心肌肥厚相关疾病的治疗药物及药物筛选系统和方法

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及心肌肥厚相关疾病的治疗药物及药物筛选系统和方法。尤其涉及花姜酮或其药学上可接受的盐、金鸡纳啶或其药学上可接受的盐、延胡索甲素或其药学上可接受的盐、弱金鸡纳碱或其药学上可接受的盐或其任意组合的治疗药物。

背景技术

研究显示了心肌肥厚本质上是心脏应对血液压力负荷所产生的一种适应性反应，通过肥厚性生长来增强心脏的功能和减少室壁张力及耗氧量。心肌肥厚是一种以心肌细胞肥大、细胞内蛋白合成增加以及肌小节高度排列为主要特点的原发性心脏病。根据心脏的功能状态，其通常可以分为生理性肥厚与病理性肥厚。生理性肥厚常见于大量运动或者怀孕状态，通过增大心肌细胞以获得充足的营养，这种肥厚往往是可逆转的，它具有正常的心脏组织结构且收缩功能正常或有相应的提升。然而，在长期慢性压力的刺激条件下，如高血压、心脏瓣膜疾病等，容易发生病理性的心肌肥厚，它通常伴随着心肌细胞的死亡、心脏功能障碍及纤维化的病理性重构过程。初期常表现为左室异常肥厚，室壁的增加，心室腔的缩小，但初期由于处于代偿阶段，临床表现并不明显，而易被人们忽视，但长期以往，随着病情进展可能发展为慢性心力衰竭和致死性心律失常，严重者可发生心源性猝死。因此心肌肥厚已成为了心血管疾病中一个强有力的危险因素。

由于心肌肥厚致病机制复杂，目前仍未研究十分透彻。且目前临床仍然缺乏针对心肌肥厚的有效治疗手段和特定药物，而多以缓解患者临床症状为主。临床常用β受体阻滞剂，如心安得、卡维地洛等；钙离子拮抗剂，如硫氮卓酮等；血管紧张素转化酶抑制剂，如卡托普利等。这些药物多用来改善心脏的收缩舒张功能，但往往不能起到根治心肌肥厚的作用。对于左室流出道严重狭窄，且用临床用药无法改善时，可以考虑手术治疗切除肥厚室间隔肌。心肌肥厚通常被认为是一种预后不良的指标，且与多种形式的心衰密切相关。无论是药物还是手术治疗，多数患者预后效果并不理想。因此开发防治心肌肥厚的新型药物及治疗方法已成为了心血管技术领域研究的一个重要研究方向。

研究公开了交感神经系统激活与心肌肥厚密切相关，儿茶酚胺类刺激因子已被证实可诱导心肌细胞肥大，其中去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)作为儿茶酚胺类体液循环的重要因子，可刺激心肌细胞发生肥大，包括新生乳鼠和成年鼠的心肌细胞，且这一作用可被α受体拮抗剂所抑制。心肌细胞主要分布有α1和β肾上腺素能受体，NE可以通过作用于这两种G蛋白偶联受体，进一步激活细胞内PLC、PKC、PKA和MAPK等信号通路，进而使得心肌细胞的结构基因比如myosin、actin、titin等异常表达，从而使心肌细胞内蛋白表达增多，心肌细胞发生肥大。

由于人类的心肌细胞难以在体外进行扩增，且临床病人组织样本来源稀少，另外鼠的原代心肌细胞一是因为提取方法上的限制，难以做到大规模大批量的生产，二是鼠的心肌细胞在其基因表达模式、电生理功能、细胞收缩功能等方面仍与人类的心肌细胞存在一定差异，难以完全模拟人类疾病的状态。鉴于以上原因，针对人类心肌细胞疾病模型的药物筛选一直难以展开。但随着人类iPSC诱导重编程技术以及胚胎干细胞体外中胚层定向分化技术的成熟，可建立更好的模拟人类心脏疾病的细胞模型以及能大量获得人类来源的心肌细胞，这为人类心血管疾病的研究与药物筛选提供了便捷的工具。

药物的研发以及后续的安全性评价是一个耗时长且花费巨大的过程，建立起高效率的筛选模型能大大降低研发成本以及缩短药物研发的周期。目前药物研发市场上大部分看似具有良好治疗前景的药物往往最后因为药物毒性问题而未能上市。而天然小分子化合物多从植物动物中提取，其毒性往往较低，若能发现具有较好治疗效果的天然小分子化合物，这对将来的临床治疗以及药物结构的改善和新药研发具有重大的意义。现有技术中，胚胎干细胞和iPSC细胞疾病模型的药物筛选更多的停留在理论基础阶段，难以付诸实践。而近几年，随着技术的突破，关于干细胞的高通量药物筛选逐渐成为了广大研究者关注的热点。

基于现有技术的现状，本发明通过人类胚胎干细胞体外诱导分化得到大量人源心肌细胞，继而在人源心肌细胞的基础上给予NE的刺激从而建立起针对心肌肥大细胞模型的高通量药物筛选体系，对天然小分子化合物库进行筛选，将发现的小分子化合物进一步在细胞功能方面及动物模型上验证其针对肥厚的效果，获得毒性小且疗效好的小分子化合物，能够服务于临床心肌肥厚的治疗。

发明内容

本发明目的是基于现有技术的现状，提供心肌肥厚相关疾病的治疗药物及药物筛选系统和方法。

具体的，本发明提供了新型的治疗心肌肥厚的天然小分子单体药物。尤其涉及花姜酮或其药学上可接受的盐、金鸡纳啶或其药学上可接受的盐、延胡索甲素或其药学上可接受的盐、弱金鸡纳碱或其药学上可接受的盐或其任意组合，及其在制备用于下述至少一种用途的药物中的应用：

(1)抑制心肌肥厚相关基因的表达；

(2)减缓心肌细胞钙瞬变频率和强度、延长Ca

(3)降低心肌细胞收缩力和收缩频率；

(4)缓解心肌细胞肥大程度；

(5)预防或治疗心肌肥厚相关疾病。

在本发明的一优选例中，所述心肌肥厚相关疾病选自机械性因素引起的心肌肥厚、神经体液内分泌性因素引起的心肌肥厚、遗传性因素引起的心肌肥厚(如肥厚性心肌病)、慢性心力衰竭、致死性心律失常和心源性猝死。

本发明提供了一种筛选预防或治疗心肌肥厚的候选药物的方法，所述方法包括步骤：

(a)以加入待筛选的测试物的培养体系作为实验组、以不加入测试化合物的培养体系作为空白对照组进行孵育，其中，所述的培养体系中含有培养的心肌细胞和NE类化合物；和

(b)检测实验组和空白对照组中心肌细胞的指标，所述指标选自下组：心肌细胞的平均面积大小、小面积心肌细胞比例、大面积心肌细胞比例或其组合；

其中，当实验组中的所述心肌细胞的指标心肌细胞的平均面积大小、大面积心肌细胞比例显著降低，而小面积心肌细胞比例显著升高时，则表明所述测试物为预防和/或治疗心肌肥厚的候选药物。

在另一优选例中，所述显著降低指在实验组中所述心肌细胞的指标(I1)的水平与空白实验组中所述心肌细胞的指标(I2)的水平之比(I1/I2)≤1/2，较佳地，≤1/3，更佳地，≤1/4。

在另一优选例中，所述方法在步骤(b)后还包括：

(c)测试所述测试物对心肌细胞跳动频率的影响，和/或对心肌细胞的心肌活力的影响，和/或对心肌细胞凋亡的影响，和/或对心肌细胞肥大相关基因的影响，和/或对心肌细胞收缩力的影响，和/或对心肌细胞钙处理活动的影响，和/或对心肌肥厚的预防和/或治疗作用。

在另一优选例中，所述NE类化合物选自：去甲肾上腺素、肾上腺素、苯丙肾上腺素、异丙肾上腺素或其组合；优选地，所述培养体系中，所述NE类化合物的浓度为5-50μM，优选为10-30μM，更优选为10-20μM。

在另一优选例中，所述心肌细胞为经G418筛选的纯度>98％的人类多能干细胞分化来源的心肌细胞。

在另一优选例中，所述心肌细胞为体外培养的细胞。

本发明还提供了一种用于筛选预防和/或治疗心肌肥厚的候选药物的筛选装置，所述装置包括：

细胞培养模块，所述细胞培养模块包括一个或多个培养单元，所述每个所述培养单元中设有2个以上培养室或孔，其分别用于容纳作为实验组的加入了待筛选的测试物的培养体系，和作为空白对照组的未加入测试化合物的培养体系，其中，所述的培养体系中含有培养的经G418筛选的心肌细胞以及NE类化合物；

数据采集模块，所述数据采集模块被配置为对各个培养室中的所述心肌细胞的指标进行数据采集；优选地，所述指标选自下组：心肌细胞的平均面积大小、小面积心肌细胞比例、大面积心肌细胞比例或其组合；

筛选分析模块，所述筛选分析模块被配置为对来自所述数据采集模块的心肌细胞的指标进行分析，获得待筛选的测试物是否是预防和/或治疗心肌肥厚的候选药物的分析结果；其中，当实验组中的所述心肌细胞的指标显著降低时，则表明所述测试物为预防和/或治疗心肌肥厚的候选药物；和

输出模块，所述输出模块输出筛选分析模块的分析结果。

在另一优选例中，所述显著降低指在实验组中所述心肌细胞的指标(I1)的水平与空白实验组中所述心肌细胞的指标(I2)的水平之比(I1/I2)≤1/2，较佳地，≤1/3，更佳地，≤1/4。

