A基因型嵌合腮腺炎病毒株和制备方法及用途

技术领域

本发明涉及病毒基因工程技术领域，具体涉及一种A基因型嵌合腮腺炎病毒株和制备方法及用途。

背景技术

流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒(Mumps virus，MuV)引起的一种急性呼吸道传染病。其主要临床症状为发热、腮腺非化脓性肿痛；部分病理还会继发无菌性脑膜炎、胰腺炎、睾丸炎等；症状严重者可导致伤残或者死亡。流行性腮腺炎在我国属于法定管理的丙类传染病。当前，疫苗的预防接种仍然是该病的重要有效的预防和控制手段。

MuV属于副粘病毒科腮腺炎病毒属，包膜RNA病毒。其病毒粒子是由其核心的基因组RNA与各结构蛋白直接或间接的相互作用形成不规则的球状；病毒粒子的直径因毒株的不同或者培养条件的差异而有显著区别，直径大约100-600nm。其基因组共编码N，P，M，F，HN，SH和L蛋白等结构蛋白。

尽管MuV只有一个血清性，但是根据其SH基因的不同，MuV被分为众多的基因型，包括A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M和N在内的共计12个。现有的研究发现，全球各地流行的MuV具有显著的地域性特点；同时各种不同基因型之间的交叉保护能力不完全一致。

每个新的流行型的出现，均会考验对现有疫苗的有效性，为了能够快速获得既能对当前的流行株进行保护，又能对即将来临的流行株进行保护，为此，本发明提供了A基因型嵌合腮腺炎病毒株和制备方法及用途，对A基因型腮腺炎病毒有更优的保护效果。

发明内容

因此，本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种A基因型嵌合腮腺炎病毒株和制备方法及用途，对A基因型腮腺炎病毒有更优的保护效果。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供了一种A基因型嵌合腮腺炎病毒株，以腮腺炎病毒株为骨架，将所述腮腺炎病毒株中的血凝素-神经氨酸酶蛋白编码基因HN替换为包含A基因型腮腺炎病毒的血凝素-神经氨酸酶蛋白编码基因HN的核苷酸序列，包含A基因型血凝素-神经氨酸酶蛋白编码基因HN的cDNA核苷酸序列具有如下(a)-(c)中的任意一种：

(a)具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其互补链；或

(b)在(a)中的如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个或几个的核苷酸得到的A基因型嵌合腮腺炎病毒株，且可诱发哺乳动物对A基因型腮腺炎病毒的免疫反应；或

(c)具有与(a)中的如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列同源性≥85％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，例如，≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)的核苷酸序列，得到的A基因型嵌合腮腺炎病毒株，且可诱发哺乳动物对A基因型腮腺炎病毒的免疫反应。

可选的，所述腮腺炎病毒株为腮腺炎疫苗株QS-F-SH2、QS-F或Hoshino等腮腺炎疫苗株。

可选的，所述A基因型嵌合腮腺炎病毒株命名为腮腺炎病毒QS-F-HN[A]，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.V202286，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编:430072，保藏日期为2022年12月17日。

生物材料，包括如下1)-7)中的任意一种：

1)编码所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株的重组DNA分子；或

2)含有所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株或1)中所述的重组DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；或

3)含有所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株的重组病毒；或

4)含有所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株或其传代培养病毒或3)中所述的重组病毒或其传代培养病毒的疫苗；或

5)含有所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株或其传代培养病毒或3)中所述的重组病毒或其传代培养病毒的疫苗组合物；或

6)含有所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株或其传代培养病毒或3)中所述的重组病毒或其传代培养病毒的联合疫苗；或

7)含有所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株或其传代培养病毒或3)中所述的重组病毒或其传代培养病毒的免疫原性制剂。

可选的，所述疫苗为活疫苗或病毒样颗粒。

可选的，所述疫苗组合物还包括药学上可接受的载体。

一种所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株的制备方法，包括如下步骤：

构建所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株的全长cDNA的质粒；

所述A基因型嵌合腮腺炎病毒株的拯救。

可选的，所述A基因型嵌合腮腺炎病毒株的拯救步骤包括如下步骤：

将所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株的全长cDNA的质粒与腮腺炎相关辅助质粒共转染至宿主细胞中；

