一种重组人分泌型DDRGK1-Fc及其应用
文献发布时间:2023-06-19 19:30:30
技术领域
本发明属于骨与关节疾病治疗领域,特别涉及一种重组人分泌型DDRGK1-Fc及其应用。
背景技术
目前对于骨相关疾病的治疗主要是予以药物或手术治疗,其中手术的创伤过大常导致骨折的延迟愈合以及不愈合,对于这种情况常缺乏有效的促进成骨方案。对于骨质疏松,往往仅能通过药物进行提升骨量的防治,目前没有有效的手术疗法。
DDRGK1由314个氮基酸组成,其中1-28为信号肽部分,决定DDRGK1在内质网定位或外分泌。研究发现:DDRGK1和UFL1主要定位于内质网,DRGK1和UFL1可作为Ufm1的底物,从而参与类泛素化修饰过程,在该过程中DDRGK1蛋白267位点的赖氨酸残基对于其与UFM1的结合至关重要(A Novel Type of E3 Ligase for the Ufm1 Conjugation System,2010)。在胰腺朗格汉斯细胞和其他分泌细胞中发现类泛素化相关蛋白包括UFM1,UFL1,DDRGK1和CDK5RAP3高表达,UFM1的内质网定位需要依赖于DDRGK1的结合,发现UFM1或DDRGK1的蛋白沉默可诱导胰腺B细胞内质网应激并促进细胞凋亡,因此UFM1-DDRGK1介导的类泛素化修饰参与调控内质网应激诱导的细胞凋亡(Ubiquitin fold modifier 1(UFM1)and itstarget UFBP1 protect pancreatic beta cells from ER stress-induced apoptosis,2011)。DDRGK1与IkBα直接结合,抑制其磷酸化及泛素化降解,从而增强IkBa稳定性,DDRGK1敲除可抑制NF-Kb信号通路(DDRGK1 regulates NF-kB activity by modulating IκBαstability,2013)。
Fc相当于IgG的CH2和CH3功能区,得名于其可结晶的化学特征(Fragmentcrystallizable),其无抗原结合活性,但具有固定补体、结合Fc受体等功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种重组人分泌型DDRGK1-Fc及其应用,本发明经过实验论证,合成重组人分泌型DDRGK1-Fc,具有较好的促成骨功能,并应用于制备治疗骨与关节相关疾病、促进软骨形成、促进椎间盘形成的药物,为骨与关节疾病的治疗打开了新的思路并取得了较为坚实的科学证据。
本发明提供一种重组人分泌型DDRGK1-Fc,所述DDRGK1-Fc包括切除1-28位点的从定位为细胞膜转变成分泌型的重组人分泌型DDRGK1,所述DDRGK1的N端连接HA,所述DDRGK1的C末端连接Fc片段。
优选地,所述HA的氨基酸序列:MKTIIALSYIFCLVFAGRA。
优选地,所述Fc片段氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
本发明还提供一种重组人分泌型DDRGK1-Fc在制备治疗骨与关节相关疾病的药物中的应用。
优选地,应用于制备治疗骨质疏松、骨折或骨缺损的药物。
本发明还提供一种重组人分泌型DDRGK1-Fc在制备促进软骨形成的药物中的应用。
本发明还提供一种重组人分泌型DDRGK1-Fc在制备促进椎间盘形成的药物中的应用。
本发明还提供一种包括上述的重组人分泌型DDRGK1-Fc的药物。
优选地,所述药物的剂型选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。
有益效果
本发明经过实验论证,合成重组人分泌型DDRGK1-Fc,具有较好的促成骨功能,并应用于制备治疗骨与关节相关疾病、促进软骨形成、促进椎间盘形成的药物,为骨与关节疾病的治疗打开了新的思路并取得了较为坚实的科学证据。
附图说明
图1为重组人分泌型DDRGK1-Fc的表达构建体示意图。
图2为改用HA信号肽的重组人分泌型DDRGK1和DDRGK1的表达构建体示意图以及蛋白胶图。
图3为重组人分泌型DDRGK1-Fc和改用HA信号肽的重组人分泌型DDRGK1蛋白纯化胶图。
图4中A为分泌型DDRGK1和重组人分泌型DDRGK1-Fc的体外成骨数据,B为小鼠胫骨缺损注射蛋白后7天的μCT分析图,其中1号框为分泌型DDRGK1蛋白组,2号框为重组人分泌型DDRGK1-Fc蛋白组,C为小鼠胫骨缺损注射蛋白后骨小梁数目(Tb.N)的统计分析图,D为小鼠胫骨缺损注射蛋白后骨体积分数(BV/TV)的统计分析图。