在另一优选例中，所述培养单元的数量为1-200个，较佳地4-100个，更佳地8-50个，最佳地10-20个。

在另一优选例中，n为≥48，较佳地≥96，更佳地≥384，如16-100000，48-10000，或96-5000。

在另一优选例中，所述的培养单元为多孔板，如1536孔板，384孔板，96孔板。

在另一优选例中，所述的检测细胞的培养室(或孔)的体积为5μl-5ml。

在另一优选例中，所述的筛选系统为高通量筛选系统。

在另一优选例中，所述的培养单元中设有空白对照组的培养室和实验组的培养室，其中，将加入待筛选的测试物的培养体系作为实验组，并将不加入测试化合物的培养体系作为空白对照组。(即除了加入或不加入待筛选的测试物之外，实验组和空白对照组的其他条件相同)。

在另一优选例中，在所述的培养单元中，设有m个不同的实验组，以测试m种不同的待筛选的测试物或测试物的组合，m为≥1的正整数(1-1600)。

本发明还提供了一种药物组合物或药盒，所述药物组合物或药盒含有选自下组的化合物或其药学上可接受的盐：花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱或其任意组合，以及任选的用于预防和/或治疗心肌肥厚的其它药物，优选地，所述其它药物选自下组：降压药，受体阻滞剂，钙离子拮抗剂，血管紧张素抑制剂，血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂。

本发明进一步提供了一种预防和/或治疗肥厚型心肌病的方法，包括：

(i)给需要的对象施用花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱或其任意组合、本发明第四方面所述的药物组合物或药盒。

在另一优选例中，所述的施用包括口服。

在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长类动物(如猴)。

本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种用于筛选预防和/或治疗心肌肥厚的药物的筛选体系和方法，使用该筛选体系和方法，可高通量的筛选预防和/或治疗心肌肥厚的药物。并且，本发明还意外的发现，该筛选体系筛出的药物还可用于(i)降低心肌细胞跳动频率；(ii)降低对心肌细胞毒性；(iii)降低心肌细胞凋亡；(iv)抑制NE诱导的心肌细胞肥大相关基因(比如ANP与BNP)的表达；(v)抑制NE对心肌细胞收缩力的促进作用；(vi)抑制NE对心肌细胞钙处理活动的促进作用。在此基础上完成本发明。

术语

除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本申请中引用的所有文献或文献部分包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、操作手册和论文，均通过引用方式整体并入本文。本文所用的章节标题仅用于组织文章的目的，而不应被解释为对所述主题的限制。

应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本发明主题作任何限制。在本申请中，除非另有具体说明，否则使用单数时也包括复数。必须注意，除非文中另有清楚的说明，否则在本说明书和权利要求书中所用的单数形式包括所指事物的复数形式。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，所用术语“包括”以及其它形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性，其可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”之义。

如本文所用，术语“G418”指Geneticin。

如本文所用，术语“CHIR99021”的结构式为:

如本文所用，术语“IWR-1”的结构式:

如本文所用，术语“RPMI1640”指RPMI1640培养基。示例性的RPMI1640培养基可以是

如本文所用，花姜酮(Zerumbone，Cas:471-05-6)的结构式为：

如本文所用，金鸡纳啶(Cinchonidine，Cas:485-71-2)的结构式为：

如本文所用，延胡索甲素[(+)-Coradaline,Cas:518-69-4]的结构式为：

如本文所用，弱金鸡纳碱(Cinchonine,Cas:118-10-5)的结构式为：

本文中，“药学上可接受的盐”包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。“药学上可接受的酸加成盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。这些盐可通过本专业已知的方法制备。“药学上可接受的碱加成盐”是指能够保持游离酸的生物有效性而无其它副作用的、与无机碱或有机碱所形成的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐及镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺类、仲胺类及叔胺类，被取代的胺类，包括天然的被取代胺类、环状胺类及碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。优选的有机碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱及咖啡因。这些盐可通过本专业已知的方法制备。

本文所述的“对象”或“个体”指哺乳动物，尤其是灵长类动物，更具体是人。

本文所用术语“预防”包括使病患减少疾病或病症的发生或恶化的可能性；该术语也包括：预防疾病或病症在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病或病症，但尚未被诊断为已患有该疾病或病症时。“治疗”和其它类似的同义词包括以下含义：(i)抑制疾病或病症，即遏制其发展；(ii)缓解疾病或病症，即，使该疾病或病症的状态消退；或者(iii)减轻该疾病或病症所造成的症状。

本文所用术语“有效量”、“治疗有效量”、“给药量”、“药学有效量”是指服用后足以在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一个或多个症状的至少一种药剂或化合物的量。其结果可以为迹象、症状或病因的消减和/或缓解，或生物系统的任何其它所需变化。例如，用于治疗的“有效量”是在临床上提供显著的病症缓解效果所需的包含本文公开的所述化合物或其药学上可接受的盐的组合物的量。可根据对象的年龄、性别、所患疾病及其严重程度等因素确定给药量。可使用诸如剂量递增试验的技术测定适合于任意个体病例中的有效量。

本文所用术语“服用”、“施用”、“给药”等是指能够将化合物或组合物递送到进行生物作用的所需位点的方法。本领域周知的给药方法均可用于本发明。这些方法包括但不限于口服途径、经十二指肠途径、胃肠外注射(包括肺内、鼻内、鞘内、静脉内、皮下、腹膜内、肌内、动脉内注射或输注)、局部给药和经直肠给药。

本文中，“联用”、“药物联用”、“联合用药”或“联合治疗”等是指通过混合或组合不止一种活性成分而获得的药物治疗，其包括活性成分的固定和不固定组合，或者指两种或两种以上不同的治疗手段的组合。

本文中，心肌肥厚是一种以心肌细胞肥大、细胞内蛋白合成增加以及肌小节高度排列为主要特点的原发性心脏病。根据心脏的功能状态，其通常可以分为生理性肥厚与病理性肥厚。生理性肥厚常见于大量运动或者怀孕状态，通过增大心肌细胞以获得充足的营养，这种肥厚往往是可逆转的，它具有正常的心脏组织结构且收缩功能正常或有相应的提升。然而，在长期慢性压力的刺激条件下，如高血压、心脏瓣膜疾病等，容易发生病理性的心肌肥厚，它通常伴随着心肌细胞的死亡、心脏功能障碍及纤维化的病理性重构过程。初期常表现为左室异常肥厚，室壁的增加，心室腔的缩小，但初期由于处于代偿阶段，临床表现并不明显，而易被人们忽视，但长期以往，随着病情进展可能发展为慢性心力衰竭和致死性心律失常，严重者可发生心源性猝死。本文所述的心肌肥厚相关疾病包括但不限于机械性因素引起的心肌肥厚、神经体液内分泌性因素引起的心肌肥厚、遗传性因素引起的心肌肥厚(如肥厚性心肌病)、慢性心力衰竭、致死性心律失常和心源性猝死。

本发明的筛选体系、筛选方法及筛选装置

本发明首次开发一种用于筛选预防和/或治疗心肌肥厚的药物的筛选体系，包括：一培养体系以及存在于所述培养体系中的以下组分：(a)经G418筛选的心肌细胞；(b)NE类化合物；(c)待筛选的测试物；其中，当所述心肌细胞的指标降低时，则表明所述的测试物为预防和/或治疗心肌肥厚的药物；其中，所述指标选自下组：细胞的平均面积大小、小面积细胞比例、大面积细胞比例或其组合。

本发明的筛选体系可高通量的筛选预防和/或治疗心肌肥厚相关疾病的候选药物。在一些实施方案中，采用本发明的筛选体系筛选到花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素和弱金鸡纳碱等可作为预防或治疗心肌肥厚相关疾病的化合物。

本文所述的筛选体系中，所述心肌细胞可由如下方法制备：

(a)在合适的培养条件下，培养并分化胚胎干细胞系，从而获得心肌细胞；和

(b)在G418的存在下培养步骤(1)获得的心肌细胞，从而获得经G418筛选的心肌细胞。

优选地，所述步骤(a)中，所述培养条件包括培养基和添加物，所述培养基可包括RPMI1640与B27-insulin，所述添加物包括CHIR99021与IWR-1。

优选地，所述步骤(a)中，所述培养时间为5-30天，较佳为6-28天，更佳为8-25天。

优选地，所述胚胎干细胞系包括人胚胎干细胞系。更优选地，所述胚胎干细胞系选自下组：MYL2Neo/w-H7细胞系。

优选地，所述步骤(b)中，培养时间为3-8天，优选为4-6天。

在一些优选的实施方案中，所述经G418筛选的心肌细胞表达MLC2v蛋白与肌钙蛋白T。

优选地，所述经G418筛选的心肌细胞的纯度≥95％，优选≥98％。

在优选的实施方案中，所述NE类化合物选自：去甲肾上腺素、肾上腺素、苯丙肾上腺素、异丙肾上腺素或其组合。优选地，所述培养体系中，所述NE类化合物的浓度为5-50μM，较佳为10-30μM，更佳为10-20μM。

本文筛选预防或治疗心肌肥厚相关疾病的候选药物的方法包括以下步骤：

(i)以加入待筛选的测试物的培养体系作为实验组、以不加入测试化合物的培养体系作为空白对照组进行孵育，其中，所述的培养体系中含有培养的经G418筛选的心肌细胞和NE类化合物；和

(ii)检测实验组和空白对照组中心肌细胞的指标，所述指标选自下组：心肌细胞的平均面积大小、小面积心肌细胞比例、大面积心肌细胞比例或其组合；小面积细胞是指在ImageJ软件中算得单个细胞面积在1000-4000μm2的心肌细胞，大面积细胞是指在ImageJ软件中算得单个细胞面积在4000-10000μm2的心肌细胞。

其中，当实验组中的所述心肌细胞的指标显著降低时，则表明所述测试物为预防和/或治疗心肌肥厚的候选药物。

优选地，所述显著降低指在实验组中所述心肌细胞的指标(I1)的水平与空白实验组中所述心肌细胞的指标(I2)的水平之比(I1/I2)≤1/2，较佳≤1/3，更佳≤1/4。

