一种木聚糖酶XynZT-2突变体及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种木聚糖酶XynZT-2突变体及其应用。

背景技术

木聚糖酶(endo-1,4-β-d-xylanxylanohydrolase EC3.2.1.8)是一组将半纤维素木聚糖降解成低聚糖和木糖的复合酶系。木聚糖酶主要包括内切B-1,4木聚糖酶和B-木聚糖酶，可将大分子质量的水不溶性木聚糖降解为水溶性的低聚木糖和木糖。木聚糖酶来源于GH10、GH11、GH43等家族，目前对GH10、GH11家族研究广泛，GH43家族研究较少。β-木糖苷酶是木聚糖酶的一种，根据氨基酸的序列相似性，含有此酶活性的糖苷水解酶家族包括GH5、GH43等。对由细菌、真菌、动植物等来源的GH43家族(Glycoside Hydrolase Family43)基因进行核苷酸多态性、选择压力、保守序列等方面的群体遗传学分析，确定其演化规律。发现GH43基因产生于细菌、古细菌、真菌、植物分化之前，不存在动物中。木聚糖酶在延缓面包和馒头老化、果汁澄清、生产功能性低聚木糖等食品工业中具有重要的应用价值。

对木聚糖酶进行突变，以获得最适温度和最适pH改变的木聚糖酶突变体，本领域技术人员已经做了诸多研究，例如发明专利CN104911163B公开了一种耐高温木聚糖酶突变体及其应用，突变后的木聚糖酶突变体耐高温能力显著提升；发明专利CN103343113B公开了一种热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E及其基因和应用，突变后的木聚糖酶的热稳定性显著提升；发明专利CN110607291A公开了耐热木聚糖酶突变体，突变后的木聚糖酶耐热能力显著提升。但是，目前并没有针对木聚糖酶XynZT-2进行突变的研究。

在本实验室的前期研究中，从山东烟台近海分离了一株细菌，经过鉴定为麦氏交替单胞菌，该菌株具有无毒副作用，对环境无污染，除氮效果好，可作为去除水产养殖中无机氮的理想菌株。发明人还从麦氏交替单胞菌中分离到了木聚糖酶XynZT-2，研究发现，木聚糖酶XynZT-2是GH43家族一员。发明人在研究过程中意外的发现，通过序列分析和结构建模确定麦氏交替单胞菌木聚糖酶XynZT-2活性中心位点与保守位点；选择与酶催化功能密切相关的氨基酸位点进行同源位点突变，获得突变后的基因序列。将重组基因在大肠杆菌中表达，研究重组酶与原酶酶学性质差异，进而探究GH43家族基因序列与其功能的演化关系。实验结果显示，近缘物种氨基酸同源性突变后，突变酶的最适温度和pH较原酶发生了变化，扩大了其应用范围。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种木聚糖酶XynZT-2的突变体，所述的木聚糖酶XynZT-2突变体的氨基酸序列如下：

