用于DNA扩增并标记的标签发夹引物

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，特别涉及用于DNA扩增并标记的标签发夹引物。

背景技术

对于DNA的扩增，现有技术多采用序列特异引物或随机引物进行聚合酶链反应(PCR)或等温扩增，尚未见公开能在DNA扩增的同时使用DNA序列标签对扩增产物进行标记的技术。

采用序列特异引物或随机引物进行PCR，主要用于DNA模板含量较高的DNA扩增，采用序列特异引物或随机引物进行等温扩增，则适用于DNA模板含量较低的DNA扩增；如果待扩增的DNA模板序列是已知的，则采用序列特异引物进行扩增(序列特异引物通常为线性结构)；如果待扩增的DNA模板序列是未知的，可采用随机引物进行扩增(引物是线性结构)。

上述现有技术中，采用的序列特异引物或随机引物不能在DNA扩增的同时使用DNA序列标签对扩增产物进行标记，这是因为：

1)线性结构的序列特异引物在其5’端加上一段DNA序列标签后，会影响序列特异引物与模板DNA结合，进而不能进行PCR或等温扩增，同时也不能进行标记，进而无法完成对模板DNA的全长序列测序。

2)线性结构的随机引物在其5’端加上一段未知DNA序列标签后，会导致随机引物不能与模板DNA结合，进而不能进行PCR或等温扩增，同时也不能进行标记，进而无法完成对模板DNA的全长序列测序。

发明内容

针对背景技术中的技术问题，本发明的目的在于提供了用于DNA扩增并标记的标签发夹引物，该标签发夹引物能够同时进行模板DNA的扩增与标记，可用于序列未知或已知的、低浓度的模板DNA的等温扩增，以获得模板DNA的全长序列。解决了现有技术中序列特异引物或随机引物不能在DNA扩增的同时使用DNA序列标签对扩增产物进行标记的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第一方面提供了用于DNA扩增并标记的标签发夹引物，包括5’端为具有2个或2个以上的发夹结构的DNA标签序列和6碱基随机引物。

优选地，所述标签发夹引物中的发夹结构与6碱基随机引物直接连接。

优选地，所述标签发夹引物中的发夹结构与6碱基随机引物通过碱基连接，碱基的个数可以但不限定于2个、4个。

本发明的第二方面提供了利用上述的标签发夹引物进行的DNA扩增并标记的方法，包括以下步骤：

S1、从待检样品中提取DNA，作为模板DNA；

S2、利用标签发夹引物和等温扩增反应体系将模板DNA进行等温扩增反应，获得带有标签的等温扩增产物。

优选地，步骤S2中，所述等温扩增反应体系的组成包括：模板DNA、Phi29聚合酶、反应缓冲液、dNTP、标签发夹引物、无核酸超纯水。

优选地，所述等温扩增反应程序为：30℃，3-6h；65℃，10min；4℃保温。

优选地，所述待测样品来源于环境DNA，人及动植物的组织细胞、血液、体液，或者微生物中的病毒、细菌、古细菌等。

本发明的第三方面在于提供将上述标签发夹引物应用于未知序列或者已知序列的模板DNA的扩增并标记后测序，获得模板DNA全长序列。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明设计出了用于模板DNA的扩增并标记的标签发夹引物，该标签发夹引物可用于序列未知或已知的、低浓度的DNA模板的等温扩增，DNA模板可来源于环境DNA，人及动植物的组织细胞、血液、体液，微生物中的病毒、细菌、古细菌等。例如可通过等温扩增完成对单个病毒基因组DNA的扩增并标记，测序后，可获得单个病毒的全基因组序列。解决了现有技术中序列特异引物或随机引物不能在DNA扩增的同时使用DNA序列标签对扩增产物进行标记的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中设计的标签发夹引物的结构图；

图2为对虾白斑综合症病毒(WSSV)基因组DNA的等温扩增与PCR验证结果图(泳道M：DNA Marker；泳道1：采用标签发夹引物对无核酸超纯水进行等温扩增结果；泳道2：对无核酸超纯水等温扩增产物采用WSSV特异性引物Primer1进行PCR扩增结果；泳道3：对无核酸超纯水等温扩增产物采用WSSV特异性引物Primer2进行PCR扩增结果；泳道4：对无核酸超纯水等温扩增产物采用WSSV特异性引物Primer3进行PCR扩增结果；泳道5：采用标签发夹引物对每微升含有10个病毒粒子裂解释放的病毒DNA进行等温扩增结果；泳道6：对每微升含有10个病毒粒子裂解释放的病毒DNA的等温扩增产物采用WSSV特异性引物Primer1进行PCR扩增结果；泳道7：对每微升含有10个病毒粒子裂解释放的病毒DNA的等温扩增产物采用WSSV特异性引物Primer2进行PCR扩增结果；泳道8：对每微升含有10个病毒粒子裂解释放的病毒DNA的等温扩增产物采用WSSV特异性引物Primer3进行PCR扩增结果)。

具体实施方式

以下描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本发明实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本发明。

