用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及微生物分子标记物领域，具体涉及用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物及其应用。

背景技术

过敏性疾病是一种自身免疫性疾病，在儿童中，过敏症状的发病率在20％左右。目前而言，过敏的诊断主要依靠侵入性的方法，包括皮肤点刺试验和血液免疫球蛋白E(IgE)检测。其中，皮肤点刺试验是将过敏原试剂点刺于挑破的表皮内，以观察反应情况，需要在医生的监视下进行，而且一旦出现过敏反应，处置不当会有生命危险。另一种IgE检测则需要采集儿童的血液方可进行，但只有IgE在体内达到一定浓度时才能被检测到，因此准确率大受影响。因此，以上两种对过敏的判断和检测方法对儿童的伤害性较大。

目前报道的关于无创方式判断过敏性疾病的方法是通过检测尿液中的相关蛋白的表达量进行判断，还有报道通过肠道中的菌群进行诊断食物过敏的方法，但是该方法是停留在小鼠实验阶段，并没有直接进行人群中进行验证，更没有针对儿童过敏进行验证，其准确度还是有待提高的，目前暂时还没有通过粪便样本中的特定菌群来直接判断儿童过敏性疾病的方法和手段，因此，亟需一种能够通过粪便样本中的特定菌群直接对儿童的过敏性疾病进行判断。

发明内容：

发明目的：本发明所要解决的技术问题时提供了一种用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述微生物标志物的特异性片段。

本发明还要解决的技术问题是提供了基于所述特异性片段的特异性引物对。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述微生物标志物、所述特异性片段、所述特异性引物对在制备诊断儿童过敏性疾病的试剂或试剂盒中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种诊断儿童过敏性疾病的试剂盒。

本发明基于微生物标志物我们开发设计出两种细菌的特异性16S核糖体RNA基因片段，然后基于该特异性片段设计开发出每种菌的特异性引物对，经分子实验验证之后，发现该引物对有很好的敏感性和特异性。本发明还提供了通过粪便微生物检测的方法判断儿童过敏风险提供技术基础。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物，其特征在于，其包括Blautia_obeum和Subdoligranulum中的一种或两种。

本发明内容还包括两个微生物标志物Blautia_obeum和Subdoligranulum的获得方法，包括以下步骤：

1)正常儿童粪便样本和过敏儿童粪便样本，提取其中的微生物基因组DNA；

2)PCR扩增16S核糖体rRNA序列的V3-V4区，构建文库并上机进行测序；

3)对测序数据进行处理分析后，对过敏儿童和正常儿童组的细菌丰度进行差异分析，获得微生物标志物Blautia_obeum和Subdoligranulum。

本发明内容还包括用于鉴定所述的微生物标志物的特异性片段，所述Blautia_obeum的16S核糖体核酸区域的特异性片段如SEQ ID NO：1所示，所述Subdoligranulum的16S核糖体核酸区域的特异性片段如SEQ ID NO：2所示。

本发明内容还包括鉴定或扩增所述的特异性片段的引物对，鉴定或扩增Blautia_obeum的16S核糖体核酸区域的特异性片段的引物对包括如下序列：SEQ ID NO：3所示和SEQID NO：4所示；或SEQ ID NO：5所示和SEQ ID NO：6所示；或SEQ ID NO：7所示和SEQ ID NO：8所示。

本发明内容还包括鉴定或扩增所述的特异性片段的引物对，鉴定或扩增Subdoligranulum的16S核糖体核酸区域的特异性片段的引物对包括如下序列：SEQ ID NO：9所示和SEQ ID NO：10所示；或SEQ ID NO：11所示和SEQ ID NO：12所示；或SEQ ID NO：13所示和SEQ ID NO：14所示。

本发明还包括所述微生物标志物的特异性基因片段和特异性引物的获得方法，包括以下步骤：

1)在Silva(v138)数据库中，筛选Blautia_obeum和Subdoligranulum对应的序列；

2)在筛选出的序列中寻找各序列共有的基因片段(18～25bp)组成引物候选集；

3)在整个Silva参考数据库中，将每个候选引物去比对(完全匹配)，如果该引物比对上其他菌种，则将引物从候选中剔除；

4)最后将剩余的引物在16S核糖体RNA全长片段中定位，根据最前和最后的引物位置确定特异性片段基因和引物片段。

本发明内容还包括所述的微生物标志物、所述的特异性片段、所述的特异性引物对在制备诊断儿童过敏性疾病的试剂或试剂盒中的应用。

其中，所述试剂用于检测所述的标志物，所述试剂盒用于诊断儿童是否易患过敏性疾病。

其中，所述应用通过检测受试者样品中所述微生物标志物的细菌丰度是否达到一定阈值，当检测的细菌丰度低于阈值，则该受试者易患过敏性疾病，当检测的细菌丰度高于阈值，则该受试者不易患过敏性疾病；