优选地，所述方法在步骤(ii)后还包括步骤(iii)：测试所述测试物对心肌细胞跳动频率的影响，和/或对心肌细胞的心肌活力的影响，和/或对心肌细胞凋亡的影响，和/或对心肌细胞肥大相关基因的影响，和/或对心肌细胞收缩力的影响，和/或对心肌细胞钙处理活动的影响，和/或对心肌肥厚的预防和/或治疗作用。优选地，具有下述生物学活性或生物学功能中的一种或多种的测试物作为候选药物：(i)降低心肌细胞跳动频率，(ii)降低对心肌细胞毒性；(iii)降低心肌细胞凋亡；(iv)抑制NE诱导的心肌细胞肥大相关基因的表达；(v)抑制NE对心肌细胞收缩力的促进作用；(vi)抑制NE对心肌细胞钙处理活动的促进作用；(vii)抑制心肌肥厚。

优选地，所述含待筛选的测试物的培养体系为本文所述的筛选系统，所述空白对照组为不含有待筛选的测试物的本文所述的筛选系统。

优选地，所述NE类化合物的作用时间为4-6天。

所述心肌细胞在DMEM加5％小牛血清条件下培养，于NE或NE和小分子天然产物共同作用4-6天结束后开始检测心肌细胞的平均面积大小、小面积心肌细胞比例、大面积心肌细胞比例、跳动频率、对心肌细胞毒性、心肌细胞凋亡、抑制NE诱导的心肌细胞肥大相关基因的表达、抑制NE对心肌细胞收缩力的促进作用、抑制NE对心肌细胞钙处理活动的促进作用。

本文用于筛选预防和/或治疗心肌肥厚的候选药物的筛选装置包括：

细胞培养模块，所述细胞培养模块包括一个或多个培养单元，所述每个所述培养单元中设有2个以上培养室或孔，其分别用于容纳作为实验组的加入了待筛选的测试物的培养体系，和作为空白对照组的未加入测试化合物的培养体系，其中，所述的培养体系中含有培养的经G418筛选的心肌细胞以及NE类化合物；

数据采集模块，所述数据采集模块被配置为对各个培养室中的所述心肌细胞的指标进行数据采集；优选地，所述指标选自下组：心肌细胞的平均面积大小、小面积心肌细胞比例、大面积心肌细胞比例或其组合；

筛选分析模块，所述筛选分析模块被配置为对来自所述数据采集模块的心肌细胞的指标进行分析，获得待筛选的测试物是否是预防和/或治疗心肌肥厚的候选药物的分析结果；其中，当实验组中的所述心肌细胞的指标显著降低时，则表明所述测试物为预防和/或治疗心肌肥厚的候选药物；和输出模块，所述输出模块输出筛选分析模块的分析结果。

优选地，所述所述显著降低指在实验组中所述心肌细胞的指标(I1)的水平与空白实验组中所述心肌细胞的指标(I2)的水平之比(I1/I2)≤1/2，较佳≤1/3，更佳≤1/4。

优选地，所述培养单元的数量为1-200个，较佳地4-100个，更佳地8-50个，最佳地10-20个。优选地，所述培养室或孔的数量为≥48，较佳地≥96，更佳地≥384，如16-100000，48-10000，或96-5000。优选地，所述的培养单元为多孔板，如1536孔板，384孔板，96孔板。优选地，所述的检测细胞的培养室(或孔)的体积为5μl-5ml。优选地，所述的筛选系统为高通量筛选系统。

在一些优选的实施方案中，所述培养单元中设有空白对照组的培养室和实验组的培养室，其中，将加入待筛选的测试物的培养体系作为实验组，并将不加入测试化合物的培养体系作为空白对照组。

制剂、组合物和试剂盒

本发明还提供了一种制剂或组合物，它们包括本文所述的花姜酮或其药学上可接受的盐、金鸡纳啶或其药学上可接受的盐、延胡索甲素或其药学上可接受的盐、弱金鸡纳碱或其药学上可接受的盐或其任意组合；以及任选的其它载体或赋形剂。

优选地，所述的组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物等。

以药物组合物为例，本发明的药物组合物包括药学上可接受的载体和治疗或预防有效量的花姜酮或其药学上可接受的盐、金鸡纳啶或其药学上可接受的盐、延胡索甲素或其药学上可接受的盐、弱金鸡纳碱或其药学上可接受的盐或其任意组合。该药物组合物中还可含有已知的其它治疗或预防心肌肥厚相关疾病的药物，这类药物包括但不限于：降压药，受体阻滞剂，钙离子拮抗剂，血管紧张素抑制剂，血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂。优选地，所述β受体阻滞剂包括心安得和卡维地洛等；所述钙离子拮抗剂包括硫氮卓酮；所述血管紧张素转化酶抑制剂包括卡托普利。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-100mg/kg动物体重(较佳地0.0001mg-10mg/kg动物体重，更佳地0.001mg-1mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明的试剂盒可含有选自下组的化合物或其药学上可接受的盐：花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱或其任意组合，以及任选的用于预防和/或治疗心肌肥厚的其它药物。优选地，所述其它药物选自下组：降压药，受体阻滞剂，钙离子拮抗剂，血管紧张素抑制剂，血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂。优选地，所述β受体阻滞剂包括心安得和卡维地洛等；所述钙离子拮抗剂包括硫氮卓酮；所述血管紧张素转化酶抑制剂包括卡托普利。在一些实施方案中，所述试剂盒含有本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒中，所述花姜酮或其药学上可接受的盐、金鸡纳啶或其药学上可接受的盐、延胡索甲素或其药学上可接受的盐、弱金鸡纳碱或其药学上可接受的盐或其任意组合独立包装，所述其它药物独立包装。试剂盒中还可包括直到患者服药的使用说明书。

本发明的药物组合物以及试剂盒中的各药物可被制成合适的剂型，包括但不限于片剂、锭剂和胶囊或适合肠胃外给药的剂型，如静脉输注剂或注射剂等。

方法和用途

本发明还提供治疗或预防心肌肥厚相关疾病的方法，所述方法包括给与需要的对象治疗有效量的花姜酮或其药学上可接受的盐、金鸡纳啶或其药学上可接受的盐、延胡索甲素或其药学上可接受的盐、弱金鸡纳碱或其药学上可接受的盐或其任意组合，以及任选的其它治疗或预防心肌肥厚相关疾病的已知药物。

虽然每个人的需求各不相同，本领域技术人员可确定药品制剂中每个部分的最佳剂量。一般情况下，对哺乳动物每天口服给药时，所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量可为约0.0025到30毫克/公斤体重。如果也施用一个已知的抗癌药物，其剂量应可有效地实现其预期的目的。这些已知的抗癌药物的最佳剂量是本领域技术人员所熟知的。

可通过任何途径给药以达到其预期目的。例如，可以通过肠外，皮下，静脉，肌肉，腹腔内，透皮，口腔，鞘内，颅内，鼻腔或外用途径给药。作为替代或并行地，可以通过口服给药。药的剂量将根据病人的年龄，健康与体重，并行治疗的种类，治疗的频率，以及所需治疗效益来决定。

还提供的是花姜酮或其药学上可接受的盐、金鸡纳啶或其药学上可接受的盐、延胡索甲素或其药学上可接受的盐、弱金鸡纳碱或其药学上可接受的盐或其任意组合，以及任选的其它治疗或预防心肌肥厚相关疾病的已知药物在制备用于下述至少一种用途的药物中的应用：(1)抑制心肌肥厚相关基因的表达；(2)减缓心肌细胞钙瞬变频率和强度、延长Ca

还提供的是用于下述至少一种用途的花姜酮或其药学上可接受的盐、金鸡纳啶或其药学上可接受的盐、延胡索甲素或其药学上可接受的盐、弱金鸡纳碱或其药学上可接受的盐或其任意组合：(1)抑制心肌肥厚相关基因的表达；(2)减缓心肌细胞钙瞬变频率和强度、延长Ca

本发明的主要优点包括：

1、本发明首次开发了一种用于筛选预防和/或治疗心肌肥厚的药物的筛选体系，使用该筛选体系，可高通量的筛选预防和/或治疗心肌肥厚的药物(比如，花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱等)。

2.本发明还意外的发现，本发明的筛选体系筛出的药物还可用于(i)降低心肌细胞跳动频率；(ii)降低对心肌细胞毒性；(iii)降低心肌细胞凋亡；(iv)抑制NE诱导的心肌细胞肥大相关基因(比如ANP与BNP)的表达；(v)抑制NE对心肌细胞收缩力的促进作用；(vi)抑制NE对心肌细胞钙处理活动的促进作用。

3.本发明首次找到了4个毒性较低的小分子(花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱)能抑制NE促进心肌细胞肥大的作用，其中我们实验发现上述4个天然产物小分子对高血压性心肌肥厚具有一定的改善作用，这对心肌肥厚新型药物治疗靶点及相关通路研究提供了新的方向。另外，本研究中的筛选方法对将来心肌肥厚的高通量药物筛选也具有重要的参考意义。

4.本发明利用NE能诱导心肌细胞肥大这一特点，在纯化的人类胚胎干细胞分化来源的高纯度人类心室肌细胞上，通过NE的处理建立起针对心肌细胞肥大的高通量药物筛选体系。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1：人胚胎干细胞系MYL2

图2：心肌细胞定向诱导分化示意图，MYL2Neo/w-H7人胚胎干细胞系心肌分化示意图。

图3：心室肌细胞G418筛选纯化效率流式检测结果，其中，A，流式鉴定经G418选择前后的hESC-CMs(30天)中MLC2v的表达，经G418筛选，MLC2v阳性细胞比例从78％增加到98％，B、流式检测MLC2v阳性CMs比率统计，选择G418后，MLC2v阳性CMs的百分比显著提高，****P<0.0001(双尾T检验，平均值±SEM)。

