与犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及与犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

家犬，简称犬或狗，是人类最亲密的朋友，一直在人类生活中扮演重要的角色，例如：警犬、导盲犬、伴侣犬、牧羊犬等等，这些忠诚的小伙伴在我们的生活与生产中发挥了重要的作用；在越来越多的家庭中，犬甚至被视为重要的家庭成员。

恐惧是一种情绪状态，是由任何可能产生危险的刺激引起的。恐惧会使动物产生一种以生存为目标的行为反应，然而，过度的恐惧是一种人类精神疾病，在犬中则被判定为行为问题，影响犬与人类之间的相处，并可能极大地损害它们的健康。例如，与不害怕的家犬相比，对陌生人表现出恐惧的犬寿命明显更短。此外，对陌生人的过度恐惧行为也会导致警犬、导盲犬无法执行任务从而被淘汰，这大大增加了繁育工作的成本。

另外，犬还存在攻击行为，适度的攻击行为是犬保护自身和家人的重要行为，但是过度的攻击行为有时会引起纠纷，甚至导致非常严重的社会问题。据估计，美国每年发生的犬咬人事件超过400万起。攻击行为给人与家犬的关系带来了严重的压力。家犬经常因为包括攻击行为在内的行为问题被送进收容所。不仅如此，对受害者的伤害可能导致主人承担重大的经济和法律负担。

目前，关于犬行为的研究已有不少报道，但现有技术中针对品种犬对陌生人的恐惧攻击行为主要通过行为测试或调查问卷方式获得家犬对陌生人的恐惧行为和攻击行为打分，从而判断该犬是否存在对陌生人的恐惧攻击行为、或此行为的高低强弱，更加缺乏犬对陌生人的恐惧行为和攻击行为的遗传机制研究，不能在分子层面有效鉴别犬对陌生人的恐惧行为和攻击行为的程度。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供与犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为相关的SNP分子标记及其应用，基于本发明的SNP分子标记可以在分子层面有效鉴别犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为的程度。

本发明提供了与犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为相关的SNP分子标记，包括第一分子标记和/或第二分子标记；所述第一分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，第170位为多态性位点，具有T/G多态性；所述第二分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，第240位为多态性位点，具有A/G多态性。

优选的，所述第一SNP标记的多态性位点位于犬第18号染色体第20310833位；

所述第二SNP标记的多态性位点位于犬第18号染色体第20331216位；

所述SNP分子标记基于家犬参考基因组canfam3.1。

本发明提供了一种鉴定上述方案所述的SNP分子标记的引物组，所述引物组包括第一分子标记引物组和第二分子标记引物组；

所述第一分子标记引物组包括第一上游引物和第一下游引物；所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述第二分子标记引物组包括第二上游引物和第二下游引物；所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了一种鉴定上述方案所述的SNP分子标记的试剂盒，包括上述方案所述的引物组。

本发明还提供了上述方案所述SNP分子标记作为检测靶标或者所述的引物组或者所述的试剂盒在鉴定犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为的程度或者选育对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为程度低或程度高的犬中的应用。

优选的，所述第一SNP分子标记的多态性位点基因为G的犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为的程度显著高于基因为T的犬；所述第二SNP分子标记的多态性位点基因为G的犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为的程度显著高于基因为A的犬。

优选的，所述犬包括大型犬、中型犬和小型犬。

优选的，所述犬包括大丹犬、比格犬、西施犬、法国斗牛犬、哈多利系博美犬、吉娃娃、迷你贵宾、约克夏、杰克罗素梗、腊肠犬、可卡犬、沙皮犬、挪威猎鹿犬、罗威纳、英国斗牛犬、史宾格、史奇派克犬、巴哥犬、威尔士柯基、哈威那犬、西伯利亚雪橇犬、边境牧羊犬、喜乐蒂牧羊犬、灵缇犬、纽芬兰犬、骑士查理王犬、威玛猎犬、贵宾犬、比利时坦比连犬、欧亚犬、英国塞特犬、金毛寻回犬、德国短毛指示犬、芬兰狐狸犬、拉布拉多寻回犬、波士顿梗、边境梗、不列塔尼猎犬、新思舍科诱鸭巡回犬、德国牧羊犬、拳击犬、獒犬、澳大利亚牧羊犬、杜宾犬、哥顿塞特犬、伯恩山犬和爱尔兰猎狼犬。