作为任选地，当Blautia_obeum和Subdoligranulum都能被检测出来，且高于一定阈值，则该受试者不易于患过敏性疾病，当只能检测其中一种或均被能被检测出，但其中一个或两个菌低于阈值，则该受试者易于患过敏性疾病。

其中，所述细菌丰度是基于检测并分析靶向微生物标志物的16S核糖体核酸区域获得，作为任选地，所述微生物标志物Blautia_obeum和Subdoligranulum中的一种或两种。

其中，所述过敏性疾病包括过敏性鼻炎、食物过敏、特异性皮炎、哮喘或特应性喘息。

其中，所述受试者样品包括但不仅限于受试者的粪便，其他和肠道相关的样品也在本发明保护范围之内。

本发明内容还包括一种试剂盒，所述试剂盒包括检测所述的微生物标志物的试剂，作为任选地，所述试剂盒包括所述的特异性片段、所述的引物对。

其中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂，PCR扩增试剂，DNA marker或核酸染料中的一种或多种；所述核酸染料包括但不仅限于SYBR Safe DNA染料。

本发明内容还包括一种判断儿童过敏风险的微生物标志物方法，所述方法包括如下步骤：

1)提取未知是否过敏的儿童粪便微生物的基因组DNA；

2)利用16S测序或RT-PCR方法确定Blautia_obeum和Subdoligranulum的相对含量；

3)根据这两种菌的含量是否达到阈值(0.2％)来判断该儿童患过敏性疾病的风险；当两种菌均达到阈值时，则判断该儿童则为正常儿童；反之则判断该儿童为过敏性疾病患儿。

作为本发明的实施例之一，本发明首先利用已知性别的18名过敏儿童和12名正常儿童的粪便样本，提取他们粪便中微生物的基因组DNA，PCR扩增V3-V4区后构建文库再上机测序；对测序数据进行预处理和生信分析后，使用Silva(v138)对序列进行物种注释，得到Blautia_obeum和Subdoligranulum在两组中有非常显著的差异，既将其作为过敏的微生物标志物。而且两种菌的组合能将过敏组和正常组儿童区分开来。

作为本发明的实施例之一，根据找到的两种微生物标志物，在Silva数据库中寻找这两种菌的特异性16S核糖体RNA基因片段，通过物种内部搜索和物种间扫描的算法，求同存异，获得Blautia_obeum和Subdoligranulum在16S核糖体RNA水平上的特异性基因片段。

作为本发明的实施例之一，对以上的特异性16S核糖体RNA基因片段，设计特异性引物。

综上，本发明通过采取儿童粪便，在实验室环境下提取粪便中微生物的基因组DNA，扩增后利用二代测序技术检测粪便中的两种菌(Blautia_obeum和Subdoligranulum)的含量，从而根据这两种菌的相对丰度水平来预测该儿童的过敏风险。具体地，本发明分别通过对30例样本的微生物16核糖体RNA进行高通量测序，研究过敏儿童和正常儿童肠道细菌组成的区别，成功找到两种微生物标志物用于过敏的判断和鉴定。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：

1)本发明首次发现了Blautia_obeum和Subdoligranulum可以作为微生物标志物对过敏新疾病进行判断，而且基于微生物参考序列数据库设计出来这两种标志菌的特异性基因片段和引物对，该特异性基因片段与引物对及其试剂盒能够准确鉴定这两种菌以及对过敏的判断。

2)本发明首次采用粪便样本中的微生物16S核糖体RNA片段，利用测序或qPCR的方法对其中Blautia_obeum和Subdoligranulum的含量进行检测，完成了对该儿童是否过敏的判断。

3)本发明通过一种无创非侵入的方式，仅需要儿童的粪便即可检测出该儿童的过敏风险。相比传统的皮下点刺和血液IgE检测，该方法操作简单，对儿童体验较好，微生物标志物对过敏鉴定的准确度为100％。本发明为未来儿童过敏的研究提供新的技术基础，为儿童过敏检测提供新的无创非侵入的新方法。

