一种交联水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及高分子材料技术领域，更具体地，涉及一种交联水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

市面上常用的止血材料有止血带、止血粉、止血纱布等，但是它们被用于止血的同时还存在着很多问题，例如保湿作用差、易发生组织粘连、生物相容性差等。另外，在止血后由于伤口不规则而导致的伤口愈合延迟也会引起死亡率的增加。目前，水凝胶因其良好的保湿性和可降解性而受到广泛的关注，特别是原位可注射水凝胶可以通过微创注射技术将材料紧密附着在不规则的伤口上，在潮湿、高动态的环境中表现良好。目前已经出现了一些止血愈合伤口的水凝胶材料，例如卢亚鹏利用2，3，4-三羟基苯甲醛和罗非鱼皮明胶合成的促进伤口愈合水凝胶(Lu Y，Zhao M，Peng Y，He s，Zhu X，Hu C，Xia G，Zuo T，Zhang X，YunY，Zhang W，Shen X.A physicochemical double-cross-linked gelatin hydrogel withenhanced antibacterial and anti-inflammatory capabilities for improving woundhealing.J Nanobiotechnology.2022Sep24；20(1)：426.)，以及纤维蛋白胶和氰基丙烯酸酯胶等，这些水凝胶可通过粘附在组织表面有效地封闭伤口。但是，2，3，4-三羟基苯甲醛和罗非鱼皮明胶合成的促进伤口愈合水凝胶形成的时间较长，纤维蛋白胶主要由纤维蛋白原、凝血酶和氯化钙组成，存在生物安全性不足和感染风险高等问题，因此被限制在急救治疗中应用。氰基丙烯酸酯胶虽然具有很强的附着力，但由于存在甲醛等有毒降解产物，存在生物安全问题。壳聚糖作为一种良好的生物相容性试剂，拥有良好的抑菌性能的同时，还可以解决伤口止血，促进伤口的愈合，但壳聚糖作为一种难溶性的物质，需要在酸性条件下才可以完成溶解，大大限制了其应用。

因此，亟需开发一种生物相容性好，能够止血，且具有抑菌性能的水凝胶。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种交联水凝胶及其制备方法和应用，本发明利用具有良好生物相容性的羟丙基脱乙酰壳多糖和2，3，4-三羟基苯甲醛在温和的条件下，形成交联的网络结构，交联快速，可以在五分钟内完成交联，还具有抑菌效果，能够止血。

本发明的第一方面提供一种交联水凝胶的制备方法。

具体地，一种交联水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

先将羟丙基脱乙酰壳多糖溶于溶剂中，加入铁盐，再加入2，3，4-三羟基苯甲醛，发生交联反应，制得所述交联水凝胶。

2，3，4-三羟基苯甲醛(TBA)上合有酚羟基和醛基，本发明利用2，3，4-三羟基苯甲醛的酚羟基与铁盐中的铁离子形成络合物，3分子2，3，4-三羟基苯甲醛和1分子的铁离子进行络合，络合物上2，3，4-三羟基苯甲醛的醛基还可以与羟丙基脱乙酰壳多糖(CS)上的氨基发生希夫碱反应，从而快速交联形成交联水凝胶，具有多重交联网络结构，其中，羟丙基脱乙酰壳多糖不仅保持了壳聚糖的优良性能，且不需要在酸性条件下溶解，在温和的条件下就可以溶解，具有良好的水溶性，对人体不会产生强烈的刺激，羟丙基脱乙酰壳多糖还具有促进伤口愈合的功能。本发明制得的交联水凝胶可以作为可注射的水凝胶，根据伤口形状发生变化，刚好覆盖伤口，不仅仅可以为伤口止血，还可以抑制伤口细菌的生长，更好地促进伤口的愈合。