(1)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第28位苏氨酸突变为异亮氨酸；

(2)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第33位丙氨酸突变为缬氨酸；

(3)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第97位甲硫氨酸突变为亮氨酸；

(4)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第102位丙氨酸突变为半胱氨酸；

(5)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第148位丝氨酸突变为苏氨酸；

(6)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第238位丙氨酸突变为甘氨酸；

(7)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第239位丝氨酸突变为脯氨酸；

(8)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第241位甲硫氨酸突变为亮氨酸；

(9)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第287位苏氨酸突变为丝氨酸；

(10)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第291位异亮氨酸突变为缬氨酸。

本发明的第二目的是提供一种木聚糖酶XynZT-2突变体基因，其编码所述的木聚糖酶XynZT-2突变体。

本发明的第三目的是提供包含所述木聚糖酶XynZT-2突变体基因的重组表达载体。

本发明的第四目的是提供包含所述的木聚糖酶XynZT-2突变体基因的重组菌株。

优选的，所述的重组菌株为大肠杆菌BL21。

本发明的第五目的是提供所述的木聚糖酶XynZT-2突变体水解木聚糖的应用。

本发明的第六目的是提供所述的木聚糖酶XynZT-2突变体在制备饲料/饲料添加剂中的应用。

本发明的第七目的是提供所述的木聚糖酶XynZT-2突变体在食品、酿酒及生物能源中的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种木聚糖酶XynZT-2突变体，所述的突变体是对木聚糖酶XynZT-2进行定点突变获得，所述的定点突变点为T28I、A33V、M97L、A102C、S148T、A238G、S239P、M241L、T287S或I291V的任意一个，得到的突变酶相较于原酶的最适温度发生了变化，其中突变酶M97L、突变酶A102C、突变酶A152G、突变酶M241L和突变酶I291V的最适温度升高，升高了15-35℃左右，以突变酶M97L升高最多，升高了35℃；其中，突变酶A33V、突变酶A238G和突变酶T287S的最适温度降低，降低了5℃，突变酶T28I、突变酶S148T和突变酶S239P的最适温度相较于原酶不变。突变酶相较于原酶的最适pH发生了变化，其中突变酶T28I、突变酶A33V、突变酶M97L、突变酶A102C、突变酶S148T、突变酶M241L和突变酶T287S的最适pH升高；突变酶A152G、突变酶A238G和突变酶S239P的最适pH降低；突变酶I291V的最适pH不变。综上，本发明突变得到的10个木聚糖酶XynZT-2突变体，有9个木聚糖酶XynZT-2突变体的最适温度和最适pH发生了变化，得到的木聚糖酶XynZT-2突变体显示出了在纸浆酿造、生物能源、食品制造等领域的应用价值。

附图说明

图1木聚糖酶XynZT-2及其10个突变酶的最适温度和最适pH

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

本发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。

以下实施例所述的DNS法即3,5-二硝基水杨酸比色法。原理是3,5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红物质。

以下实施例中所述的大肠杆菌BL21来源于本实验室。

以下实施例中所述的质粒pET28a为本实验室保存，限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ购自TaKaRa公司。

实施例一、麦氏交替单胞菌木聚糖酶XynZT-2的突变

1.生物信息学分析

在CAZy数据库中查找GH43家族物种信息，下载保存。对由细菌、真菌、动植物等来源GH43家族基因进行预测和筛选。并从保守序列等方面进行深入分析，确定其系统演化规律。从NCBI中下载GH43家族基因及氨基酸相应的参考序列，找出模式生物。通过BLASTP对GH43家族结构域进行同源序列比对，使用多重比对构建LG最大似然系统发育树，并在ITOL中可视化。结合以上GH43家族系统演化分析结果，通过近缘物种的比对及生物信息学分析找出麦氏交替单胞菌木聚糖酶XynZT-2保守区域。所述的木聚糖酶XynZT-2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

对保守区域附近非严格保守位点分别进行同源位点突变，设计引物，通过重叠延伸PCR法，获得相应突变体。具体如下：

2.引物设计

选择与酶催化功能密切相关的10个氨基酸位点进行同源位点替换，获得替换后的基因序列；利用上下游引物设计规则，设计10个突变位点的上下游引物。送至金唯智生物公司合成。

表1引物信息

3.突变基因的获得

采用重叠延伸PCR法，以xynZT-2为模板，其他条件见表B，得到突变基因的上下段。再以含突变点的上下段为模板，ZT-2-F、ZT-2-R为引物(表C)，分别获得11个突变基因xynZT-2T28I/A33V/M97L/A102C/S148T/A152G

/A238G/S239P/M241/T287S/I291 V，用以构建pET-28a-xynZT-2T28I/A33V/M97L/A102C/S148T/A152G/A238G/S239P/M241L/T287S/I291V，对构建产物琼脂糖凝胶电泳后，割胶回收。

表2 10个突变基因上下段的PCR反应体系

表3 10个突变基因的PCR反应体系

4.重组工程菌的构建

用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切10种突变基因和空质粒pET-28a，反应条件37℃、2.5h，对双酶切产物进行切胶回收。T4 DNA连接酶连接双酶切产物，转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布至含Kan抗性的LB固体培养基上，送测验证后的阳性菌落，即成功构建10个含突变基因的重组大肠杆菌。