培养所述宿主细胞，然后洗涤，换液，继续培养，将细胞进行传代的同时加入新的细胞，继续培养，直至细胞出现融合病变，收集细胞培养上清。

可选的，所述腮腺炎相关辅助质粒为分别包含腮腺炎病毒中的N基因、P基因和L基因的质粒；

可选的，所述腮腺炎相关辅助质粒为pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L。

可选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述新的细胞为哺乳动物细胞。

可选的，所述宿主细胞为BSR-T7/5细胞，所述新的细胞为Vero细胞。

一种腮腺炎活疫苗，包括：

所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株；或

所述的生物材料；或

所述的制备方法制备得到的A基因型嵌合腮腺炎病毒株。

可选的，还包括疫苗上可接受的载体或佐剂。

如下(1)-(4)任一项在制备疫苗制剂中的用途。

(1)所述的A基因型嵌合腮腺炎病毒株；或

(2)所述的生物材料；或

(3)所述的制备方法制备得到的A基因型嵌合腮腺炎病毒株；或

(4)所述的腮腺炎活疫苗。

可选的，所述用途为制备预防腮腺炎病毒的疫苗制剂中的用途。

可选的，所述腮腺炎病毒包括A基因型腮腺炎病毒和/或F基因型腮腺炎病毒。

可选的，所述用途为制备经肌肉、腹腔、皮下施用的疫苗制剂。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种A基因型嵌合腮腺炎病毒株，以腮腺炎病毒株为骨架，将所述腮腺炎病毒株中的血凝素-神经氨酸酶蛋白编码基因HN替换为包含A基因型腮腺炎病毒的血凝素-神经氨酸酶蛋白编码基因HN的核苷酸序列；本发明通过以现有的腮腺炎毒株(如QS-F)为骨架，分别将其免疫原性蛋白HN替换为A基因型相关蛋白HN，构建的A基因型嵌合腮腺炎病毒株，对A基因型腮腺炎病毒有更优的保护效果，可同时对其他基因型病毒提供有效的保护。

本发明的A基因型嵌合腮腺炎病毒株命名为腮腺炎病毒QS-F-HN[A]，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编:430072，保藏编号为CCTCC NO.V202286，保藏日期为2022年12月17日。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中A基因型嵌合腮腺炎病毒株QS-F-HN[A]的嵌合腮腺炎病毒骨架图；

图2是本发明目的质粒pAC-rMuV-HN(JL)酶切鉴定结果；

图3是本发明实验例1中A基因型嵌合腮腺炎病毒株QS-F-HN[A]、QS-F、JL株病毒在体外的生长特性。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

腮腺炎毒株QS-F及其全长质粒pAC-MuV参见专利文献CN111019910A。

腮腺炎毒株QS-F-SH2参见专利文献CN111019910A。

pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-L均参见专利文献CN111019910A。

下述实施例中的DMEM培养基是Gibco公司成品的DMEM培养基，货号：8121419。

实施例1A基因型嵌合腮腺炎病毒全长cDNA的质粒的构建

本实施例提供了A基因型嵌合腮腺炎病毒全长cDNA的质粒的构建方法，包括如下步骤：

(1)、使用Pml和Apa I酶切pAC-MuV获得载体片段(14399bp)，备用；

(2)、片段1(F1)的制备：以F基因型腮腺炎全长质粒pAC-MuV为模板，用引物SH-F-F-1(如SEQ ID NO.2所示)及HN-F-R-1(如SEQ ID NO.3所示)(可参见下表)扩增获得片段1(1550bp)；

片段2(F2)的制备：以包含A基因型腮腺炎病毒的血凝素-神经氨酸酶蛋白的编码基因HN的cDNA序列(采用JL株的cDNA，GenBank:AF338106.1)为模板，用引物HN-F-F-2(如SEQ ID NO.4所示)，HN-F-R-2(如SEQ ID NO.5所示)(见下表)扩增获得片段2(1781bp)；

片段3(F3)：以F基因型腮腺炎全长质粒pAC-MuV为模板，用引物HN-F-F-3(如SEQID NO.6所示)，SH-F-R-3(如SEQ ID NO.7所示)(见下表)扩增获得片段3(246bp)；

