt值差异小，特异性不强，区分度显著降低(表4)，容易导致非特异结果。

表4对照组和实验组检测对比

实施例3唾液样本SMN1基因检测

对正常人群进行携带者筛查，采取唾液样本进行无创采样更方便快捷。本实施例测试唾液样本SMN1基因检测，并验证样本对SMN1和内参扩增效率差异的影响。

选择正常人和SMN1单拷贝的携带者唾液样本(10μl)，扩增反应体系分为实验组和对照组，实验组采用实施例1制备的SMN1基因突变检测试剂对待测样本进行检测，对照组采用实施例2中对照组SMN1基因突变检测试剂。

SMN1正常样本(拷贝数2)和携带者(SMN1拷贝数1)唾液样本按照实施例1中进行样本处理，分别取样本处理液2μl、1μl、0.5μl作为检测模板，按照实施例1中的检测方法进行扩增检测。

结果见图3、图4，实验组和对照组对于微量唾液样本均能出现有效扩增信号，本发明的实施方案对于携带者检测区分度高。在使用不同浓度梯度的样本检测，实验组中，2μl、1μl、0.5μl样本浓度差异对SMN1和同源区域内参扩增的效率差没有影响(图3)。对照组中，样本浓度影响SMN1和内参扩增的效率差，不同浓度模板，SMN1和内参扩增效率出现明显差异(图4)。因此，本发明SMN1基因检测试剂盒，在针对大规模人群唾液样本直接检测SMN1基因，无需对样本进行定量和浓度调整，操作快捷，特异性提高。

实施例4 SMN2基因干扰测试

本实施例选用SMA患者干血斑样本，SMN1外显子7完全缺失，只有SMN2外显子7，在没有SMN1的情况下，SMN1的检测扩增信号反映SMN2非特异扩增的程度。

由于SMN1基因和SMN2基因高度同源，为了避免SMN2基因的干扰，根据SMN1基因和SMN2基因的差异位点INS7+100(SMN1为INS7+100A，SMN2为INS7+100G)设计阻滞引物，引物3'端与SMN1基因相差1个碱基，与SMN2基因相差2个碱基，并设计封闭探针，封闭探针覆盖INS7+100位点和引物3'端位置，封闭探针与SMN2基因INS7+100G完全匹配，并在INS7+100G碱基采用锁苷酸修饰，确保封闭探针优先与SMN2基因结合，避免SMN2基因干扰。

针对差异位点INS7+100设计下游引物，与原序列反向互补，反向引物R3在3'端倒数第3个碱基由野生型的T变成了C，目的是增加SMN1和SMN2的扩增差异，与SMN1存在一个碱基差异，与SMN2在3'端有两个碱基差异，分别倒数第4个碱基C和倒数第2个碱基T，因此可以极大降低SMN2的扩增效率，防止SMN2的干扰。对照引物为反向引物SMN1-R1b。反向引物SMN1-R1b只在位点INS7+100SMN1与SMN2存在差异。

SMN1-R1:5'-ccgTGTTTTACATTAACCTTTCAACTgTTT-3'

SMN1-R1b：5'-ccgTGTTTTACATTAACCTTTCAACTTTTT-3'

为对比设计的阻滞引物和封闭探针对SMN2基因抗干扰效果，设置3个组进行测试。

实验组：本发明实施例1配制SMN1基因检测反应液，其中扩增引物SMN1-R1，加入封闭探针SMN2-P；

对照组1：使用扩增引物SMN1-R1，不加入封闭探针SMN2-P，基因扩增检测液按表5配制；

对照组2：使用扩增引物SMN1-R1b,不加入封闭探针SMN2-P，基因扩增检测液按表6配制。

表5

表6

按照实施例1中的方法，对待检测样本SMN1双拷贝缺失样本(患者)进行处理，2μl样本模板溶液分别与实验组和对照组1、对照组2及基因扩增检测液混合，按照实施例1中的检测方法进行检测和分析。

表7结果可见，使用阻滞引物和封闭探针的实验组中，3个样本均无非特异扩增信号(图5)，对照组1中，仅使用阻滞引物不使用封闭探针，3个样本中有2个样本有较低扩增信号，在45个循环后出现(图6)。对照组2中，使用普通引物扩增，3个样本中均出现扩增信号，信号强度大于对照组1，扩增峰提前(图7)，由此可见，说明本发明方案中阻滞引物和封闭探针联合使用能有效排除SMN2非特异扩增。

表7

实施例5 SMN2基因干扰测试

本实施例采用SMN1拷贝数均为2、SMN2拷贝数分别为0、1、2和3的不同干血斑样本。

考察SMN2外显子7常见不同拷贝数对SMN1外显子7拷贝数检测的干扰，SMN1拷贝数为2、SMN2拷贝数分别为0、1、2和3的不同干血斑样本，按照实施例1中的突变检测液准备扩增体系，采用实施例1制备的SMN1基因突变检测试剂对待测样本进行检测。

结果见图8，SMN2外显子7常见不同拷贝数0、1、2、3拷贝，不影响SMN1外显子7拷贝数检测，ΔCt(检测样本SMN1 Ct-检测样本内参Ct)无显著差异，均小于0.5，表明本发明试剂盒对SMN2具有较好抗干扰能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。