附图说明

图1为Blautia_obeum和Subdoligranulum在过敏组和正常组儿童中丰度的比较；

图2为已知是否过敏儿童在的Blautia_obeum和Subdoligranulum丰度含量分布；

图3为本发明设计的3对引物对3份不同样本中Blautia_obeum和Subdoligranulum扩增的效率；

图4为本发明设计的3对引物对其他细菌(植物乳杆菌、青春双岐杆菌、阿克曼菌和嗜酸乳杆菌)的扩增效率；

图5本发明的鉴定儿童过敏性疾病的流程图。

具体实施方式

实施例1 2岁以上儿童过敏风险的判定

本实施例主要包含以下步骤，即DNA提取、PCR扩增、文库构建、上机测序、测序数据分析，过敏风险判定。

1、利用已知是否过敏的30名儿童粪便为样本(已知性别的18名过敏儿童和12名正常儿童的粪便样本信息如表1所示)，使用土壤微生物DNA抽提试剂盒(OMEGA Soil DNAKit，M5635-02)用于提取微生物的基因组DNA。

表1

/>

2、PCR扩增

微生物RNA含有多个保守区和可变区，这里利用利用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对样本的16S rRNA基因V3-V4区进行PCR扩增。PCR采用NEB Q5DNA高保真聚合酶，体系见表2：

表2

操作过程如下：

将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于98℃预变性30s，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于98℃保持15s使模板变性，然后将温度降到50℃，保持30秒钟，使引物于模板充分退火；在72℃保持30秒钟，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25～27次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持5分钟，使产物延伸完整，4℃保存。

扩增结果进行2％琼脂糖凝胶电泳，用Axygen凝胶回收试剂盒回收目的片段。

3、文库构建

利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit进行建库。首先进行的末端修复过程是利用试剂盒中的的End Repair Mix2将DNA5’端突出的碱基切除，3’端缺失的碱基补齐，同时在5’端加上一个磷酸基团，具体步骤如下：

第一步是DNA5’端突出的碱基切除：

(1)取30ng混好的DNA片段补水至60μL，加入40μL End Repair Mix2；

(2)用枪吹打混匀，并置于PCR仪上30℃孵育30min；

(3)利用BECKMAN AMPure XP beads纯化末端修复体系，最终用17.5μLResuspension buffer洗脱。

第二步是3’端加A，在这一过程中，DNA的3’端会单独加上一个A碱基，以防止DNA片段的自连，同时保证DNA与3’端有一个突出T碱基的测序接头相连，具体步骤如下：

(1)向片段选择后的DNA中加入12.5μL A-Tailing Mix；

(2)用枪吹打混匀，并置于PCR仪上孵育，程序如下：37℃，30min；70℃，5min；4℃，5min；4℃，∞。

第三步是加一个有特异性标签的接头，此过程是为了让DNA最终杂交到Flow Cell上，具体步骤如下：

(1)在已加A的体系中，加入2.5μL Resuspension buffer，2.5μL Ligation Mix和2.5μL DNA adapter Index；

(2)用枪吹打混匀，并置于PCR仪上，30℃孵育10min；

(3)加入5μL Stop Ligation buffer；

(4)利用BECKMAN AMPure XP beads纯化已加接头的体系。

第四步是通过PCR扩增已经加上接头的DNA片段，然后利用BECKMAN AMPure XPbeads纯化PCR体系。

第五步是通过2％琼脂糖凝胶电泳来对文库做最终的片段选择与纯化。

4、上机测序

首先对文库进行质量检验，操作步骤如下：

(1)取1μL文库，在Agilent Bioanalyzer机器上用Agilent High SensitivityDNA Kit对文库做2100质检，合格的文库应该有单一的峰，无接头。

(2)利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上对文库进行定量，合格的文库计算后浓度应在2nM以上。

待质检合格后，进行上机测序。在Illumina NovaSeq机器上利用NovaSeq 6000 SPReagent Kit(500cycles)进行2×250bp的双端测序。首先将需要上机的文库(Index不可重复)梯度稀释到2nM，然后按所需数据量比例混样。混好的文库经0.1N NaOH变性成单链进行上机测序。所上文库量的多少可根据实际情况控制在15-18pM之间。以上测序过程由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

5、测序数据分析

基于DADA2(https：//benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html)的16S扩增子分析流程对测序下机数据进行处理。操作步骤如下：

(1)首先，下机序列经过去接头和拆分得到每个样本的16S rRNA序列，然后经过质量过滤、去噪音、合并以及去除嵌合体过程，得到100％一致性的OTU，或者ASV(AmpliconSequence Variant)。

(2)将ASV序列比对到Silva数据库(v138)得到序列的物种命名。

(3)整合不同参考序列的命名，将注释到同一物种的序列丰度合并为同一物种的丰度；

(4)单个样本中，将物种的丰度转化为相对丰度，即每个物种所占的序列(Read)数量除以该样本总的序列(Read)数量；最终得到每个菌的相对丰度，从中找出Blautis obeum和Subdoligranulum这两种菌的含量，和阈值比较后即可知道过敏风险；我们发现，当相对丰度大于0.2的样本均为正常人群，而小于这个阈值的则均为过敏人群。