(3)、随后将以上述获得的3个片段为模板，用引物SH-F-F-1及SH-F-R-3进行重叠PCR获得融合片段(3510bp)，重叠PCR反应体系见下表，PCR反应程序为：预变性95℃3min；变性95℃10sec；退火60℃30sec；延伸72℃3min；彻底延伸72℃10min；(2～4 35个循环)。将获得的融合片段使用Pml I和Apa I双酶切得到目的片段(3460bp)，通过T4连接酶将步骤(1)中获得的载体和目的片段连接，进行连接获得目的质粒，如图1所示的嵌合腮腺炎病毒骨架图。用限制性内切酶Bsiw I和Sap I将得到的质粒进行酶切鉴定，可将pAC-rMuV-HN(JL)质粒酶切成两段，分别为14898bp和2962bp(如图2)，由酶切结果可知，pAC-rMuV-HN(JL)全长质粒构建成功。

表1重叠PCR反应体系

表2扩增用引物信息

实施例2嵌合病毒拯救

采用Sigma去内毒素试剂盒大量提取pAC-rMuV-HN(JL)全长克隆和辅助质粒，共转染到细胞中进行病毒拯救。具体过程如下：

(1)、将BSR-T7/5细胞接种于六孔板中过夜培养，培养条件为37℃培养，5％CO

(2)、将全长质粒pAC-rMuV-HN(JL)(7μg)、pcDNA3.1-N(1.5μg)、pcDNA3.1-P(0.2μg)、pcDNA3.1-L(1.0μg)与LipofectamineTM 2000转染试剂(Invitrogen公司的，货号：11668019)(12μL)混合于500μL DMEM培养基中，37℃孵育20min，得到质粒转染试剂混合物；

(3)、选择步骤(1)中细胞汇合度80-90％的细胞孔，用PBS洗涤细胞3次，而后将步骤(2)中的质粒转染试剂混合物加入洗涤后的细胞中，37℃、5％CO

(5’-ATGGAGCCCTCGAAACTATTCATAATGTCGGACAATGCCACCTTT

GCACCTGGACCTGTTGTTAATGCGGCTGGTAAGAAGACATTCCGAACC

TGTTTCCGAATATTGGTCCTATCTGTACAAGCAGTTATCCTTATATTGGT

TATTGTCACTTTAGGTGAGCTTATTAGGATGATCAATGATCAAGGCTTG

AGCAATCAGTTGTCTTCAATTACAGACAAGATAAGAGAATCAGCTGCT

GTGATTGCATCTGCTGTGGGAGTAATGAATCAAGTTATTCATGGAGTA

ACGGTATCCTTACCTCTACAAATTGAGGGTAACCAAAATCAATTATTAT

CCACACTTGCTACAATCTGCACAAACAGAAATCAAGTCTCAAACTGC

TCCACAAACATCCCCTTAATTAATGACCTTAGGTTTATAAATGGAATCA

ATAAATTCATCATTGAAGATTATGCAACCCATGATTTCTCCATCGGCCA

TCCACTTAACATGCCTAGCTTTATCCCCACTGCAACCTCACCCAATGGT

TGCACGAGAATTCCATCCTTTTCTTTAGGTAAGACACACTGGTGTTAC

ACACATAATGTAATTAATGCCAACTGCAAGGATCATACTTCATCCAACC

AATATGTTTCCATGGGGATTCTTGCTCAAACCGCGTCAGGGTATCCCAT

GTTCAAAACCCTAAAAATCCAATATCTCAGTGATGGCCTGAATCGGAA

AAGCTGCTCAATTGCAACAGTCCCTGATGGTTGCGCGATGTACTGTTA

CGTTTCAACTCAACTTGAAACCGACGACTATGCGGGGTCCAGCCCAC

CTACCCAGAAACTTATCCTGTTATTCTATAATGACACCATCACAGAAAG

GACAATATCTCCATCTGGTCTTGAAGGGAATTGGGCTACTTTGGTGCC

AGGAGTGGGGAGTGGAATATATTTCGAAAATAAGTTGATCTTTCCTGC

ATACGGGGGTGTATTGCCCAATAGTACACTAGGAGTTAAATTAGCAAG

AGAATTTTTCCGGCCCGTTAATCCATATAATCCATGTTCAGGACCACAA

CAAGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAGATCATATTTCCCAAGTTACTTCT