所述的木聚糖酶XynZT-2突变体的氨基酸序列如下：

(1)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第28位苏氨酸突变为异亮氨酸；

(2)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第33位丙氨酸突变为缬氨酸；

(3)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第97位甲硫氨酸突变为亮氨酸；

(4)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第102位丙氨酸突变为半胱氨酸；

(5)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第148位丝氨酸突变为苏氨酸；

(6)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第238位丙氨酸突变为甘氨酸；

(7)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第239位丝氨酸突变为脯氨酸；

(8)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第241位甲硫氨酸突变为亮氨酸；

(9)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第287位苏氨酸突变为丝氨酸；

(10)将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的木聚糖酶XynZT-2的第I291V位异亮氨酸突变为缬氨酸。

通过重叠延伸PCR法，先从质粒上得到木聚糖酶XynZT-2基因。设计10个分别含突变位点的引物，以木聚糖酶XynZT-2基因为模板，分别得到含突变点的10对上、下片段。再分别以10对上、下片段为模板，得到相应的10个突变基因。对10个突变基因及质粒pET28a分别通过限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切，反应条件37℃、2.5h，对双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收。T4 DNA连接酶16℃过夜连接双酶切产物，转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布至含Kan抗性的LB固体培养基上，筛选得到阳性菌落，经测序验证，即为构建得到的突变菌株。

实施例二、木聚糖酶XynZT-2突变酶的最适温度测定

方法：在同一pH条件下，突变酶与底物在不同温度(35℃～65℃，间隔5℃，)反应15min，运用DNS法，分别测定原酶与突变酶的酶活力，其中，突变体M97L因最适温度较高，在最适温度附近选点。

实验结果如表1所示，突变酶相较于原酶的最适温度发生了变化，其中突变酶M97L、突变酶A102C、突变酶A152G、突变酶M241L和突变酶I291V的最适温度升高，升高了15-35℃左右，以突变酶M97L升高最多，升高了35℃；其中，突变酶A33V、突变酶A238G和突变酶T287S的最适温度降低，降低了5℃，突变酶T28I、突变酶S148T和突变酶S239P的最适温度相较于原酶不变。

表1原酶与突变酶最适温度比较

实施例三、木聚糖酶XynZT-2突变酶的最适pH测定

方法：在最适温度下，测原酶与突变酶在不同pH下的酶活力，得到最适pH。缓冲液：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 3.0～5.5)；磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 6.0～7.5)；Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0、pH 8.5)；甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0)，运用DNS法，测定突变酶与原木聚糖酶XynZT-2最适pH。

结果如表2所示，突变酶相较于原酶的最适pH发生了变化，其中突变酶T28I、突变酶A33V、突变酶M97L、突变酶A102C、突变酶S148T、突变酶M241L和突变酶T287S的最适pH升高；突变酶A152G、突变酶A238G和突变酶S239P的最适pH降低；突变酶I291V的最适pH不变。

木聚糖酶XynZT-2及其11个突变酶的最适温度和最适pH如图1所示。

表2原酶与突变酶最适pH比较

综上所述，本发明突变得到的10个木聚糖酶XynZT-2突变体，有9个木聚糖酶XynZT-2突变体的最适温度和最适pH发生了变化，得到的木聚糖酶XynZT-2突变体显示出了在纸浆酿造、生物能源、食品制造等领域的应用价值。

序列表

<110> 新乡医学院

<120> 一种木聚糖酶XynZT-2突变体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1029

<212> DNA

<213> 麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)