实施例1

一、实验材料和方法

1.实验材料及试剂

对虾白斑综合症病毒(WSSV)、标签发夹引物(100μM)、Annealing Buffer for DNAOligos(5×)、蛋白酶K、reaction buffer、无核酸超纯水、dNTP、Phi29聚合酶、WSSV基因组特异性引物三对(Primer1，5’-GAACTCCTGGCAAGGTATT-3’和5’-GGTGTATCGTCAGCAAGAA-3’；Primer2，5’-CCTTAGGCGAGTCATGTT-3’和5’-TTGGTTGTGGTTGTGGAT-3’；Primer3，5’-TGACTGCTGAGGTTGGAT-3’和5’-GAAGGAGGAGGTGTTGGA-3’)。

2.实验方法

2.1设计带有发夹结构的标签发夹引物

利用碱基互补配对的原理，分别设计能形成2个或4个发夹结构的DNA标签序列，将发夹结构与人为设计的6碱基随机引物(序列为3＇-NNNNNNN)连接，形成具有发夹结构的标签发夹引物，如图1所示。

2.2获得发夹结构的标签发夹引物

对设计的标签发夹引物进行高温退火处理，退火体系组成为：40μl标签发夹引物(100μM)、10μl Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)。所需退火程序为95℃、5min；每1min下降1℃，降至25℃；4℃保温，最终得到具有发夹结构的标签发夹引物。

2.3等温扩增、标记和验证

2.3.1采用获得的标签发夹引物对对虾白斑综合症病毒(WSSV)的病毒基因组DNA进行等温扩增并标记：

具体步骤为：纯化获得对虾白斑综合症病毒(WSSV)的病毒粒子，并作为DNA模板，将WSSV病毒无限稀释直到每微升含10个病毒颗粒；通过蛋白酶K(56℃，1h)裂解病毒，释放DNA；在PCR管中加入1μl DNA模板、1μl reaction buffer(反应缓冲液)和4μl无核酸超纯水，95℃反应3min；冰上放置10min；在第一步反应物中加入2.5μl完成高温退火处理的标签发夹引物(100μM)、1μldNTP(100μM)和0.5μl Phi29聚合酶，30℃，3-6h；65℃反应10min使聚合酶失活。同时，设置无核酸超纯水为阴性对照，按上述相同的步骤采用蛋白酶K(56℃，1h)处理；在PCR管中加入1μl无核酸超纯水模板、1μl reaction buffer和4μl无核酸超纯水，95℃反应3min；冰上放置10min；在第一步反应物中加入2.5μl完成高温退火处理的标签发夹引物(100μM)、1μl dNTP(100μM)和0.5μl Phi29聚合酶，30℃，3-6h；65℃反应10min使聚合酶失活。

2.3.2等温扩增产物的PCR验证

根据WSSV基因组上的不同位置共设计三对WSSV特异性引物(Primer1、Primer2、Primer3)，将等温扩增后的产物作为模板进行PCR验证，如果采用这三对引物进行PCR，都可得到PCR产物，则表明等温扩增产物覆盖WSSV全长基因组。所用PCR体系为：0.5μlDNA模板、6μl Taq酶、4.5μl无核酸超纯水、0.5μl WSSV特异性引物前引、0.5μl WSSV特异性引物后引。所用PCR程序为：95℃，5min；35个循环(95℃，10s；55℃，30s；72℃，40s)；72℃，10min；4℃保温。

如图2所示，泳道1-4为用无核酸超纯水为模板的阴性对照，泳道1为采用标签发夹引物对无核酸超纯水进行等温扩增结果，泳道2-4为对无核酸超纯水的等温扩增产物分别采用三对WSSV特异性引物进行PCR扩增结果(泳道2采用Primer1、泳道3采用Primer2、泳道4采用Primer3)；泳道5为采用标签发夹引物对每微升含有10个病毒粒子裂解释放的病毒DNA进行等温扩增结果；泳道6-8为对每微升含有10个病毒粒子裂解释放的病毒DNA的等温扩增产物分别采用三对WSSV特异性引物进行PCR扩增结果(泳道6采用Primer1、泳道7采用Primer2、泳道8采用Primer3)。

由图2结果可知，利用本发明标签发夹引物，在将病毒稀释至每微升含有10个病毒粒子进行等温扩增时，可获得低浓度模板的等温扩增产物；分别采用三对WSSV特异性引物进行PCR验证，都可得到对应片段条带(泳道5-8)，表明等温扩增产物覆盖WSSV全长基因组；因此，采用本发明设计的标签发夹引物进行等温扩增，可对WSSV基因组进行扩增并标记。对比阴性对照(泳道1-4)，阴性对照泳道上没有看到DNA条带，说明无等温扩增产物，分别采用三对WSSV特异性引物对等温扩增产物进行PCR验证，也无明显条带，说明本发明设计的标签发夹引物不能对无核酸超纯水的模板进行扩增和标记。综上，上述实验结果表明本发明设计的标签发夹引物可用于低浓度WSSV的DNA扩增与标记。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所做出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。