一种用于生物体极微量蛋白检测的基于叠加荧光放大技术的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于生物体极微量蛋白检测的基于叠加荧光放大技术的试剂盒。

背景技术

全球已经进入不可逆转的老龄化社会，老年人是指年龄在60岁及以上的人群。2019年，全球有10亿老年人口，到2030年，老年人口数将增加到14亿，到2050年将增加到21亿。伴随老化所发生的恶性肿瘤及神经退行性疾病患者越来越多。2020年全球由癌症导致的死亡人数近1000万例，约占死亡人数的1/6，癌症(恶性肿瘤)已经成为全球人口死亡的主要死因之一。其中老年人是恶性肿瘤的高发人群和高死亡率人群。神经退行性疾病是一类由于中枢神经系统被阻断，导致神经元细胞功能丧失，从而使中枢神经系统功能被抑制的一类疾病；主要包括：阿尔茨海默症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、脑中风、脑外伤及继发影响中枢神经系统细胞功能的基因突变(亨廷顿氏舞蹈病、早发性AD或PD、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS，俗称渐冻症)。癌症及神经退行性疾病已经成为影响人体健康和生活质量、阻碍经济持续发展的公共健康问题。因此，早期诊断以及早期干预，就有可能实现延缓甚至阻止恶性肿瘤、神经退行性疾病的发展进程，从而提高老年人晚期生活质量和幸福感，减轻老年人家庭的生活负担。

恶性肿瘤标志物以及神经退行性疾病的早期标志物在诊断和治疗恶性肿瘤或者神经退行性疾病上具有重要研究价值。基于恶性肿瘤早期标志物以及神经退行性疾病的早期标志物的免疫荧光检测技术在早诊断和早治疗恶性肿瘤或者神经退行性疾病上具有重要价值。

当前恶性肿瘤标志物以及神经退行性疾病的标志物检测方法为酶联免疫吸附剂检测(ELISA)。虽然ELISA法由于本身所具备的优越性，是一项很有发展前途的血清学诊断方法，而且应用的领域也越来越广泛。但是我们认为ELISA不是万应良方，用它来代替一切，这是不当的。因为ELISA法还有局限性：

1、由于ELISA所用的抗原大部分还是混合的可溶性抗原，所以对同一微生物寄生虫或其他物质不同部位的抗原还没有分开。

2、内源性过氧化酶的普遍存在，如人脑组织中，呼吸道分泌物的炎症细胞中及某些病毒的组织培养中均有内源性过氧化物酶的活力，常不易除去，如果用某些方法除去时，则病毒的抗原性亦受到破坏，对于用ELISA检测不利，影响准确性。

3、对ELISA法的非特异性评价的资料尚不够完善，因此，对出现一些非特异性反应的时候，往往不易解释。

4、固相载体的质量常不统一，主要是原料及制备工艺还不一致，致使不同批号的固相载体有时本底值较高，有时吸附性能很差，影响试验结果。

5、试剂不统一，现在处于“八仙过海，各显神通”，标准还不能统一。

6、ELISA检测方法具有一定的灵敏度，即检测限和定量限，对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。对于极其微量的蛋白/抗原，其含量往往低于检测限，故不会被常规ElISA检测发现。

可见，上述的ELISA检测手段均因为技术缘故无法推广应用于恶性肿瘤标志物以及神经退行性疾病的早期极其微量标志物的检测。开发简洁、无需纯化、适应性广且检测准确的检测手段或者试剂盒势所必需。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于免疫荧光叠加技术检测生物组织及生物体液中的极微量蛋白物质，用以辅助诊断早期恶性肿瘤及早期神经退行性疾病的检测试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于生物体极微量蛋白检测的基于叠加荧光放大技术的试剂盒，包括如下试剂：一抗、荧光标记的二抗和高荧光素荧光物质标记的三抗。

优选的，所述一抗为抗神经退行性疾病或肿瘤的特异性蛋白的抗体；所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿氏舞蹈病。

优选的，所述特异蛋白包括磷酸化α-突触核蛋白、Aβ、亨廷顿蛋白、TDP-43、Tau蛋白和癌胚抗原。

优选的，所述荧光标记为藻红素、PE-Cy5、PE-Cy7、PE-iFluor 647或PE-TexasRed；所述荧光标记的激发光波长为620±50nm、发射光波长为700±50nm。

优选的，所述三抗为抗所述荧光标记的抗体。

优选的，所述高荧光素荧光物质标记为tdTomato荧光蛋白、APC-Cy7、AF700、DRAQ5、PerCP或PE-Cy7。

本发明提供的试剂盒使用时，采集疑似早期恶性肿瘤、神经退行性疾病患者组织物或其体液，如血液、血清、血浆、脑脊液及唾液等。其中组织物采用常规病理操作并转移到玻片上，体液则均匀涂抹在黏附载玻片上，随后和相应的一抗孵育形成免疫复合物，洗涤后再和相应的荧光标记的二抗孵育，然后再与另一种高荧光素荧光蛋白标记的三抗进行级联反应，达到荧光叠加、急剧增强生物分子荧光强度的作用。最后采用激光共聚焦显微镜或者数字切片系统进行激光激发扫描检测，量化处理相应生物标记物。实现对恶性肿瘤、神经退行性疾病的早期诊断，监测疾病的发生、进展，为疾病的早期干预或客观地评价现有的和未来的医学治疗方法提供借鉴。