图5为分泌型DDRGK1蛋白、分泌型DDRGK1-Fc蛋白与细胞内DDRGK1蛋白的成骨效果比较,其中(A)为使用1%茜素红S溶液对细胞外基质钙沉积的观察,(B)为茜素红染色面积百分比指标。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)实验材料
1.1仪器:高速离心机(贝克曼Avanti JXN-26),哺乳细胞摇床(永联生物科技有限公司)AKTA PURE(GE)
1.2材料:人源DDRGK1基因(金唯智生物公司合成),Expi293F细胞(赛默飞世尔,A14527),pcDNA3.4-HHC质粒(实验室改造),分子排阻层析柱(GE,Superdex 200Increase10/300 GL),Ni Smart Beads 6FF(天地人和,SA036100),TEV蛋白酶(参考文献:Zhou F.,et al.,Crystal structure of a bacterial homolog to human lysosomaltransporter,spinster.Science Bulletin(2019),64(18),pp.1310-1317DOI:10.1016/j.scib.2019.08.010),SPINX离心过滤器(百赛),人骨髓间充质干细胞h-BMSC:(上海交通大学医学院附属第九人民医院上海市骨科内植物重点实验室),C57小鼠:(上海交通大学医学院附属第九人民医院上海市骨科内植物重点实验室)。
1.3试剂:293细胞培养基(永联生物科技有限公司,UP0050),转染试剂PEI MAX(Polyscience,24765),
(2)实验方法
①重组表达载体的构建和目的蛋白的表达
重组人分泌型DDRGK1-Fc:人源DDRGK1基因(NCBI参考序列:NM_023935.2)由金唯智生物公司经密码子优化后合成。如图1所示,PCR获得了编码删除第1-28位氨基酸残基的截短型人源DDRGK1 cDNA片段(对应蛋白序列AS AGQEPLHNEE LAGAGRVAQP GPLEPEEPRAGGRPRRRRDL GSRLQAQRRA QRVAWAEADE NEEEAVILAQ EEEGVEKPAE THLSGKIGAK KLRKLEEKQARKAQREAEEA EREERKRLES QREAEWKKEE ERLRLEEEQK EEEERKAREE QAQREHEEYL KLKEAFVVEEEGVGETMTEE QSQSFLTEFI NYIKQSKVVL LEDLASQVGL RTQDTINRIQ DLLAEGTITG VIDDRGKFIYITPEELAAVA NFIRQRGRVS IAELAQASNS LIAWGRESPA QAPA),该片段经AscI/NotI双酶切后克隆到实验室改造的pCDNA3.4质粒上,基因序列N端连接出膜信号肽HA(氨基酸序列为MKTIIALSYIFCLVFAGRA),C末端连接Fc片段(氨基酸序列:DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)(图1中TEV proteaserecognition site位于DDRGK1与Fc序列之间)。
改用HA信号肽的分泌型DDRGK1:人源DDRGK1基因(NCBI参考序列:NM_023935.2)由金唯智生物公司经密码子优化后合成。如图1所示,PCR获得了编码删除第1-28位氨基酸残基的截短型人源DDRGK1 cDNA片段(对应蛋白序列AS AGQEPLHNEE LAGAGRVAQP GPLEPEEPRAGGRPRRRRDL GSRLQAQRRA QRVAWAEADE NEEEAVILAQ EEEGVEKPAE THLSGKIGAK KLRKLEEKQARKAQREAEEA EREERKRLES QREAEWKKEE ERLRLEEEQK EEEERKAREE QAQREHEEYL KLKEAFVVEEEGVGETMTEE QSQSFLTEFI NYIKQSKVVL LEDLASQVGL RTQDTINRIQ DLLAEGTITG VIDDRGKFIYITPEELAAVA NFIRQRGRVS IAELAQASNS LIAWGRESPA QAPA),该片段经AscI/NotI双酶切后克隆到实验室改造的pCDNA3.4质粒上,基因序列N端连接出膜信号肽HA(氨基酸序列为MKTIIALSYIFCLVFAGRA),基因序列C端连接TEV protease recognition site和亲和纯化标签HHHHHHHH。(图2-4涉及的DDRGK1均指改用HA信号肽的分泌型DDRGK1)