优选地，所述羟丙基脱乙酰壳多糖、铁盐、2，3，4-三羟基苯甲醛的质量比为(5-15)：(0.1-3)：(1-10)。

进一步优选地，所述羟丙基脱乙酰壳多糖、铁盐、2，3，4-三羟基苯甲醛的质量比为(10-15)：(1.11-1.5)：(5-10)。

更优选地，所述羟丙基脱乙酰壳多糖、铁盐、2，3，4-三羟基苯甲醛的质量比为10：1.11：5。

优选地，所述先将羟丙基脱乙酰壳多糖溶于溶剂中，然后还包括加入聚赖氨酸。

2，3，4-三羟基苯甲醛的醛基还可以与聚赖氨酸(EPL)上的氨基发生希夫碱反应。聚赖氨酸具有良好的生物相容性和广谱抑菌性能，达到止血的同时还抑制伤口细菌生长，促进伤口的愈合。

优选地，所述羟丙基脱乙酰壳多糖、聚赖氨酸、铁盐、2，3，4-三羟基苯甲醛的质量比为(5-15)：(1-10)：(0.1-3)：(1-10)。

进一步优选地，所述羟丙基脱乙酰壳多糖、聚赖氨酸、铁盐、2，3，4-三羟基苯甲醛的质量比为(10-15)：(4-10)：(1.11-1.5)：(5-10)。

更优选地，所述羟丙基脱乙酰壳多糖、聚赖氨酸、铁盐、2，3，4-三羟基苯甲醛的质量比为10∶4∶1.11：5。

优选地，所述交联反应的温度为60-80℃，所述交联反应的时间为1-5分钟。

优选地，所述溶剂为磷酸盐(PBS)缓冲液。

优选地，所述溶剂的pH值为7-8。

进一步优选地，所述溶剂的pH值为7.4-8。

更优选地，所述溶剂的pH值为7.5-8。

优选地，所述铁盐为氯化铁。

优选地，所述加入铁盐后，还包括在70-90℃加热1-5分钟。2，3，4-三羟基苯甲醛的最佳反应温度为70-90℃，加热有助于加快聚赖氨酸与壳多糖的溶解。

本发明的第二方面提供一种交联水凝胶。

一种交联水凝胶，所述交联水凝胶的含水量为70-90％。

本发明的第三方面提供一种交联水凝胶的应用。

一种交联水凝胶在制备止血抑菌制品中的应用。

一种可注射止血抑菌敷料，包括所述交联水凝胶作为原料制得。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明利用羟丙基脱乙酰壳多糖、2，3，4-三羟基苯甲醛以及铁盐发生交联反应，制得交联水凝胶，反应条件温和，无需酸性条件，在5分钟以内即可快速形成水凝胶，含水量达到81.71-85.52％，具有较高的含水量，而且48h后保湿率仍然能够达到90％以上，保湿性较好，在抑菌实验中对于革兰阳性细菌(金黄色葡萄球菌)、革兰阴性细菌(大肠杆菌)具有较好的抑菌性能，在溶血性实验，展现出良好的生物相容性，体外止血实验表现出了高效快速止血的能力，本发明制得的交联水凝胶可以很好地抑制伤口细菌生长，促进伤口的愈合；

(2)本发明提供的交联水凝胶不仅可以快速交联，而且具有可注射性、止血、抑菌功能，可以通过局部注射快速填充整个伤口，达到止血的目的，还可以抑制细菌的生长，可以广泛应用于制备伤口止血抑菌产品中。

附图说明

图1为本发明实施例2的交联水凝胶合成示意图；

图2为本发明实施例2的交联水凝胶注射得到的图形；

图3为本发明实施例1-3制得的交联水凝胶的含水量测试结果图；

图4为本发明实施例1-3制得的交联水凝胶的溶胀性能测试结果图；

图5为本发明实施例1-3制得的交联水凝胶的保湿性测试结果图；

图6为本发明实施例1-3、5制得的交联水凝胶对红细胞的溶血率测试结果图；

图7为本发明实施例1、3制得的交联水凝胶施用于兔肝脏后止血情况图；

图8为本发明实施例1、3制得的交联水凝胶施用于兔肝脏后出血量图；

图9为本发明实施例1-3制得的交联水凝胶的抑菌能力测试。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1

一种交联水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)在4mL的PBS溶液(pH值7.5)中加入240mg羟丙基脱乙酰壳多糖(CS)，震荡溶解；