图4：高通量药物筛选流程示意图，其中显示，在G418选择后，将人胚胎干细胞来源的CMs(第30天)接种到384孔板中，每种化合物都经4复孔筛选，加入化合物处理3小时后，将NE添加到培养基中共同培养5天，后续通过高内涵成像系统拍摄免疫荧光染色图像并进行分析。

图5：心肌细胞药物处理后免疫荧光染色高内涵成像分析结果，其中，cTnT(绿色)代表CMs中特异性表达的肌钙蛋白着染；Cell Tracker(红色)代表细胞胞质染色；DAPI(蓝色)代表细胞核着染，所有图像均在10倍目镜下拍摄。对照组(DPBS)；NE组(20μM)；Pra/NE组(各20μM)。Pra：哌唑嗪。

图6：不同NE处理条件对心肌细胞大小的影响，其中显示，细胞平均面积介于1000μm

图7：筛选指标的分析确立，NE处理5天后CMs大小分析数值，其中，黄色阴影表示筛选指标(n>30个孔)。

图8：哌唑嗪可拮抗NE对心肌细胞大小的影响，A,哌唑嗪结构式.B,筛选指标参数统计，数值呈现为平均值±SEM.ns>0.05,无统计学差异****P<0.0001；双尾T检验。

图9：天然小分子化合物库的筛选，A,筛选示意图，B-D,经筛选得到的19个阳性小分子其平均面积大小、小/大面积细胞比统计图，所有化合物均在10μM浓度下进行筛选(n＝4，与NE组相比P<0.05)，蓝线表示对照组的基线，红线表示NE组的基线。数值展示为平均值±SEM。

图10：阳性小分子化合物对心肌细胞跳动频率的IC

图11：阳性小分子化合物处理后心肌细胞活力的检测结果，CellTiter-Glo检测4个化合物各自处理后心肌细胞活力变化(n＝4重复)，数值展示为平均值±SEM，三次独立重复试验。

图12：阳性小分子化合物处理后心肌细胞的凋亡检测结果，A,流式检测化合物处理后心肌细胞凋亡变化(花姜酮15μM、金鸡纳啶15μM、延胡索甲素15μM、弱金鸡纳碱5μM、NE20μM).心肌细胞收集后进行Annexin V-FITC和PI双染，数值展示为平均值±SEM，三次独立重复试验。*P<0.05,**P<0.01(双尾T检验).

图13：阳性小分子化合物处理后心肌细胞肥大相关基因mRNA的表达，RT-PCR检测心肌肥厚相关基因表达，化合物按以下浓度处理hESC-CMs 5天(花姜酮15μM、金鸡纳啶15μM、延胡索甲素15μM、弱金鸡纳碱5μM、NE 20μM、Pra 20μM)，所有表达值以β-actin的表达作为校准，数值展示为平均值±SEM，对照组处理等量的DMSO，ns>0.05,无统计学差异；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001(n＝3次独立重复试验,双尾T检验).

图14：阳性小分子化合物处理前后心肌细胞的收缩力检测结果，化合物处理24h后心肌细胞收缩力测量统计(花姜酮15μM、金鸡纳啶15μM、延胡索甲素15μM、弱金鸡纳碱5μM、NE 20μM、Pra 20μM)，每组n>50个细胞.ns>0.05,无统计学差异；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001(双尾T检验,平均值±SEM)。

图15：阳性小分子化合物处理后心肌细胞的钙瞬变检测结果，A,线扫模式下记录心肌细胞由药物处理后钙瞬变示例图(花姜酮15μM、金鸡纳啶15μM、延胡索甲素15μM、弱金鸡纳碱5μM、NE 20μM、Pra 20μM)，B,钙成像分析参数统计.数值以平均值±SEM呈现，3次独立重复试验(每次实验每组纪录20个细胞进行分析)，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001，双尾T检验。

图16：实验动物分组及给药处理，所有动物进行随机分组，WKY与SHR作为对照给予正常饮水及饲料喂养。

图17：大鼠饮食摄入量及体重记录，数值以平均值±SEM呈现。

图18：给药后大鼠尾动脉血压测量结果，化合物处理1个月后，利用CODA尾压测量系统以非入侵方式对大鼠血压(舒张压与收缩压)进行测量统计，数值以平均值±SEM呈现。****P<0.0001，双尾T检验。

图19：心超检测给药后大鼠心肌肥厚程度，A,心超M模式采集示例图，B,心超统计室间隔厚度(IVSd)、左室室壁厚度(LVPWd)及左室质量分数(LVMI)随时间变化，(WKY组:n＝8；SHR组:n＝8；Captopril组:n＝8；所有高剂量组:n＝8；所有低剂量组:n＝7)，数值以平均值±SEM呈现，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001，双尾T检验。

图20：给药后大鼠心脏取材结果分析，A,各组心脏外观图，B,给药3个月后，取材统计各组心脏与体重比值，ns>0.05,无统计学差异；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001(双尾T检验,平均值±SEM)。

图21：给药后大鼠心脏组织染色分析，A,大鼠心脏组织(高剂量组)切片马松染色，B,心脏组织切片(高剂量组)WGA染色，标尺，50μm，C,心脏切片WGA染色统计分析心肌细胞横截面面积(n>500)，****P<0.0001(双尾T检验,平均值±SEM)。

图22：给药后大鼠心脏组织肥厚相关基因mRNA的表达，qPCR检测心脏组织样本中肥厚相关基因表达(以18S表达作为校准)，所有展示处理组别均来自于高剂量组，数据以均值±SEM展示，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001(双尾T检验)。

图23：给药后血清中NE及NT-proBNP含量测定，A-B,ELISA检测给药三个月后大鼠血清中NE与NT-proBNP含量变化，*P<0.05,**P<0.01,****P<0.0001(双尾T检验,平均值±SEM)。

图24：花姜酮与金鸡纳啶可改善SHR心肌肥厚(治疗性给药)，A,花姜酮与金鸡纳啶给药模式示意图，14周龄(已有心血管病变)SHR口服预混饲料三个月，B,各组心脏取材外观图(上)；马松染色图(中)，以及心脏组织WGA染色图(下,标尺：100μm)，C,给药三个月后心脏体重比值，D,WGA染色心肌细胞横截面面积统计，E,qPCR检测心脏组织中肥厚相关基因表达(β-MHC，BNP和ANP)，以18S表达作为校准。F-H,心超分析室间隔厚度(IVSd)，左室室壁厚度(LVPWd)，左室质量分数(LVMI)，所有数据以均值±SEM展示；one-way ANOVA分析，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

图25：花姜酮与金鸡纳啶抑制肥厚型心肌病小鼠的心肌肥大，A,花姜酮与金鸡纳啶给药模式示意图。HCM小鼠模型选用cMyBP-C基因突变小鼠(6号外显子最后一个核苷酸，即790位由G突变为A)，B,各组心脏取材外观图(上)；马松染色图(中)，以及心脏组织WGA染色图(下,标尺：50μm)，C,WGA染色心肌细胞横截面面积统计，D,给药8个月后心脏体重比值，E-F,心超分析室间隔厚度(IVSd)，左室室壁厚度(LVPWd)变化，所有数据以均值±SEM展示；one-way ANOVA分析，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

图26：延胡索甲素抑制肥厚型心肌病小鼠的心肌肥大，A,各组心脏取材外观图(上)；马松染色图(下)，B,给药3个月后心脏体重比值，C,心超分析室间隔厚度(IVSd)，左室室壁厚度(LVPWd)变化，所有数据以均值±SEM展示；one-way ANOVA分析，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

具体实施方式

下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

1实验材料

1.1主要试剂

1.1.1常用化学试剂

1.1.2免疫荧光及组织化学染色试剂

/>

1.1.3相关抗体

1.1.4细胞培养及心肌分化试剂

/>

1.1.5其他主要试剂

/>

1.1.6实验动物

1.2主要实验耗材与仪器

/>

1.3主要溶液配制

1.3.1人胚胎干细胞培养相关试剂

(1)mTeSR培养基：

(2)Y-27632溶液(5mM):

分装后于-20℃保存，工作浓度1000×。

1.3.2体外诱导心肌定向分化及培养相关试剂

(1)RPMI-1640/B27 without insulin培养液：

(2)RPMI-1640/B27 with insulin培养液:

(3)CDM3培养液：

(4)CHIR-99021溶液(10mM)：

分装后于-20℃保存。

(5)IWR-1溶液(5mM)：

分装后于-20℃保存。

(6)胶原酶I(Collagenase I)溶液：

分装后于-20℃保存。

1.3.3免疫荧光染色相关试剂

(1)1×PBS磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)：

加ddH

(2)PBST缓冲液(0.1％Triton-X100)：1L PBS缓冲液中加入1ml Triton-X100，存放于4℃。

(3)16％多聚甲醛固定液(16％PFA)：加16g多聚甲醛于ddH

1.3.4钙瞬变染色相关试剂

(1)Cal-520AM溶液(5mM)：

分装后存于-20℃。

(2)Pluronic-F127溶液(2％)：

45℃加热30min，0.22μm滤器抽滤后，于4℃保存。

1.3.5相关化合物小分子溶液配比：

(1)去甲肾上腺素(Norepinephrine)溶液(1mM)：

分装后于-20℃保存。

(2)哌唑嗪(Prazosin)溶液(1mM)：

分装后于-20℃保存。

(3)花姜酮(Zerumbone)溶液(10mM)：

分装后于-20℃保存。

(4)金鸡纳啶((-)Cinchonidine)溶液(10mM)：

分装后存于-20℃保存。

(5)延胡索甲素(Corydaline)溶液(10mM)：

分装后存于-20℃保存。

(6)弱金鸡纳碱((+)-Cinchonine)溶液(100μM)：

分装后存于-20℃保存。

2方法

2.1人胚胎干细胞系MYL2

(1)制备Matrigel包被的六孔板：以DMEM/F12培液1:60稀释Matrigel，于六孔板中每孔分装1ml，4℃保存，用前先置于37℃培养箱中复温1h。