6、过敏风险判定

在每个样本中的物种相对丰度分布中，查找Blautia_obeum和Subdoligranulum的相对含量(或相对丰度)，若这两种菌的相对丰度均超过0.2％，则该受试者过敏风险较低，为正常儿童。反之，若这两种菌中，其中之一的相对丰度或两者的相对丰度不超过0.2％，则该受试者过敏风险较高，为过敏儿童。结果如图2所示，根据这两种菌对过敏和非过敏儿童判断的准确率达到100％。

实施例2 Blautia_obeum和Subdoligranulum特异性序列和引物的设计

1、从Silva(v138)数据库中查找所有注释到Blautia_obeum的序列；

2、分别以18bp、20bp、22bp和24bp长度为单位，从序列第一个碱基开始，每次往后移动两个碱基，对每条序列进行滑窗切割；

3、统计不同长度的短序列出现的次数，保留出现次数大于或等于第一步中搜出的序列条数的短序列；

4、将第3步中保留的序列在整个Silva(数据库)中精准匹配，若匹配到的均为Blautia_obeum，则该序列可作为该菌Blautia_obeum的候选引物之一。

5、在第4步找到的序列中，定位候选引物位置，最前位置的引物和最后位置的引物之间的序列即可认定为特异性序列。

基于上述方法获得的特异性序列和引物序列结果如下：

基于核酸的检测分析靶向Blautia_obeum的16S核糖体核酸区域(特异性序列)：

Blautia_obeum特异性引物：

正向引物P1：

5’-GAGGCAGCAGTGGGGAATAT-3’(SEQ ID NO：3)

反向引物P1：

5’-AGACTTGCCAGTCCGTCTAC-3’(SEQ ID NO：4)

正向引物P2：

5’-AATGGGGGAAACCCTGATG-3’(SEQ ID NO：5)

反向引物P2：

5’-AGACTTGCCAGTCCGTCTAC-3’(SEQ ID NO：6)

正向引物P3：

5’-TGAAGGAAGAAGTATCTCGGT-3’(SEQ ID NO：7)

反向引物P3：

5’-AGACTTGCCAGTCCGTCTAC-3’(SEQ ID NO：8)

对Subdoligranulum进行同样的操作，找到该菌的特异性序列和引物，结果如下。基于核酸的检测分析靶向Subdoligranulum的16S核糖体核酸区域(特异性序列)：

Subdoligranulum特异性引物：

正向引物P4：

5’-GGACGATAATGACGGTACCT-3’(SEQ ID NO：9)

反向引物P4：

5’-GTTGGTGCCCAGTAGGTCG-3’(SEQ ID NO：10)

正向引物P5：

5’-ACAAGAAAGCACCGGCTAAC-3’(SEQ ID NO：11)

反向引物P5：

5’-GTTGGTGCCCAGTAGGTCG-3’(SEQ ID NO：12)

正向引物P6：

5’-AAGCACCGGCTAACTACGT-3’(SEQ ID NO：13)

反向引物P6：

5’-GTTGGTGCCCAGTAGGTCG-3’(SEQ ID NO：14)

实施例3特异性引物的有效性检验

1、选取实施例1中的DP002、DP011和DP013的儿童粪便，使用土壤微生物DNA抽提试剂盒(OMEGA Soil DNA Kit，M5635-02)用于提取微生物的基因组DNA。

2、利用实施例2设计出的引物扩增上述序列，引物信息见实施例2，PCR扩增反应总体系如表3：

表3

将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94℃预变性3分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30s使模板变性，然后将温度降到58℃，保持30秒钟，使引物于模板充分退火；在72℃保持60秒钟，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环30次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持5分钟，使产物延伸完整。

扩增结果进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果见图3，在3个样本中，均能扩增出特异性片段(亮的条带)，证明设计出的引物对的有效性。

实施例4特异性引物特异性验证

1、选用本实验室分离出的植物乳杆菌、青春双岐杆菌、阿克曼菌和嗜酸乳杆菌四种单菌，用设计的引物在这四种菌的基因组上进行PCR实验；

2、利用实施例2设计出的引物扩增上述序列，引物信息见实施例2，PCR扩增反应总体系如表4：

表4

将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94℃预变性3分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30s使模板变性，然后将温度降到58℃，保持30秒钟，使引物于模板充分退火；在72℃保持60秒钟，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环30次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持5分钟，使产物延伸完整。

扩增结果进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果见图4，在四种菌中，均未能扩增出特异性片段(类似图3中亮的条带)，证明了设计出引物对的特异性。