一种拟南芥LncRNA44及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程领域，特别涉及一种拟南芥LncRNA44及其应用。

背景技术

全球变暖已经导致了极端高温等气候的变化，高温胁迫成为日益严重的粮食安全问题。高温胁迫可以在植物生长的任何阶段影响它们，但是某些生长阶段比其他阶段对热更敏感。在植物早期建立、开花和配子体发生的热敏发育时期，热应激会产生强烈的负面影响，而在作物中，这一影响更具有危害性。

超过临界阈值的高温会引起热应激，此时叶片光合作用会受到损害甚至完全停止，从而影响植物的生长、发育和产量。高温来临导致光系统II的反应中心结合蛋白D1降解，从而抑制PSII甚至使其失活。同时，高温还会破坏植物叶绿体的结构、降解叶绿素、降低CO2的溶解度、降低1,5-二磷酸核酮糖羧化酶对CO2的亲和力以及光合系统中关键组分的热稳定性,这些都会影响植物的光合速。

高温胁迫通过直接影响呼吸酶的酶活，从而影响植物的呼吸作用。高温能够促进与呼吸作用有关的酶的钝化，导致其不可逆的失活，而且能够提高生物合成、运输和蛋白质周转速率而导致能量需求增加。呼吸作用也可以降解、清除高温胁迫下体内一些有害物质，同抗热性有较密切的关系，可以在一定程度上减轻高温逆境的危害。

高温胁迫能够改变细胞中的膜脂组成，导致蛋白质变性，还会破坏内质网、高尔基体和线粒体等内膜系统的结构完整性，改变膜上离子载体的种类和作用方式，最终导致膜的选择性吸收丧失、电解质渗漏、相对电导率增加；高温也会造成细胞膜上的膜脂的过氧化。植物在高温下产生的各种活性氧分子(单线态氧、过氧化物自由基、超氧自由基和羟基自由基等)，将膜脂中的不饱和脂肪酸过氧化为高活性的脂膜过氧化物丙二醛(MDA)，产生的MDA可以交联核酸、脂类、蛋白质及糖类，并与酶蛋白发生链式聚合反应，使酶失活，从而对植物体造成伤害，影响植物的正常生长。

此外，植物在高温胁迫下能够发生许多生理生化变化，包括活性氧(ROS)积累、离子泄漏、脂质过氧化、蛋白质变性和聚集、氧化还原失衡、氧化应激和细胞结构破坏等。

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是指一类长度超过200bp的不具有蛋白编码功能的RNA。lncRNA在空间和时间上都有表达。lncRNAs的分类主要取决于其相对于mRNA的位置，如内含子lncRNAs、增强子lncRNAs、基因间lncRNAs、转录伪基因lncRNAs和反义lncRNAs。研究发现，lncRNA是具有生物学功能的。

在不同的植物物种中，lncRNAs被发现与许多植物发育功能相关，如侧根发育、春化、光形态建成、花粉发育、植物育性、纤维发育和结节形成。此外，lncRNA通过四种可能的机制调控植物发育:组蛋白和染色质修饰、转录调控、miRNA靶模拟和翻译后变化的改变RNA的生物学功能和作用机制的研究主要集中在模式植物方面，在除水稻外的作物中研究较少。

发明内容

本发明提供了一种拟南芥LncRNA44及其应用，并经过实验验证，其具有提高拟南芥抗高温性能中的效果。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种拟南芥LncRNA44，所述LncRNA44的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种重组载体，其中包含原始载体和所述的拟南芥LncRNA44；所述原始载体为PBI121表达载体。

本发明还提供了一种重组菌株，其中包含所述的拟南芥LncRNA44；所述重组菌株为农杆菌GV3101。

本发明还提供了一种引物对，其组成为：

正向引物：正向引物：5’-acgggggactctagaggatccACGCTCCACATGTATCTTCACTGG-3’；

反向引物：5’-cgatcggggaaattcgagctcTCTGTTTTGACATTACAATTTTTATTTCC-3’。

本发明还提供了一种所述的拟南芥LncRNA44的扩增方法，包括以下步骤：提取拟南芥的基因组DNA，并以此为模板，以正向引物：正向引物：5’-acgggggactctagaggatccACGCTCCACATGTATCTTCACTGG-3’；反向引物：5’-cgatcggggaaattcgagctcTCTGTTTTGACATTACAATTTTTATTTCC-3’为引物，通过PCR方法扩增获得所述的拟南芥LncRNA44。

本发明还提供了一种试剂盒，其中包含所述的引物对，用于扩增和/或检测核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的拟南芥LncRNA44。

本发明还提供了所述的拟南芥LncRNA44，或所述的重组载体，或所述的重组菌株在提高植物高温耐受性中的应用。

进一步的，通过提高所述拟南芥LncRNA44的在植物中的表达水平，提高植物种子萌发的高温抗性。

本发明还提供了所述的拟南芥LncRNA44，或所述的重组载体，或所述的重组菌株在在调节植物生长中的应用。

本发明还提供了所述的拟南芥LncRNA44，或所述的重组载体，或所述的重组菌株在重组菌株在筛选和/或培育抗高温植物中的应用。

进一步的，所述植物为拟南芥。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明通过CTAB法提拟南芥基因组，以拟南芥DNA为模板，通过特异引物进行PCR扩增，回收纯化PCR产物，并测序得到LncRNA44基因，将其连接于表达载体上，并利用农杆菌侵染法转化拟南芥，实验证实，LncRNA44能够显著提高转基因拟南芥种子萌发的高温抗性。本发明所述的LncRNA可为培育农作物新品种提供发自按理论依据和基因来源，有助于从根本上改善经济作物的抗高温性能。