(2)细胞培养：将板中原有DMEM/F12培液弃去，每孔细胞加入2ml mTesR培养液及Y-27632(5μM)，接种细胞，细胞贴壁后，更换新的mTesR培液(不含Y-27632)，于37℃培养，每天换液。

(3)细胞传代：待细胞密度长至85％-95％时进行传代，弃去mTesR培液，每孔加入1ml Accutase进行消化，37℃孵育2min，弃去Accutase后，于37℃继续孵育2min，加入新的mTesR培液(含有Y-27632)将板底细胞重悬，均匀接种至新的包被好的六孔板中，于37℃培养。

2.2MYL2

(1)MYL2

(2)加入含8μM CHIR-99021的RPMI-1640/B27 without insulin培养液，作用48h。

(3)弃去原有培液，DPBS洗一遍，加入新的不含CHIR-99021的RPMI-1640/B27without insulin培养液，作用24h。

(4)弃去原有培液，加入含5μM的IWR-1的RPMI-1640/B27 without insulin培养液，作用48h。

(5)弃去原有培液，DPBS洗一遍，加入新的不含IWR-1的RPMI-1640/B27 withoutinsulin培养液，作用48h，每天换液。

(6)之后换成RPMI-1640/B27 with insulin培养液，每48h换一次液。

(7)分化至8-10d左右可于显微镜下看见自主搏动的心肌细胞，继续培养以进行后续实验。

2.3 G418筛选心室肌细胞及消化

(1)取分化至25d的心肌细胞，将培液换成含10％FBS的DMEM，培液中加入100μg/ml的G418，作用5d，隔天换液。

(2)弃去培液，DPBS洗一遍，加入Collagenase I于37℃消化30min左右，直至细胞团块从板底脱落。

(3)弃去Collagenase I，DPBS洗一遍，加入0.05％含EDTA的Trypsin(DPBS稀释)于37℃消化5-8min左右。

(4)使用移液枪轻轻吹打细胞，于镜下观察细胞消化直至较单一。

(5)加入含10％FBS的DMEM培液终止消化，500rpm×3min，收集细胞沉淀以用于后续实验。

2.4心室肌细胞纯化效果流式检测

(1)取同一批分化至25d的心肌细胞，加入G418筛选的作为实验组，未加入G418的作为对照组，按上述方法进行消化并收集细胞沉淀。

(2)1×BD P/WTM buffer(DPBS稀释)洗细胞2次，2000rpm×2min，弃上清。

(3)加入BD Fixation/Permeabilization solution，4℃固定30min。

(4)2000rpm×2min，弃上清，重复步骤(2)。

(5)用1×BD P/WTM buffer(DPBS稀释)600μl重悬细胞沉淀，等分为3份，每份200μl，分别为空白对照、二抗阴性对照和一抗阳性组。

(6)一抗阳性组的样本加入一抗4℃孵育1h。

(7)重复步骤(4)。

(8)1×BD P/WTM buffer(DPBS稀释)重悬细胞，二抗阴性对照组和一抗阳性组均加入二抗，37℃避光孵育30min。

(9)重复步骤(4)，加入300-500μl PBS重悬细胞沉淀，上机检测即可。

2.5高通量筛选体系建立

2.5.1细胞接种及药物处理

(1)按上述方法对G418筛选后的心肌细胞进行消化，并收集细胞沉淀，用含有5％FBS的DMEM培液重悬细胞。

(2)为去除较大的细胞团块，将上述细胞悬液使用细胞滤网(40μm)过滤。

(3)待细胞计数后，调整细胞悬液密度。

(4)待细胞悬液充分混匀后，使用Multidrop Combi自动分液器将细胞接种到384孔板，每孔加样体积为45μl，细胞数为1400个/孔。

(5)600rpm×1min，混匀384孔板，37℃培养。

(6)天然小分子化合物处理：所有天然小分子均溶于DMSO，原浓度为10mM，存储于96孔板(U型底)中，且96孔板外围一圈不加小分子。先用DMEM培液通过Multidrop Combi自动分液器将小分子化合物稀释至100μM，800rpm×5min，并用震荡仪充分混匀。每块药物板上同时设置空白对照孔和阴性对照孔(二者均含1％DMSO/DMEM)及阳性对照孔(含200μMPra/DMEM)。

(7)细胞接种24h后，使用Bravo自动化液体处理平台将稀释好的药物板加入接种好细胞的384孔板中，1个药物孔对应384孔板上4个孔，每个小分子均以4复孔形式筛选，加入药物体积为5μl。

(8)重复步骤(5)。

(9)3h后，使用Multidrop Combi自动分液器将NE(200μM/DMEM)加入384孔板中，每孔加样体积为5.6μl(空白对照孔则加入5.6μl DMEM培液)，384孔板外围两圈不设置药物处理。

(10)重复步骤(5)，37℃培养5d。

2.5.2细胞染色及筛选分析

(1)培养5d后，将384孔板取出，使用Elx405自动洗板机用1×PBS将384孔板洗3次(1×PBS预先于37℃水浴锅预热)，设置洗板机程序使洗完后每孔中残留PBS体积为24μl。

(2)使用DPBS缓冲液1:1000稀释CellTracker染料(10mM/DMSO)。

(3)使用Multidrop Combi自动分液器将稀释好的CellTracker染料加入384孔板中，每孔加样体积为24μl，即CellTracker终使用浓度为5μM。

(4)600rpm×1min，混匀384孔板，37℃孵育1h。

(5)使用Elx405自动洗板机用1×PBS将384孔板洗2次(1×PBS预先于37℃水浴锅预热)，每孔中残留PBS体积为24μl。

(6)使用Multidrop Combi自动分液器将16％PFA加入384孔板中，每孔加样体积为8μl，RT孵育30min。

(7)使用Elx405自动洗板机用PBST缓冲液(0.1％Triton-X100)将384孔板洗6次，最后板底残留体积为24μl，RT孵育20min。

(8)手动弃去PBST缓冲液，倒扣离心，800rpm×1min。

(9)使用Multidrop Combi自动分液器将鼠来源cTnT一抗(1:500稀释于含3％BSA的PBST缓冲液中)加入384孔板中，每孔加样体积为15μl，4℃孵育过夜。

(10)使用Elx405自动洗板机用PBST缓冲液将384孔板洗6次。

(11)重复步骤(8)。

(12)使用Multidrop Combi自动分液器将Alexa Fluor 488/山羊抗鼠IgG二抗和DAPI(二抗1:350、DAPI 1:1000二者共同稀释于含1％BSA的PBST缓冲液中)加入384孔板中，每孔加样体积为15μl，RT避光孵育1h。

(13)使用Elx405自动洗板机用PBST缓冲液将384孔板洗6次，设置洗板机程序使最后每孔中残留PBST体积为53μl。

(14)384孔板开盖800rpm离心5min。

(15)使用Operetta高通量细胞成像分析系统进行拍照采集，并分析细胞面积大小及相应数目。

2.6心肌细胞跳动频率采集

(1)取分化至30d的心肌细胞消化后按合适密度接种到35mm圆形的培养皿中(Matrigel包被)。

(2)接种后第二天换液，加入新鲜的含10％FBS的DMEM。

(3)接种后第四天加入先小分子药物作用3h，之后加入NE(20μM)。

(4)NE作用24h后，使用Leica IM50图像采集系统采集心肌细胞跳动视频，并进行统计分析。

2.7心肌细胞活力测定

(1)取分化至30d的心肌细胞消化后按5000个细胞/孔密度接种到96孔板中。

(2)接种后24h加入不同小分子及设定不同浓度作用5d，每个浓度设置3复孔。

(3)每孔中加入等体积的CellTiter-Glo Reagent试剂，充分混匀，同时设置空白对照孔，RT裂解10min。

(4)每孔吸取40μl至新的白底不透明96孔板中，酶标仪检测，读取数据。

2.8心肌细胞凋亡检测

(1)取分化至30d的心肌细胞消化后按合适密度接种到新的6孔板中(使用不含EDTA的Trypsin)。

(2)接种第二天加入小分子药物作用3h后，加入NE(20μM)共同作用5d，同时设置空白孔及阴性对照，中间换一次液，加入新的小分子继续作用。

(3)5d后，使用0.05％不含EDTA的Trypsin(DPBS稀释)，尽量将细胞消化单，300rpm×5min收集细胞沉淀。

(4)配置1×Binding buffer，使用ddH

(5)DPBS洗细胞沉淀2次，300rpm×5min。

(6)加入250μl 1×Binding buffer重悬细胞，调节细胞密度至1×10

(7)在上述悬液中取出100μl，向其中加入10μl PI和5μlAnnexin V染料，轻轻混匀。

(8)避光RT孵育15min。

(9)加入300μl PBS混匀，1h之内上机检测。

2.9 RT-PCR分析

2.9.1RNA提取

(1)细胞：每孔细胞先加入DPBS洗3遍，之后加入1ml Trizol，吹打数次，充分将细胞裂解，转移至EP管中。组织：组织块放入EP管中，先用剪刀(DEPC浸泡高压)将组织剪碎，加入研磨珠3-5颗(DEPC浸泡高压)研磨，直至无大块组织。