本发明还提供了一种鉴定犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为的程度或者选育对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为程度低或程度高的犬的方法，包括以下步骤：

检测待测犬基因中上述方案所述SNP分子标记在多态性位点处的基因；

当第一SNP分子标记的多态性位点的基因为G和/或所述第二SNP分子标记的多态性位点的基因为G时，判定犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为程度高；

或者，当第一SNP分子标记的多态性位点的基因为T且所述第二SNP分子标记的多态性位点的基因为A时，判定犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为程度低。

本发明还提供了上述方案所述SNP分子标记作为检测靶标在在兽医领域或犬繁育和训练中的应用。

本发明提供了与犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为相关的SNP分子标记，包括第一分子标记和/或第二分子标记；所述第一分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，第170位为多态性位点，具有T/G多态性；所述第二分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，第240位为多态性位点，具有A/G多态性；所述第一SNP分子标记的多态性位点基因为G的犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为的程度显著高于基因为T的犬；所述第二SNP分子标记的多态性位点基因为G的犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为的程度显著高于基因为A的犬。因此，本发明所述SNP分子标记能够用于鉴定犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为的程度或者选育对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为程度低或程度高的犬，为缩短犬种繁育的时间以及减少犬种行为判断成本。

附图说明

图1是犬对陌生人攻击行为的曼哈顿图，横坐标为染色体，纵坐标为软件计算出的位点与性状关联程度的-log(P)值，每一个点代表一个SNP位点，如果位点的-P值越小，那么-log(P)值越大，表明这个点与对陌生人攻击行为之间越显著关联；

图2是犬对陌生人攻击行为的QQ图，横坐标表示期望P值，纵坐标表示每个位点实际计算出的P值，位点位于标准线的上方，意味着计算结果可信度较高；

图3是犬对陌生人恐惧行为的曼哈顿图，横坐标为染色体，纵坐标为软件计算出的位点与性状关联程度的-log(P)值，每一个点代表一个SNP位点，如果位点的-P值越小，那么-log(P)值越大，表明这个点与对陌生人恐惧行为之间越显著关联；

图4是犬对陌生人恐惧行为的QQ图，横坐标表示期望P值，纵坐标表示每个位点实际计算出的P值，位点位于标准线的上方，意味着计算结果可信度较高。

图5是位点PCR胶图，其中，M：Marker(8000bp)，1：18:20310833，2：18:20331216。

具体实施方式

本发明提供了本发明提供了与犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为相关的SNP分子标记，包括第一分子标记和/或第二分子标记；所述第一分子标记的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，第170位为多态性位点，具有T/G多态性；所述第二分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，第240位为多态性位点，具有A/G多态性。

在本发明中，所述第一SNP标记的多态性位点位于犬第18号染色体第20310833位；所述第二SNP标记的多态性位点位于犬第18号染色体第20331216位；所述SNP分子标记基于家犬参考基因组canfam3.1。

在本发明中，所述第一SNP标记的多态性位点基因为G的个体的恐惧行为和/或分离焦虑行为的程度显著高于基因为A的个体；

所述第二SNP标记的多态性位点基因为T的个体的恐惧行为和/或分离焦虑行为的程度显著高于基因型为C的个体。

本发明提供了一种鉴定上述方案所述的SNP分子标记的引物组，所述引物组包括第一分子标记引物组和第二分子标记引物组；

所述第一分子标记引物组包括第一上游引物和第一下游引物；所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述第二分子标记引物组包括第二上游引物和第二下游引物；所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了一种鉴定上述方案所述的SNP分子标记的试剂盒，包括上述方案所述的引物组。