附图说明

图1为实施例1中各组小鼠黑质、纹状体外泌体α-突触核蛋白荧光检测结果比较。

图2为实施例2中体外帕金森病细胞模型的荧光显示效果。

图3为实施例3中肿瘤癌胚抗原定性检测的荧光显示效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)本实验已获得中国中医科学院医学实验中心伦理委员会的批准，按照Betarbet等(Betarbet R，et al.Nat Neurosci，2000，3(12):1301-1306)建立的鱼藤酮致帕金森病小鼠模型进行。鱼藤酮给药小鼠出现行动缓慢、僵住症等帕金森病样临床表现，同时，长期暴露于鱼藤酮的小鼠中脑黑质多巴胺能神经元内出现典型的路易氏小体，产生与帕金森病流行病学和病理特征更为相似的表现。

(2)复制帕金森病小鼠模型并荧光标记外泌体

选用C57BL/6J小鼠24只，将其随机分为2组，模型组和空白对照组，每组12只(考虑造模不成功的因素)，进行造模。模型组小鼠采用腹腔注射鱼藤酮法(将2.5mg/kg溶解于葵花油，浓度2.5mg/ml)制备模型，1次/天，连续注射28天。空白对照组只单纯注射等量葵花油。在造模第14、26天时，观察小鼠异常形态及行为，并参照Chen的论文(ChenY，etal.JNeurotrauma，1996，13(10):557-568)的评分标准评分，行为学评分2分以上为造模成功。

在造模第14天(帕金森病动物模型早期)和第28天，小鼠深度麻醉腹主动脉取血、获取血浆，随后脱颈处死，快速灌流固定、取小鼠脑组织做免疫组化或免疫荧光检测，部分小鼠麻醉，抽取脑脊液，随后深度麻醉处死后取小鼠黑质、纹状体及海马组织，用于后续实验检测。

(3)检测测试

将各小鼠脑组织常规脱水、包埋蜡块、切片、脱蜡后；

在室温下用封闭溶液(含10％FBS或10％山羊血清)培养30分钟；

第一抗体(α-突触核蛋白抗体，α-syn，一抗)孵育，在4℃下培养过夜；

用PBS清洗3次；

PE(藻红素)标记的第二抗体(二抗)孵育，在室温下培养2小时；

用PBS清洗3次；

tdTomato标记的抗PE的第三抗体(三抗)孵育1小时，用PBS清洗3次；

全景扫描显微镜激光扫描检测测试，计算结果如图1。对于模型早期的帕金森病小鼠，α-syn的表达非常少，采用PE标记的二抗检测，表达非常弱，甚至检测不到；但是采用三抗(tdTomato标记的抗PE抗体)在孵育一次进行检测，荧光表达情况一目了然。表明本发明提供的试剂盒可用于帕金森病的早期诊断。

实施例2

基于体外帕金森病模型研究中药的作用，采用脂多糖LPS激活的BV-2细胞条件培养基下SH-SY5Y细胞的炎性损伤进行造模。

将对数期小鼠小胶质细胞(BV-2细胞)以6×10

取对数期SH-SY5Y细胞以5×10

实施例3

肿瘤癌胚抗原定性检测

(1)细胞悬液制备取生长良好接种21d的Lewis肺癌C57BL小鼠，脱颈椎处死，取肿瘤组织在75％乙醇中浸泡2min，在超净工作台上取瘤组织中生长良好新鲜部分，按肿瘤质量(g)与生理盐水(mL)1∶5比例研磨成匀浆，制成匀浆液，使用时在按照1：10稀释。

(2)涂片和全景扫描显微镜检测

在距粘附载玻片一端1cm处加1滴匀浆稀释液；

左手平执载玻片，右手持推片从前方接近匀浆液滴，使匀浆液沿推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载玻片呈30-45°角，轻压推片边缘将匀浆液推制成厚薄适宜的涂片；

将推好的涂片在空气中晃动，使其迅速干燥；

在室温下用封闭溶液(含10％FBS或10％山羊血清)培养30分钟；

(癌胚抗原)第一抗体孵育，在4℃下培养过夜；

用PBS清洗3次；

PE标记的第二抗体孵育，在室温下培养2小时；

用PBS清洗3次；

tdTomato标记的抗PE抗体孵育1小时，

用PBS清洗3次；

全景扫描显微镜激光扫描检测测试，计算结果如下图3。tdtomaro标记的抗PE抗体(三抗)荧光显示效果明显优于普通PE标记的二抗荧光，证明在肿瘤癌胚抗原定性检测中，三抗的标记技术明显优于普通二抗的标记效果。

本发明考虑到不同荧光之间的干扰，在选择红色波长的二抗的基础上，叠加发射红色荧光的高荧光素三抗，达到荧光增强的效果；本发明这种荧光增强表达方式不同于将两种发光物质交联的方法(例如，在PE分子串联其他荧光染料的方式)，交联的荧光物质涉及两个抗体的绑定技术，而不涉及荧光放大技术，也不涉及第三抗体的制备。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。