(2)RT静置5min，按氯仿：Trizol＝1:5比例加入氯仿，用力上下震荡15s，RT静置3-5min。

(3)12000rpm×15min，4℃。

(4)取上清至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，沉淀RNA，轻轻混匀，4℃过夜。

(5)12000rpm×10min，4℃。

(6)保留底部白色沉淀，加入1ml75％乙醇(DEPC水配制)洗RNA。

(7)7500rpm×5min，4℃。

(8)弃乙醇，暴露于空气中干燥3-5min，加入适量DEPC水溶解RNA。

(9)待完全溶解后测RNA浓度，于-80℃保存。

2.9.2反转录

(1)去除基因组DNA

在RNase-free的离心管中按下述顺序依次加入:

4×gDNA wiper Mix 4μl

RNase free ddH

RNA temple1μg

移液器轻轻吹打混匀，42℃，2min。

(2)反转录反应

5×HiScript II 4μl

第一步的反应液16μl

移液器轻轻吹打混匀，依次进行如下反应：50℃-15min，85℃-5s。

2.9.3荧光定量PCR

(1)将上述cDNA用ddH

(2)于qPCR板中配制下述混合液

充分混匀，800rpm×5min

(3)按下述条件进行反应

2.9.4RT-PCR引物设计

(1)人源相关引物：

(2)大鼠相关引物：

2.10心肌细胞收缩力检测

(1)取分化至30d的心肌细胞消化成单细胞后，按合适密度接种到激光共聚焦皿中(Matrigel包被)。

(2)接种后第二天换液。

(3)第三天加入小分子作用，3h后加入NE(20μM)处理。

(4)二者共同作用24h后使用FelixGX细胞动缘检测系统检测心肌细胞收缩力变化。

2.11心肌细胞钙瞬变检测

(1)取分化至30d的心肌细胞消化成单细胞后，按合适密度接种到激光共聚焦皿中(Matrigel包被)。

(2)接种后第二天换液。

(3)第三天加入小分子作用，3h后加入NE(20μM)处理。

(4)二者共同作用24h后，弃去原有培液，台式液(含10％FBS)洗2次。

(5)加入含5μM Cal-520AM和0.02％Pluronic F-127的台式液进行染色，37℃孵育15min。

(6)弃去培液，台式液(含10％FBS)洗2次。

(7)使用激光共聚焦显微镜进行线扫，采集图像，记录荧光信号变化。

(8)利用MATLAB软件进行图像数据分析。

2.12组织染色和免疫荧光

2.12.1组织石蜡包埋

(1)组织先用4％多聚甲醛固定过夜。

(2)1×PBS洗去多余甲醛，组织修整后放入包埋框中。

(3)组织脱水

(4)组织透明

(5)组织浸蜡：将包埋框连同组织放入蜡缸中，62℃，1.5h。

(6)包埋机中包埋。

2.12.2马松三色染色

(1)组织蜡块5μm切片，42℃爬片，60℃烤片30min。

(2)切片脱蜡至水

(3)自来水冲洗5min，A、B液等体积混合，染5-10min，流水稍洗。

(4)第二液染3-5min，流水稍洗。

(5)第三液冲洗直至片子上滴下液滴变为无色。

(6)第四液染3-5min，用第三液冲洗。

(7)第五液染色3-5min。

(8)乙醇脱水

(9)二甲苯透明3次，2min/次。

(10)中性树胶封片，显微镜下观察，拍照。

2.12.3 WGA染色

(1)切片常规烤片，脱蜡至水。

(2)抗原修复：切片浸入0.01M柠檬酸盐缓冲液中，100℃水浴15min，自然冷却。

(3)1×PBS洗，5min×3次。

(4)山羊血清RT封闭30min。

(5)WGA用1×PBS 1:100稀释，4℃孵育过夜。

(6)切片放于湿盒中RT复温1h。

(7)1×PBS洗，2min×3次。

(8)封片剂封片，荧光显微镜下观察，拍照。

2.13大鼠血清NE及NT-proBNP检测

(1)加入适当稀释的待检血清50μl于反应孔中，同时将标准品倍比稀释，并设置空白孔。

(2)于上述孔中加入50μl试剂A液，轻轻混匀板，37℃孵育1h。

(3)每孔加入350μl洗液，浸泡1-2min，于吸水纸上拍干，重复3次。

(4)弃去洗液后，每孔加入100μl试剂B液，37℃孵育30min。

(5)重复步骤(3)。

(6)每孔中加入90μl底物试剂，37℃避光孵育10-20min。

(7)每孔中加入50μl终止反应液，轻轻混匀，试剂颜色由蓝转为黄色。

(8)10min内，用酶标仪于450nm处，读取数据(上机前板底擦拭干净切保证孔内无气泡)。

3统计分析

动物实验每组n≥6，所有实验均重复3次以上。所有实验结果数据均以均值加减标准误(Mean±SEM)表示。文中所示结果均使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)进行数据统计、分析与作图，单因素方差分析(one way ANOVA)用于多组比较，双向T检验(Two-tailed Student’s T Test)用于两组间比较。P<0.05认定为具有统计学差异。

实施例1：人胚胎干细胞来源心肌细胞筛选纯化获得高纯度的人源心室肌细胞

利用本实验室前期已构建好的人胚胎干细胞系MYL2

随后利用体外二维单层诱导分化方法将MYL2

利用MYL2

实施例2：高通量药物筛选体系的建立

2.1高通量药物筛选简易流程

按图4所示方案进行筛选，将分化25d的心肌细胞经过G418筛选5d之后接种到384孔板中，每个小分子药物以四复孔的形式进行筛选，在加入小分子作用3h后加入NE，二者共同处理5d，之后进行细胞固定、荧光染色，最后进行图像采集、软件分析。

2.2高通量药物筛选条件的确立

由于在体外培养的条件下，细胞主要为贴壁生长，三维细胞体积不容易计算，因此分析心肌细胞是否发生肥大主要对其二维细胞面积进行统计。因此，为了对心肌细胞肥大进行分析，我们将药物处理后的心肌细胞进行免疫荧光染色。将分化好的心肌细胞尽量消化成单个细胞重新种到培养板中，每个孔中控制细胞密度尽量一致，并且密度较稀，从而保证细胞有足够的时间(5d)和空间伸展开，染色之后计算的是每个单细胞的面积。

首先通过心肌细胞特有表达的肌钙蛋白cTnT的染色找到需要分析的阳性心肌细胞群；接着在这群心肌细胞中，通过Cell Tracker(一种胞质的染料)的着染来精准计算细胞的面积大小；最后，将每孔的细胞数据导出进行分析，通过DAPI的数目初步判断小分子的毒性，并将这部分毒性较大的小分子剔除(图5)。

本文对NE处理的条件进行了探索，包括NE的作用时间以及作用浓度。根据每孔中每个细胞面积大小的变化，将细胞面积介于1000μm

为了确立筛选的标准，我们对染色的结果进行分析，发现每孔的平均面积和小细胞所占比例这两个指标较为稳定，能够使NE处理与未处理的两群细胞之间的差异稳定存在，且CV能控制在15％之内，而大面积细胞所占比例这一指标相对前两个来说稳定性稍差，CV能控制在25％之内(图7)。因此我们筛选的指标以细胞的平均面积大小及小面积细胞比例为主，大面积细胞比例作为辅助筛选条件。在小分子药物处理后，若平均面积大小及大面积细胞比例指标较NE处理组能有所降低，而小面积细胞比例显著升高且P值<0.05，即将这个小分子挑选出来作为我们的筛选阳性小分子。

为了保证小分子筛选体系的可行性，需要确认NE在该筛选条件下对心肌细胞的作用是否可被逆转，故我们选用了α受体经典的拮抗剂哌唑嗪(Prazosin,Pra)作为我们筛选的阳性对照。结果显示，Pra处理后，NE促进心肌细胞变大的效果得到了明显的抑制，细胞的平均面积大小、小面积细胞比例和大面积细胞比例均可恢复到正常水平(图8)。

实施例3：天然小分子化合物库的筛选

以上筛选体系建立后，我们筛选了一个含有495个天然小分子化合物的库。该库中的化合物是从植物等天然产物中分离出来的小分子化合物。通过初筛，得到了54个阳性小分子化合物，接着我们将这54个小分子进行复筛，进一步缩小范围，得到了19个阳性小分子。在这19个小分子中，其中有4个小分子化合物属于佛波酯类(Phorbol)化合物，这一类化合物毒性较高，故后续不予研究。其中有2个小分子化合物属于视黄酸类(9-cis-Retinoicacid，13cis-Retinoic acid)，已有文献研究发现视黄酸类化合物可抑制心肌肥厚相关marker的表达；熊果酸(Ursolic acid)已被研究报道可改善心肌肥厚及纤维化，故本文后续也没有继续研究。值得注意的是，在这19个小分子化合物中，我们筛到了一种α受体的拮抗剂-萝芙素(Rauolscine)，与阳性对照哌唑嗪类似同为α肾上腺素能受体的拮抗剂，这也从一定程度上反映了我们筛选体系的可靠性。而像千金藤素(Cepharanthine)、大黄素(Emodin)我们检测发现其对心肌细胞毒性较高，且心肌细胞对其药物反应性不佳，故后续也不再继续进行研究。

后续我们通过细胞毒性检测、剂量依赖实验和心肌细胞功能检测，最后得到了5个效果比较好的阳性小分子(图9A)。这19个小分子作用后，心肌细胞的平均面积、小细胞比例和大细胞比例均较NE组的水平有所降低，更加接近正常水平(9C-9D)。