图5中分泌型DDRGK1蛋白:人源DDRGK1基因(NCBI参考序列:NM_023935.2)由金唯智生物公司经密码子优化后合成。PCR获得了编码删除第1-28位氨基酸残基的截短型人源DDRGK1 cDNA片段(对应蛋白序列AS AGQEPLHNEE LAGAGRVAQP GPLEPEEPRA GGRPRRRRDLGSRLQAQRRA QRVAWAEADE NEEEAVILAQ EEEGVEKPAE THLSGKIGAK KLRKLEEKQA RKAQREAEEAEREERKRLES QREAEWKKEE ERLRLEEEQK EEEERKAREE QAQREHEEYL KLKEAFVVEE EGVGETMTEEQSQSFLTEFI NYIKQSKVVL LEDLASQVGL RTQDTINRIQ DLLAEGTITG VIDDRGKFIY ITPEELAAVANFIRQRGRVS IAELAQASNS LIAWGRESPA QAPA),该片段经AscI/NotI双酶切后克隆到实验室改造的pCDNA3.4质粒上,基因序列N端连接出膜信号肽MKTIIALSYIFCLVFA,C端连接TEV酶切位点ENLYFQG和纯化标签HHHHHHHH。
②蛋白纯化
Expi293F细胞于37℃,5% CO
将离心管中过夜酶切的样品重新装到空的纯化柱中,收集穿流液,再用1个柱体积的缓冲液缓慢洗纯化介质2次,最后收集全部穿流液。将所有酶切后的样品浓缩至1ml,样品经SPINX离心过滤器过滤样品,然后用分子排阻层析柱(Superdex 200Increase 10/300GL,GE Healthcare)进行进一步分离纯化,分子排阻层析柱预先装于AKTA PURE仪器上。缓冲液为20mM Hepes pH 8.0,150mM NaCl。经SDS-PAGE验证后,收集蛋白进行后续实验。
③成骨分化
细胞外的分泌型DDRGK1蛋白及分泌型DDRGK1-Fc蛋白溶于Hepes buffer(20mMHepes pH 8.0+150mM NaCl),工作浓度为600ng/ml。以人骨髓源充质干细胞为研究对象,5×10
以小鼠胚胎成骨细胞系3T3-E1为研究对象,5×10
小鼠胫骨前内侧约1mm处使用直径1mm钻头打出缺损,每两天局部注射一次蛋白,X蛋白及BMP2蛋白浓度均为15ng/ul,注射量为20ul,总共3次,术后7天取材并扫描μCT(B)对照组、重组人分泌型DDRGK1-Fc蛋白组(2号框)、失活重组人分泌型DDRGK1-Fc蛋白组、分泌型DDRGK1蛋白组(1号框)、失活分泌型DDRGK1蛋白组及BMP2蛋白组的μCT分析图。(C)骨小梁数目(Tb.N)的统计分析图。(D)骨体积分数(BV/TV)的统计分析图。*p<0.05,**p<0.005。结果如图4中B、C、D。
(3)实验结果
图2表明:分泌型DDRGK1改用了HA的信号肽(最左上面的3号框)后,ddrgk分泌增加(2号框)。
图3表明:分泌型DDRGK1(1号框)添加FC段(2号框)。
图4中A表明:分泌型DDRGK1蛋白具有促成骨功能(1号框),重组人分泌型DDRGK1-FC同样具备促成骨功能(2号框),同时重组人分泌型DDRGK1FC的成骨效果优于分泌型DDRGK1;图4中B,D表明:骨体积分数BV/TV%指标中,重组人分泌型DDRGK1 FC为0.1884±0.03831,而分泌型DDRGK1为0.1672±0.03095,重组人分泌型DDRGK1 FC促进效果超过分泌型DDRGK1 12.67%。而图4中B,C表明:骨小梁数目Tb N指标中,重组人分泌型DDRGK1 FC为5.786±0.8829,而分泌型DDRGK1为5.584±1.106,促进效果超过DDRGK1 3.6%。
图5中(A)表明:分泌型DDRGK1-Fc蛋白促成骨功能最强(1号框),分泌型DDRGK1蛋白促成骨功能次之(2号框),两者均强于细胞内DDRGK1蛋白即OE-DDRGK1组的成骨效果(3号框),(B)表明:O/E-DDRGK1,PBS组为44.07±6.629%,而O/E-C,DDRGK1蛋白组为69.00±2.234,分泌型DDRGK1蛋白促进成骨效果超过细胞内DDRGK1效果56.5%.,而O/E-C,DDRGK1-FC蛋白组为78.43±2.603,促成骨效果超过细胞内DDRGK1效果77.9%,超过分泌型DDRGK1效果13.7%。
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