本发明还提供了上述方案所述SNP分子标记作为检测靶标或者所述的引物组或者所述的试剂盒在鉴定犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为的程度或者选育对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为程度低或程度高的犬中的应用。

在本发明中，所述犬优选的包括大型犬、中型犬和小型犬；更优选的包括大丹犬、比格犬、西施犬、法国斗牛犬、哈多利系博美犬、吉娃娃、迷你贵宾、约克夏、杰克罗素梗、腊肠犬、可卡犬、沙皮犬、挪威猎鹿犬、罗威纳、英国斗牛犬、史宾格、史奇派克犬、巴哥犬、威尔士柯基、哈威那犬、西伯利亚雪橇犬、边境牧羊犬、喜乐蒂牧羊犬、灵缇犬、纽芬兰犬、骑士查理王犬、威玛猎犬、贵宾犬、比利时坦比连犬、欧亚犬、英国塞特犬、金毛寻回犬、德国短毛指示犬、芬兰狐狸犬、拉布拉多寻回犬、波士顿梗、边境梗、不列塔尼猎犬、新思舍科诱鸭巡回犬、德国牧羊犬、拳击犬、獒犬、澳大利亚牧羊犬、杜宾犬、哥顿塞特犬、伯恩山犬和爱尔兰猎狼犬。

本发明还提供了一种鉴定犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为的程度或者选育对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为程度低或程度高的犬的方法，包括以下步骤：

检测待测犬基因中上述方案所述SNP分子标记在多态性位点处的基因；

当第一SNP分子标记的多态性位点的基因为G和/或所述第二SNP分子标记的多态性位点的基因为G时，判定犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为程度高；

或者，当第一SNP分子标记的多态性位点的基因为T且所述第二SNP分子标记的多态性位点的基因为A时，判定犬对陌生人的恐惧行为和/或攻击行为程度低。

本发明还提供了上述方案所述SNP分子标记作为检测靶标在在兽医领域或犬繁育和训练中的应用。

本发明中涉及的英文缩略语和关键术语定义如下：

GWAS-全基因组关联性分析；

SNP-Single Nucleotide Polymorphism/单核苷酸多态位点；

P值-当原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

本实施例使用了来自C-BARQ(Canine Behavioral Assessment&ResearchQuestionnaire)的行为数据(https://vetapps.vet.upenn.edu/cbarq/)。

C-BARQ是由宾夕法尼亚大学的研究人员开发出的一种对犬的行为进行调查问卷从而获得犬的行为数据的方法，C-BARQ不会直接观察和测量动物的行为，而是会将调查问卷发放给记犬的主人或饲养员，通过他们提供的间接行为信息为犬打分。这种调查问卷的好处是，由于主人或饲养员是与犬关系最为亲密的人类，问卷的结果更贴近实际情况。为了便于分析，C-BARQ将每只犬的行为得分计算为与该行为相关的问卷项目得分的平均值。品种平均值是基于单个犬得分的总和除以每个品种的个体数。

我们在此处将犬对陌生人的攻击行为和犬对陌生人的恐惧行为合并为犬对陌生人的恐惧攻击，即犬由于恐惧引起的攻击行为。C-BARQ将犬对陌生人的攻击行为定义为当陌生人(如快递员、外卖员等)接近或侵入犬或主人的个人空间、领土或家庭范围时犬产生的威胁或敌对反应如吠叫咆哮露出牙齿甚至猛扑猛咬等，若犬没有吠叫、咆哮等行为，则记为0分；若有吠叫、咆哮、露出牙齿等，则记为0～2分，若有猛咬、猛扑、撕咬、试图撕咬等行为，则记为3分以上。目前本实施例共涉及47个常见犬种，我们将有基因型数据的每个品种的个体数和犬种对陌生人的攻击C-BARQ行为打分如表1所示。