实施例4：筛选阳性小分子化合物针对心肌细胞跳动频率IC50测定

由胚胎干细胞分化而来的心肌细胞具有节律性，可自发搏动，因此我们检测了筛出来的小分子化合物对心肌细胞跳动频率的影响，并测定其IC

实施例5：筛选阳性小分子化合物对心肌细胞的毒性检测

5.1筛选阳性小分子化合物处理对心肌细胞活力的影响

前期筛选我们关注的是心肌细胞面积大小的变化，但在整个筛选过程中我们无法完全排除小分子化合物的毒性作用，若其对心肌细胞存在毒性，也可能会使心肌细胞圆缩而面积减小，故而呈现假阳性的结果。为了检测筛选出的小分子化合物对心肌细胞的毒性作用以及进一步缩小后续细胞功能部分的筛选范围，我们检测了小分子处理后心肌细胞活力的变化。实验研究发现，在筛选出的小分子化合物中，花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱这4个小分子化合物对心肌细胞活力影响较小，IC

5.2筛选阳性小分子化合物处理对心肌细胞凋亡的影响

当细胞发生凋亡时，细胞膜会皱缩变形，胞质浓缩，细胞的体积也会变小，贴壁细胞则会出现皱缩、变圆，严重者可从板底脱落。为了排除细胞面积变小是因为小分子引起了心肌细胞凋亡的可能性，我们利用Annexin V-FITC/PI共染对心肌细胞凋亡进行了流式分析。正常活细胞为annexin V-/PI-；PI+则表示细胞发生坏死或者处于晚期凋亡状态；annexin V+/PI-则表示细胞处于早期凋亡状态；annexin V+/PI+则表示细胞处于晚期凋亡状态。为了方便后续对心肌细胞功能的检测，我们将小分子作用的浓度调整为针对心肌细胞跳动频率所测得的IC

如图12所示，检测结果发现，金鸡纳啶、延胡索甲素这2个小分子化合物处理后，annexin V阳性细胞比例和annexin V/PI双阳性细胞比例与对照均无明显差异，对心肌细胞凋亡影响较小。而弱金鸡纳碱处理后，annexin V阳性细胞比例较正常组有所降低，这提示弱金鸡纳碱可能对心肌细胞凋亡存在一定的抑制作用。有研究表明花姜酮可通过使DR4和DR5表达上调，cFLIP表达下调，活化caspase级联反应，从而促进TRAIL诱导的细胞凋亡。这与我们检测结果也一致，在花姜酮处理后，annexin V阳性细胞比例明显上升，而annexinV/PI双阳性细胞比例没明显变化，说明花姜酮促进了心肌细胞的凋亡，其中晚期凋亡的细胞比例未发生改变，这可能是在该作用条件下，心肌细胞较多的处于早期凋亡的状态。以上结果表明，金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱4个小分子化合物并未促进心肌细胞凋亡，对心肌细胞毒性较低，而花姜酮可抑制NE诱导的心肌细胞面积变大，这可能与心肌细胞发生了凋亡有关。

实施例6：筛选阳性小分子化合物处理后心肌细胞功能检测

6.1筛选阳性小分子化合物抑制NE诱导的心肌细胞肥大相关基因的表达

为了检测小分子化合物对心肌细胞肥大相关基因表达是否存在影响，我们利用实时PCR技术对小分子化合物处理5天后的心肌细胞进行了分析。如图13所示，在NE处理心肌细胞后，心肌细胞肥大相关的标志心房钠尿因子(atrial natriuretic factor,ANF)和B型利钠肽(B-type natriuretic peptide,BNP)均明显高于对照组(P<0.0001)；与心肌收缩和舒张密切相关的结构蛋白-肌钙蛋白T(cTNT)表达也明显增高(P<0.0001)；由NFAT介导的肥厚相关信号肌细胞增强因子2C(MEF2C)的表达也上升(P<0.0001)。另外心脏的收缩与心肌的钙离子活动密切相关，肌浆网Ca

在筛选出的阳性小分子化合物中，我们发现，花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素和弱金鸡纳碱处理心肌细胞后，与NE组相比能够明显抑制cTNT和Serca2a的表达。花姜酮和金鸡纳啶均能抑制NE对BNP和ANF表达的促进作用。延胡索甲素和弱金鸡纳碱可以降低BNP的表达，而对ANF影响较小(P>0.05)；而BNP的表达水平与对照组相比无明显差异(P>0.05)。这4种小分子化合物处理后，MEF2C的表达水平均呈现出下降的趋势。综上所述，花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱在一定程度上能够抑制NE所诱导的心肌细胞肥大相关基因的表达。

6.2筛选阳性小分子化合物抑制NE对心肌细胞收缩力的促进作用

心肌肥厚处于代偿阶段往往伴随着心肌细胞收缩力的增强，为了观察小分子化合物是否能影响心肌细胞的收缩力，我们对筛选阳性小分子作用后的心肌细胞进行了收缩力检测，结果如图14所示。我们发现，NE处理心肌细胞后可产生类似正性肌力的作用，心肌细胞的收缩力明显增强，其频率也明显加快，而拮抗剂Pra处理后心肌细胞的收缩力与跳动频率均有所减弱，这表明Pra可以抑制NE对心肌细胞收缩力的影响。同时我们也发现在花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱这4个小分子化合物作用后，心肌细胞的收缩力较对照组明显降低，且心肌收缩频率较NE处理组相比有所减缓，提示这4种小分子化合物均能够不同程度的抑制NE引起的心肌细胞收缩力增加。

6.3筛选阳性小分子化合物抑制NE对心肌细胞钙处理活动的促进作用

Ca

实施例7：筛选阳性小分子化合物对小动物压力负荷造成的心肌肥厚模型在体治疗效果评价研究

7.1SHR动物模型给药后饮食量及体重测定

自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rat，SHR)在幼年期交感神经活性增高，出生后4-6W，血压开始逐渐增高，并随着高血压的进一步发展，外周血管阻力的增大，大鼠会出现一系列心血管病症，其中心肌肥厚与纤维化最为典型，故我们选用自发性高血压大鼠作为我们心肌肥厚模型。SHR出生后7-8W，已有心血管的病变，心脏开始逐渐变肥厚，24W后心室壁的肥厚程度进一步加重。为了观察小分子化合物对心肌肥厚是否具有改善作用，我们选择在SHR出生后6W开始给药，此时大鼠血压开始增高但心脏还未明显肥厚。接下来，我们将前期检测毒性较小的化合物花姜酮、金鸡纳啶、弱金鸡纳碱3种小分子药物的粉末按下述方案比例分别添加至鼠粮中，加工合成定制饲料(图16)。5周龄雄性SHR和WKY(95-105g)均购于北京维通利华，在适应喂养1W后，我们开始进行为期3个月的给药处理，我们选择降压药卡托普利(Captopril)作为我们的阳性对照，每种小分子药物均分成高低剂量组。

在开始给药后，我们便开始对大鼠的饮食量以及体重进行了监测记录，结果发现WKY的饮食摄入量较SHR稍低，其可能是SHR处于较为亢奋状态，机体耗能代谢较旺盛，摄入较多，另外，卡托普利、花姜酮、金鸡纳啶、弱金鸡纳碱给药组的饮食摄入量与SHR组均无明显差别，这表明这些小分子药物粉末的添加并不影响大鼠的饮食量，从而保证了药物的充分摄入。观察体重变化，我们发现这些小分子化合物在给药3个月后，大鼠体重并没有明显改变，且外观无可见的异常表现(图17)。

7.2给药后大鼠血压测量

为了检测小分子化合物是否能够影响SHR的血压，我们对给药后大鼠进行了无创尾动脉血压测量，检测发现SHR组血压明显高于WKY组(P<0.0001)，而卡托普利治疗组血压显著降低(P<0.0001)，其收缩压和舒张压均能恢复至正常水平，而花姜酮、金鸡纳啶、弱金鸡纳碱治疗组血压较SHR组均无明显变化(P>0.05)，说明花姜酮、金鸡纳啶、弱金鸡纳碱并不影响SHR的血压(图18)。

7.3给药后心脏超声评估心肌肥厚

为了检测小分子化合物对心肌肥厚是否具有改善作用，在开始给药后，每隔2周进行一次心超检测。结果显示：从8W开始，SHR的室间隔及左室后壁的舒张期厚度(IVSd和LVPWd)已经开始逐渐增高，后期则稳定高于WKY(P<0.0001)，SHR的左室重量指数(LVMI)也明显高于WKY(P<0.001)，说明SHR肥厚表型明显。卡托普利治疗效果最为显著，可明显降低IVSd、LVPWd和LVMI，且可基本恢复至正常水平。而花姜酮、金鸡纳啶、弱金鸡纳碱分别治疗后，可一定程度降低其IVSd、LVPWd和LVMI，但不能完全恢复至正常水平，这可能与其无法降低血压有关。高低剂量组效果差异较小，可能是药物给药浓度选择梯度过小而致。以上数据表明，SHR在接受花姜酮、金鸡纳啶、弱金鸡纳碱治疗后，可以一定程度降低其室间隔与室壁厚度，减轻SHR的肥厚程度(图19)。

7.4给药后大鼠心脏取材结果分析

给药3个月后，我们进行心脏取材，并统计心重与体重的比值。如图20所示，SHR心脏外观较WKY明显增大，心重/体重比值显著增加(P<0.0001)，卡托普利治疗后，心脏大小、心重/体重比值明显变小，基本恢复至正常水平(P<0.0001)。其中花姜酮、金鸡纳啶治疗后其心脏外观大小及心重/体重比值较SHR有所减小，而弱金鸡纳碱治疗后，其心脏外观大小变化不明显，仅低剂量组心重/体重比值较SHR组稍有降低。

7.5给药后大鼠心脏组织染色形态观察

我们通过心脏组织的Masson’s染色观察其形态结构，结果如图21所示，SHR组心脏明显大于WKY组，且室壁较厚，卡托普利治疗后，心脏组织明显变小，而经花姜酮、金鸡纳啶、弱金鸡纳碱治疗后，心脏室壁厚度明显变薄，心脏较SHR组稍有减小。WGA染色显示，SHR的心脏组织中心肌细胞较WKY组明显增大(****P<0.0001)，而卡托普利治疗后，可明显降低心肌细胞的面积(****P<0.0001)，花姜酮、金鸡纳啶、弱金鸡纳碱在给药3个月后，也可使心肌细胞面积明显减小(****P<0.0001)，弱金鸡纳碱治疗后，心肌细胞面积较SHR组有所降低，但其效果不如其他几个药物明显。相比之下，花姜酮、金鸡纳啶治疗后可明显减小心肌细胞面积，对SHR的心肌肥厚的治疗效果优于弱金鸡纳碱。