(2)在步骤(1)溶液中加入800μL浓度为33.33mg/mL的氯化铁溶液混匀并处于80℃下加热1分钟；

(3)在步骤(2)的溶液中加入120mg的2，3，4-三羟基苯甲醛(TBA)加热至80℃溶解，静待五分钟制得交联水凝胶(交联水凝胶产物命名为CS-TBA-EPL-0，其中EPL的含量为0，不加入聚赖氨酸即可形成水凝胶)。

实施例2

一种交联水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)在4mL的PBS溶液(pH值7.5)中加入240mg羟丙基脱乙酰壳多糖(CS)，震荡溶解；

(2)随即在步骤(1)溶液中加入96mg(即5mM)聚赖氨酸(EPL)溶解；

(3)在步骤(2)溶液中加入800μL浓度为33.33mg/mL的氯化铁溶液混匀并处于80℃下加热1分钟；

(4)在步骤(3)的溶液中加入120mg的2，3，4-三羟基苯甲醛(TBA)加热至80℃溶解，静待五分钟得到交联水凝胶(交联水凝胶产物命名为CS-EPL-TBA-5)。

上述实施例2的交联水凝胶的制备过程如图1所示，图1A为实施例2制得的CS-EPL-TBA水凝胶实物图，由图2可知，实施例2步骤(4)加入2，3，4-三羟基苯甲醛后，5分钟即可制得交联水凝胶。图1B为加入聚赖氨酸后发生希夫碱反应示意图。图1C为实施例2制得的交联水凝胶结构示意图。其中图1中TBA为2，3，4-三羟基苯甲醛，SciffBase reaction为希夫碱反应，ion coordination bond为离子配位键，Hydrogen bond为氢键。

实施例3

与实施例2的区别在于，步骤(2)随即在步骤(1)溶液中加入192mg(即10mM)聚赖氨酸(EPL)溶解(交联水凝胶产物命名为CS-EPL-TBA-10)。

实施例4

与实施例2的区别在于，步骤(2)随即在步骤(1)溶液中加入286mg(即15mM)聚赖氨酸(EPL)溶解(交联水凝胶产物命名为CS-EPL-TBA-15)。

实施例5

与实施例2的区别在于，步骤(2)随即在步骤(1)溶液中加入384mg(即20mM)聚赖氨酸(EPL)溶解(交联水凝胶产物命名为CS-EPL-TBA-20)。

对比例1

一种抑菌愈合伤口的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)在去离子水中加入2，3，4-三羟基苯甲醛(TBA)溶解；

(2)加入无水氯化铁(0.1M)，其中氯化铁与TBA的摩尔比＝1∶3；

(3)在溶液中加入5M的NaOH并搅拌3小时；

(4)将5g罗非鱼明胶(Tsg)与在50℃下加热的去离子水(100mL)混合，得到5％的Tsg溶液；

(5)将步骤(3)得到的溶液和Tsg溶液混合并搅拌溶解，将混合溶液在50℃下加热20分钟以制备预凝胶，最后，在25℃下形成水凝胶。

对比例2

一种富含壳聚糖的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取10.0g壳聚糖置于50mL圆底烧瓶中，然后向反应瓶中加入含有0.3％(体积分数)醋酸水溶液10mL，搅拌使壳聚糖充分溶解；

(2)再向反应瓶中分别加入33.33mg的2，4，5-三羟基苯甲醛和33.33mg的2，3，4-三羟基苯甲醛，反应体系在室温(RT)下搅拌1h，反应完成得到淡黄色黏稠液体，即为产物苯甲醛-壳聚糖；

(3)静置约24小时后形成富含壳聚糖的水凝胶。

应用例

一种止血抑菌辅料，采用上述实施例1制得的交联水凝胶制得。

产品效果测试

1、水凝胶的可注射性

由图2可知，将实施例2制得的交联水凝胶吸入注射器经过注射可书写大写字母“ZMU”，证明本发明制得的交联水凝胶具有可注射性，可通过注射得到不同的形状。

2、含水量测试

作为伤口敷料，较高的含水量可以保证伤口周围处于湿润环境，能够更好的促进伤口的愈合。通过以下方法进行测试，水凝胶形成凝胶后称量初始质量，再将实施例1-3制得的交联水凝胶置于-80℃的冰箱中过夜，冷冻干燥24h后，称量干燥后的质量，根据以下公式计算水凝胶含水量(Moisture content)：