表1不同犬种对陌生人的攻击行为得分表

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C-BARQ将犬对陌生人的恐惧行为定义为当陌生人(外卖员或快递员)接近或侵入犬的个人空间、领土或家庭范围时犬表现出焦虑或恐惧的行为。轻度至中度程度的恐惧典型特征包括：避免目光接触，躲避害怕的物体，蹲下或蜷缩着，尾巴放低或夹在两腿之间，呜咽和哀嚎，僵住不动，颤抖。极度程度的恐惧特征是夸张的畏缩，试图从害怕的物体、人或情况中逃脱、退缩或隐藏。若犬没有以上行为，则记为0分；若有一定的上述行为，则记为0～2分；若有激烈的逃脱、退缩或隐藏则记为3分以上。目前本实施例共涉及47个常见犬种，将有基因型数据的每个品种的个体数和犬对陌生人的恐惧行为打分如表2所示。

表2不同犬种对陌生人的恐惧行为得分表

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C-BARQ对超过50,000只犬进行了调查问卷，随后计算品种平均值，品种平均值是基于单个犬得分的总和除以每个品种的个体数。由于犬经历了强烈的人工选择，同一犬种个体之间的遗传结构差距不大，且行为在个体间的差异也小于不同品种间的差异，因此，在这里我们使用的是犬种平均值数据与个体基因型数据的全基因组关联分析。

对2737个个体进行了全基因组关联性分析的流程如下。首先从NCBI中获得了Illumina173kCanineHDarray测序得到的犬180,117个SNPs，及4224个个体的基因型数据，该芯片是Illumina专门为犬量身设计的基因芯片，具有科学性。剔除没有表型数据的犬种，使用PLINK软件对个体进行主成分分析(PCA)，然后使用一般广义模型计算每个性状需要加入到协变量中的PCA结果；随后将性别和PCA结果作为协变量使用GEMMA软件计算所有个体间的亲缘关系形成亲缘矩阵；最后将协变量文件、亲缘矩阵以及包含个体信息的文件利用GEMMA软件的混合线性模型进行关联分析，在使用多重假设检验矫正后获得与对陌生人的攻击行为性状显著关联的位点。利用R对关联分析的结果进行可视化，全基因组关联性分析结果如图1,2,3,4所示。

随后将通过多重假设检验矫正(P<3.2254735E-7)后的位点进行注释，并使用ensembl(https://asia.ensembl.org/index.html)进行突变预测，获得了与对陌生人的恐惧攻击行为的程度均显著关联的2个SNP位点，位于基因GNAT3，CD36两个基因之间，位点信息如表3所示。

表3全基因组关联分析结果表

实施例2

在2个SNP附近设计2对引物，具体实施过程以及引物与PCR扩增产物DNA序列如下所示。

通过UCSC Genome Browser Home和National Center for BiotechnologyInformation数据库获取2个位点附近的序列；利用PrimerPremier5.0软件设计引物，并合成(表4)。

表4引物相关情况

使用QIAGEN(凯杰)有限公司提供的DNA提取试剂盒(货号：69504)对待测狗细胞进行DNA提取。

使用莫纳生物科技有限公司的试剂盒(货号：MP05501)进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)：1μLDNA模板，2μL上游引物，2μL下游引物，25μL MonAmp

表5扩增产物序列相关情况

注：表中加粗的碱基为目标SNP位点。

随后我们对57只品种犬，包括5只吉娃娃，10只金毛寻回犬，10只罗威纳，7只西伯利亚雪橇犬，2只纽芬兰犬，15只灵缇，8只腊肠犬中的部分犬进行了行为打分，打分如表6-7所示，并得到所有待测犬上述2个SNP的基因型后，总结至表8-9。

表6犬只品种及对陌生人的攻击行为打分表

表7犬只品种及对陌生人的恐惧行为打分表

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表8不同品种犬的基因型与对陌生人的攻击行为打分一览表

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表9不同品种犬的基因型与对陌生人的恐惧行为打分一览表

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通过以上研究可以发现，18:20310833T>G和18:20331216A>G可以评判犬的恐惧攻击行为，若犬在2个位点上都为突变型碱基(ALT)，则该犬的恐惧攻击行为较高，若为参考基因组的碱基(REF)，则恐惧攻击行为较低。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。