CTAGTCGACGGGTACAGAGTGCATTTCTGGTCTGTGCTTGGAATCAGA

TCCTAGTTACAAATTGCGAGCTAGTTGTCCCCTCAAACAATCAGACAC

TGATGGGTGCAGAAGGAAGAGTTTTATTGATCAACAATCGACTATTATA

TTATCAGAGGAGTACTAGCTGGTGGCCGTATGAACTCCTCTATGAGATA

TCATTCACATTTACAAACTACGGTCAATCATCTGTGAATATGTCCTGGA

TACCTATATATTCATTCACTCGTCCTGGTTCGGGCCACTGCAGTGGTGA

AAATGTATGCCCAATAGTCTGTGTATCAGGAGTTTATCTTGATCCCTGG

CCATTAACTCCATACAGACACCAATCAGGCATTAACAGAAATTTCTATT

TCACAGGTGCACTGCTAAATTCAAGCACAACCAGGGTGAATCCTACA

CTTTATGTCTCTGCCCTTAATAATCTTAAAGTACTAGCCCCATATGGTAC

TCAAGGATTGTTTGCTTCATACACCACAACCACCTGCTTTCAAGATAC

CGGCGACGCCAGTGTGGATTGTGTCTATATTATGGAACTGGCATCGAAT

ATTGTTGGAGAATTCCAAATCCTACCTGTGCTAACCAGACTGACCATCACTTGA-3’))一致，表明病毒拯救成功。所述A基因型嵌合腮腺炎病毒株命名为腮腺炎病毒QS-F-HN[A]，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编:430072，保藏编号为CCTCC NO.V202286，保藏日期为2022年12月17日。

实验例1嵌合病毒在体外的生长特性

为了评估嵌合病毒在体外的生长特性。具体过程如下：

将实施例2中获得的A基因型嵌合腮腺炎QS-F-HN[A]病毒液、QS-F病毒液、JL株病毒液分别以0.01MOI的量悬浮接种六孔细胞培养板中(Vero细胞，细胞量为8×10

实验例2嵌合病毒在体外的免疫原性评价

评估A基因型嵌合腮腺炎病毒株QS-F-HN[A]免疫原性。

实验方法：

选取SPF级6-8周小鼠30只，随机分成3组即A、B、C，每组10只。A组接种腮腺炎JL株，B组接种腮腺炎病毒QS-F，C组接种实施例2中获得的A基因型嵌合腮腺炎病毒QS-F-HN[A]。每组接种部位为肌肉注射，接种剂量为10

腮腺炎病毒中和抗体测定方法：在96孔板中加入50μL的样稀(Gibco的DMEM基础培养基)；使用96孔板进行稀释(2倍稀释)，平行4孔，按照50μL样稀和50μL待检血清混合进行稀释，稀释比例为1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512，1:1024，1:2048；稀释比例为1：2048的待检血清作为待检血清阴性对照(50μL)，加入50μL样稀代替病毒，混匀。将不同稀释比例的待检血清(50μL)作为试验组，每孔加入50μL的1000CCID

实验结果：

结果如下表所示。

表3、免疫原性评价结果

从上表所示，比较对A基因型病毒的中和效果，A组(JL)和C组(QS-F-HN[A])显著高于B组(QS-F)(P≤0.05，P≤0.05)，即将F基因型腮腺炎病毒的HN替换成A基因型的HN得到QS-F-HN[A]，其对A基因型病毒的中和效果显著优于亲本病毒QS-F；比较各组对F基因型病毒的中和效果，C组(QS-F-HN[A])和B组(QS-F)显著高于A组(JL)(P≤0.05(C组)，P<0.0001(B组))。即将F基因型的腮腺炎病毒的HN替换成A基因型的HN得到的QS-F-HN[A]，其对A基因型病毒的中和效果显著优于亲本病毒QS-F，其对F基因型病毒的中和效果优于A基因型疫苗株JL；即QS-F-HN[A]即能提供对A基因型病毒的保护也能提供对F基因型病毒的保护。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。