其中：W

由图3可知，本发明实施例1-3制得的交联水凝胶的含水量分别为85.52％、83.88％、81.71％，具有较高的含水量。

3、溶胀性测试

将实施例1-3制得的交联水凝胶放于-80℃的冰箱中过夜，冷冻干燥24h后，干燥后称量初始质量，再将其分别放置于25℃、37℃、45℃的水溶液中，每隔5min将水凝胶取出，用滤纸吸干表面水分称量质量，根据以下公式计算溶胀度(Swelling)：

其中：W

结果如图4所示，实施例1-3制得的交联水凝胶在40分钟左右达到溶胀平衡，而且CS-EPL-TBA-10的溶胀度最高，表明本发明制得的交联水凝胶能够在较宽的温度范围内表现出较好的溶胀性能，可拓宽用途，例如本发明制得的交联水凝胶能够吸收伤口周围的渗出液，从而降低伤口的化脓情况。

4、保湿性测试

水凝胶形成后称量初始质量，再将实施例1-3制得的交联水凝胶置于37℃的培养箱中，称量放置在培养箱0h、6h、12h、24h、48h后的质量，根据以下公式计算水凝胶的保湿率(Water Holding Ratio)：

其中：W

图5a-c分别为实施例1-3制得的交联水凝胶的保湿性能测试结果图，由图5可知，48h后三种水凝胶保湿率仍然能够达到90％以上，良好的保湿率保证了伤口处于一个湿润的环境，这样的环境能促进伤口的愈合。

5、溶血性测试

将200μL的4％(体积浓度)的红细胞加入到实施例1-3制得的交联水凝胶中，使用生理盐水作为阴性对照(BLANK)，曲拉通X-100(Trtion-X-100)为阳性对照组，在540nm下测得吸光度，根据以下公式计算溶血率(Hemolysis)：

其中：A

结果如图6所示，阴性对照组、阳性对照组、CS-EPL-TBA-0、CS-EPL-TBA-5、CS-EPL-TBA-10、CS-EPL-TBA-20的溶血率分别为0％、100％、2.28％、3.36％、5.01％、7.23％，表明本发明制得的CS-EPL-TBA水凝胶具有较为合适的溶血率。

6、止血测试

用手术刀在兔肝脏与滤纸的非紧贴面开近1cm伤口(保证肝脏最下端破裂易于血流在滤纸上)，A组(Blank)不做任何治疗处理，B组用实施例1制得的水凝胶CS-TBA-EPL-0，C组用实施例3制得的CS-TBA-EPL-10覆盖出血区域(水凝胶量不宜过多，覆盖即可)。记录经过上述处理后的0s、20s、40s、60s后的兔肝脏的出血情况，结果如图7，A组不做任何处理，随着时间延长，出血量增加，而B组施用了CS-TBA-EPL-0水凝胶后，出血的地方明显缩小，出血量逐渐变少，C组施用了CS-TBA-EPL-10水凝胶后，出血量进一步减少。60s后各组的出血量(Massing Bleeding)如图8所示，A组(控制对照组，Control)、B组、C组的出血量分别为910.67mg、346.67mg、83.33mg。说明施用了本发明制得的水凝胶后，有助于缩小出血的地方，减少出血量。

7、抑菌能力测试

分别取1mL实施例1-3制得的水凝胶于玻璃瓶中，再加入400μL浓度为1×10

与实施例1相比，对比例1采用的罗非鱼皮明胶的抑菌性能较差，且对比例1制得水凝胶的过程中需要加入强碱(NaOH)，形成水凝胶的过程耗时180分钟。但是本发明水凝胶制备过程不仅不需要添加强碱，而且还能够快速交联，在5分钟内即可完成交联。

与实施例1相比，对比例2采用的壳聚糖需要在酸性条件下溶解，反应条件并不温和，而且由于所形成的水凝胶不具有流动性，因此该凝胶不可注射，形成水凝胶耗时24小时，无法实现快速愈合伤口的目的。