附图说明

图1是LncRNA44的二级结构。

图2是野生型拟南芥、转基因拟南芥及突变体拟南芥经过处理后种子萌发情况；其中，Col-0代表野生型拟南芥，OE3、OE4代表转基因拟南芥，lnc44代表突变体拟南芥。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：拟南芥LncRNA44的克隆

1、提取拟南芥基因组。

2、LncRNA44基因的PCR扩增：以提取的拟南芥基因组DNA为模板，根据LncRNA44基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

所用引物为：

正向引物：5’-acgggggactctagaggatccACGCTCCACATGTATCTTCACTGG-3’(SEQ IDNo.2)；

反向引物：5’-cgatcggggaaattcgagctcTCTGTTTTGACATTACAATTTTTATTTCC-3’(SEQID No.3)。

3、PCR反应体系和扩增条件如下表：

4、纯化的PCR扩增产物送交生工公司进行测序，得到拟南芥LncRNA44的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。拟南芥LncRNA44位于5号染色体上，基因长度为1300bp左右，二级结构主要由三个大的茎环结构组成(图1)。

回收和纯化PCR扩增产物的具体操作如下：凝胶电泳后，用干净的刀片将带有目的片段(1300bp左右)的胶切割下来，放入到离心管中，胶不要切得过大，以避免回收时DNA片段溶液含有大量的杂质。向离心管中加入等体积的XP2(BindingBuffer)溶液(体积/胶质量)后，在55℃条件下温浴10min，直到胶完全融化；将离心管中的溶液移到2ml的吸附柱中，离心1min，弃去液相；再次向吸附柱中加入0.5ml的XP2溶液，离心1min，弃去液相；向吸附柱加入0.70ml的SPW Wash Buffer溶液，离心1min，弃去液相；再次加入0.70ml的SPW WashBuffer溶液，离心1min，弃去液相；再次离心1min后，将吸附柱放置在一个新的离心管上，静置10min，加入30μl的溶解液，静置1min，最后离心1min，得到的液相即为回收的DNA溶液。

实施例2：重组表达载体的构建与转基因植物的制备

1、重组表达载体的构建

将实施例1克隆得到的LncRNA44基因通过同源重组连接到双子叶植物双元表达载体PBI121中。反应产物转化大肠杆菌后涂板、筛选阳性克隆、提取质粒，得到重组质粒PBI121-LncRNA44。

lnc44突变体是利用artificial microRNAs的方式将LncRNA44沉默，其microRNA序列为TAATTCGTTTATCATCCGCCG(SEQ ID No.4)，microRNA*序列为CGACGGATGATAATCGAATTT(SEQ ID No.5)，其连接的表达载体为PBI121，具体基因合成以及表达载体构建由上海生工生物工程有限公司完成。

2、农杆菌转化

冰浴融化农杆菌GV3101感受态细胞；加入2μL重组质粒PBI121-LncRNA44以及PBI121-lnc44，冰浴30min，液氮中冻1min，然后在37℃水浴5min；加入950μL无抗生素的YEP培养基，28℃，220rpm，振荡培养4h；10000rpm离心1min以浓缩菌液，用100μL YEP回溶菌体；将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的固体YEP培养基上，28℃培养36～48h。菌液PCR检测阳性克隆，得到重组菌株GV3101-LncRNA44和GV3101-lnc44。

3、培养转基因植株

分别挑取重组菌株GV3101-LncRNA44和GV3101-lnc44的单菌落，加入6mL LB(Kan)培养基中，培养过夜；室温下，6000rpm，离心5min，收集菌体；用8～10mL侵染液(5％蔗糖，0.03～0.05％silwetL)悬浮菌体，混匀；将拟南芥的花序浸到侵染液中，侵染10～15s，然后将拟南芥取出放入暗箱中，上面覆膜，黑暗培养12h；将拟南芥取出，在长日照下正常培养，每隔5～7d侵染一次，一般侵染3～4次；收获侵染后成熟的拟南芥种子，干燥后储存。

4、转基因植物筛选

选取拟南芥种子，用70％乙醇消毒5min，再用2.6％的NaClO消毒10min，用无菌水漂洗3～5遍，除净残留的NaClO溶液；将消毒的拟南芥种子平铺到含有50mg/L Kan的1/2MS培养基上，4℃黑暗处理2d；成层处理后，将培养皿置于光照培养箱中，22℃，生长7d左右，选取子叶仍为绿色的拟南芥幼苗转移到培养基质中培养；三周后，从每株上选取叶片，提取基因组DNA，进行鉴定，最终得到LncRNA44过表达植株以及lnc44突变体植株。

实施例3：野生型、LncRNA44过表达株系与突变体在高温处理后的生长特性比较。

将实施例2获得的两个LncRNA44过表达株系分别命名为OE3、OE4，突变体为lnc44。将野生型、过表达株系和突变体在4℃层积3天后放入22℃条件下培养，结果参见图2A，几种植株的长势相同，说明LncRNA44基因表达量上升或敲除不会影响植物的正常生长发育过程。野生型、过表达株系和突变体在4℃层积3天后，放入45℃高温下培养20h，再放入22℃条件下培养，结果参见图2B，野生型种子萌发率比过表达株系低，突变体的萌发率则低于野生型的萌发率。这些结果说明LncRNA44基因参与到植物抗高温过程，且LncRNA44过表达植株具有较强的高温胁迫抗性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。