<400> 1

atgccggaga aacagtacga gaacgagatc gaaacgtaca aggagagcgc tatcagcaag 60

ccgctggtcg agcatatcta tacggccgat ccgagcgccc atgtcttcga gggcaagatc 120

tacatctacc cgagccacga tatcgaagcc ggaatcccgt tcaacgataa cggcgaccac 180

ttcgccatgt gcgactacca cgttctgagc atggattctc ttacgtcccc ggttcaagat 240

catggcgtcg ctcttcacgt tgataacgtc aagtgggctg aacgccaaat gtgggccccg 300

gacgctgcca caaagaacgg caagtacttt ctttacttcc cggccaagaa gagcgatggc 360

atcttccaaa tcggcgtcgc cgttagcaat acaccgcatg gcccgtttat ggcccagcca 420

gaaccgatcg gaggctccta cagcatcgat ccggctgttt tcgaagacga tgacggcacg 480

cactacatgt acttcggcgg aatttggggc ggccagctgc agaactaccg cgagaacaaa 540

tacaacgcca gctttgccga accgcaagat ggagaaccag ctctgggccc gatcgtcgcc 600

aaaatgtccg gcgacatgct ggagtttgat catacgccgc gcgaaattct tattgtcgat 660

gagggcggca aaccgctgct tgctggcgac catgaacgcc gcttcttcga agccagctgg 720

atgcacaagc acaagggaaa gtactatttc agctactcca cgggcaacac gcactacctt 780

tgttatgcca tcggcgactc cccgtatggc ccattcgttt acgccggccg cattcttgaa 840

ccggttgttg gatggacgac gcatcatagc atctgcgagt ttgagggcaa gcactatctt 900

ttctaccacg acagcacgct gtccggaggc gtcacacacc ttcgctccgt caaggtcgcc 960

ccgattgagt acgatgacga tggcaagatc atcacgctgt ccccgtacgg cgatgtccgc 1020

gttgaataa 1029

<210> 2

<211> 342

<212> PRT

<213> 麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)

<400> 2

Met Pro Glu Lys Gln Tyr Glu Asn Glu Ile Glu Thr Tyr Lys Glu Ser

1 5 1015

Ala Ile Ser Lys Pro Leu Val Glu His Ile Tyr Thr Ala Asp Pro Ser

202530

Ala His Val Phe Glu Gly Lys Ile Tyr Ile Tyr Pro Ser His Asp Ile

354045

Glu Ala Gly Ile Pro Phe Asn Asp Asn Gly Asp His Phe Ala Met Cys

505560

Asp Tyr His Val Leu Ser Met Asp Ser Leu Thr Ser Pro Val Gln Asp

65707580

His Gly Val Ala Leu His Val Asp Asn Val Lys Trp Ala Glu Arg Gln

859095

Met Trp Ala Pro Asp Ala Ala Thr Lys Asn Gly Lys Tyr Phe Leu Tyr

100 105 110

Phe Pro Ala Lys Lys Ser Asp Gly Ile Phe Gln Ile Gly Val Ala Val

115 120 125

Ser Asn Thr Pro His Gly Pro Phe Met Ala Gln Pro Glu Pro Ile Gly

130 135 140

Gly Ser Tyr Ser Ile Asp Pro Ala Val Phe Glu Asp Asp Asp Gly Thr

145 150 155 160

His Tyr Met Tyr Phe Gly Gly Ile Trp Gly Gly Gln Leu Gln Asn Tyr

165 170 175

Arg Glu Asn Lys Tyr Asn Ala Ser Phe Ala Glu Pro Gln Asp Gly Glu

180 185 190

Pro Ala Leu Gly Pro Ile Val Ala Lys Met Ser Gly Asp Met Leu Glu

195 200 205

Phe Asp His Thr Pro Arg Glu Ile Leu Ile Val Asp Glu Gly Gly Lys

210 215 220

Pro Leu Leu Ala Gly Asp His Glu Arg Arg Phe Phe Glu Ala Ser Trp

225 230 235 240

Met His Lys His Lys Gly Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Ser Thr Gly Asn

245 250 255

Thr His Tyr Leu Cys Tyr Ala Ile Gly Asp Ser Pro Tyr Gly Pro Phe

260 265 270

Val Tyr Ala Gly Arg Ile Leu Glu Pro Val Val Gly Trp Thr Thr His

275 280 285

His Ser Ile Cys Glu Phe Glu Gly Lys His Tyr Leu Phe Tyr His Asp

290 295 300

Ser Thr Leu Ser Gly Gly Val Thr His Leu Arg Ser Val Lys Val Ala

305 310 315 320

Pro Ile Glu Tyr Asp Asp Asp Gly Lys Ile Ile Thr Leu Ser Pro Tyr

325 330 335

Gly Asp Val Arg Val Glu

340