7.6给药后大鼠心脏组织肥厚相关基因的表达

为了检测小分子化合物对体内肥厚基因mRNA表达是否有影响，我们提取了给药3个月后的大鼠心脏组织的RNA，利用实时PCR技术检测了肥厚相关基因的表达变化。如图22所示，SHR组较WYK组高表达与心肌收缩相关的蛋白β肌球蛋白重链(β-myosin heavychain，β-MHC)和肌钙蛋白T(cTNT)，另外肥厚的相关的标志BNP与ANF表达明显增高，与肥厚通路相关的MEF2C及与钙离子调节相关的Serca2a表达也明显上升，这说明SHR呈现出心肌肥厚的基因表达水平状态。

降压药卡托普利可明显降低β-MHC、cTNT、BNP、ANF和Serca2a的表达，说明卡托普利治疗后可抑制心肌肥厚相关基因的表达。花姜酮、金鸡纳啶可明显降低BNP、ANF、Serca2a的表达，β-MHC，cTNT和MEF2C表达呈现下降趋势。而弱金鸡纳碱治疗后可降低β-MHC、BNP和cTNT的表达水平。说明花姜酮、金鸡纳啶、弱金鸡纳碱均可一定程度上抑制心肌肥厚相关基因表达。

7.7给药后血清中NE及NT-proBNP含量测定

由于我们的小分子化合物是在NE诱导的细胞肥大模型上筛选出来的，且能够在细胞水平抑制BNP的表达，故我们检测了这些小分子化合物对在体NE及NT-proBNP的水平是否存在影响。如图23所示，通过ELISA检测，我们发现SHR组体内血清中NE及NT-proBNP含量明显高于WKY组(**P<0.01)，且卡托普利治疗可降低SHR血清NE及NT-proBNP含量，而花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱治疗后均可明显降低血清中NE的含量，且花姜酮、金鸡纳啶、弱金鸡纳碱的高剂量治疗组其体内NT-proBNP含量较SHR组有所下降。这提示我们花姜酮、金鸡纳啶、弱金鸡纳碱对SHR心肌肥厚的改善可能与其体内NE水平降低有关。

7.8花姜酮和金鸡纳啶可改善成年SHR(已发病)心肌肥厚

我们将花姜酮与金鸡纳啶分别按0.07％和0.15％的比例加入饲料中，并将其给予14周龄的SHR，进行维持3个月的治疗(图24)。由图可知，在14W时，SHR已表现为明显的心肌肥厚，伴随着室壁厚度，左室质量分数的增加，而在花姜酮/金鸡纳啶治疗三个月后，SHR的心肌肥厚症状明显减轻，包括心脏大小、心脏体重比、心肌细胞横截面积、肥厚相关基因表达及心超相关数据。以上结果表明花姜酮与金鸡纳啶针对已经发生的心肌肥厚仍具有较好的改善作用。

实施例8：筛选阳性小分子化合物对小动物肥厚型心肌病模型在体治疗效果评价研究

我们运用了经典的Mybpc3敲入(KI)肥厚型心肌病(HCM)小鼠，该小鼠在外显子6(16)的最后一个核苷酸上携带点突变(单个G790A转换)(称为G790A)(图24A)。4-6周龄的小鼠用含0.07％花姜酮的加工饲料治疗32周。与WT相比，KI(纯合子)小鼠表现出左室肥厚，心脏大小、心脏重量/体重比、心肌细胞横截面积以及IVSd和LVPWd显著增加(图24B-24F)。在G790A-KI小鼠中也观察到胎儿基因(β-MHC、BNP和ANP)的上调(图24E)。此外，未观察到WT空白组和WT Zer治疗组之间心脏的显著差异。相比之下，花姜酮治疗显著抑制了这些肥大生长特征(图25)，显示花姜酮能够抑制HCM小鼠的心肌肥厚。

同时我们也将延胡索甲素按0.1％和0.02％的比例添加至G790A小鼠的饲料中，经过16W的给药，发现延胡索甲素可改善HCM小鼠的心肌肥厚(图26)。

结论

心脏感受到外界环境的刺激可产生一系列的应对措施，包括改变其心腔容积的大小、心脏收缩与舒张功能、心率以及心肌质量。心肌肥厚也是心脏应对超工作负荷所产生的代偿反应，许多心血管类疾病的发病过程中均会出现心肌肥厚的病理变化。处于早期阶段的心肌肥厚可以通过增加心脏的输出量而起到代偿性的作用，然而，长期持久的病理性心肌肥厚若得不到有效改善，最终易导致心室的扩张，往往会发展成心脏收缩舒张功能的障碍，甚至心衰。

引起肥厚的因素通常可以分为以下三大类：1.机械性因素，如压力负荷过度(高血压)、容积超负荷(主动脉瓣关闭不全)等；2.神经体液内分泌性因素，如加压素、血管紧张素II、去甲肾上腺素等均有促肥厚作用；3.遗传性因素，如肌节蛋白突变引起的心肌肥厚心肌病等。心肌肥厚致病机制复杂。目前研究发现细胞内MAPK-JNK信号通路、与Ca

以往对疾病的研究多来源于临床样本、体外细胞系及动物模型，但心脏类疾病其一临床样本来源受限大；其二心肌细胞属于终末分化细胞，正常生理状态下难以增殖，无法体外进行扩增，且少有匹配合适的细胞系；其三动物的心脏在生理机制、细胞分子等水平上与人类仍存在一定差异，难以全面刻画人类疾病的全貌；在此基础上进行药物的研究，缺乏一定的针对性与精准性。

本发明中，我们利用NE对人类胚胎干细胞来源的心肌细胞进行诱导处理，发现处理后心肌细胞面积明显增大，与肥厚相关的基因表达增高，收缩力与跳动频率明显增加，钙活动增强，且哌唑嗪能够拮抗NE的作用，这些结果与原代细胞上结果具有一致性。

由于干细胞具有向多个胚层分化的潜能，即使将干细胞定向分化出来的细胞中也仍会存在一些其他类型的细胞，当分化出的细胞纯度不够往往会对筛选工作产生较大的干扰，因此细胞分化纯度的问题在很大程度上限制了高通量筛选分析方法的确立。人类胚胎干细胞定向分化出的心肌细胞纯度能否得到保证也是本发明建立高通量筛选体系所面临的关键问题之一。

在本研究中我们利用MYL2

能否具有明显的筛选表型也是影响筛选成败的关键因素。在分化筛选后的心室肌细胞上，我们给予NE的刺激而诱导心肌细胞肥大，接下来通过高内涵成像分析系统对心肌细胞的免疫荧光染色图进行分析，统计心肌细胞二维面积的改变。NE的作用条件很大程度上直接影响了心肌细胞面积大小的变化，因此NE的作用条件对高通量筛选体系的建立至关重要，故我们对NE的作用条件进行了一系列的探索，包括NE处理的不同浓度及时间。最后，我们发现当NE 20μM处理5d时，处理与未处理两群细胞可明显的区分开，且二者之间重叠区域较少，可满足筛选的需求。

由于影响心肌细胞二维面积的因素较多，实验因素可以通过实验条件的优化尽量控制，但整个筛选体系对药物毒性反应并不敏感，若小分子化合物对心肌细胞存在一定的毒性，也可能使心肌细胞面积减小，所以在完成筛选后，需要检测心肌细胞对小分子化合物的反应性及小分子化合物的毒性。我们发现心肌细胞对花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱的反应性都较好，呈现一定的剂量依赖关系，且这4个化合物对心肌细胞毒性均较小，其根据心肌细胞跳动频率所测得的IC

本发明的RT-PCR结果显示，NE处理人类胚胎干细胞来源的心肌细胞后，心肌肥厚的标志BNP、ANF均表达上调，肥厚相关的基因MEF2C、Serca2a的表达同样也增高，进一步从基因表达水平上表现了NE具有促肥厚的作用。而哌唑嗪及这4种小分子均可在细胞水平上抑制上述肥厚相关基因的表达。SHR具有明显的心肌肥厚表型，我们对SHR心脏组织进行RT-PCR分析，发现肥厚典型的标志基因β-MHC、BNP、ANF均较正常组明显增高，MEF2C、Serca2a和cTnT表达也上调，说明SHR具有典型的肥厚基因表达模式。

本发明发现，在NE处理人类胚胎干细胞来源的心肌细胞后，心肌细胞的钙处理活动增强，钙瞬变幅度增高，频率加快，心肌细胞收缩力也明显增强。而花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱在处理了心肌细胞后，钙处理活动均在一定程度上受到了抑制，这4个小分子化合物可能影响了细胞内肌浆网对Ca

总之，我们在纯化的人类胚胎干细胞来源的高纯度心室肌细胞上，通过NE诱导心肌细胞肥大，成功建立了针对心肌肥大细胞模型的高通量药物筛选体系，为将来心肌肥厚的高通量药物筛选提供了参考。在筛选了495个天然小分子化合物后，我们找到了4个毒性较低的小分子(花姜酮、金鸡纳啶、延胡索甲素、弱金鸡纳碱)可在心肌细胞功能上抑制NE的促肥大作用，并在动物水平上，可一定程度改善SHR心肌肥厚，这对心肌肥厚新型药物治疗靶点及相关通路研究提供了新的方向，有可能为心肌肥厚的临床治疗带来新的干预策略。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。