一种CLL1抗体及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种CLL1抗体及其应用。

背景技术

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是髓系造血干/祖细胞恶性疾病。以骨髓与外周血中的原始和幼稚髓系细胞异常增生为主要特征，临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例病情危重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。婴幼儿比成人易发生AML，本病占小儿白血病的30％。目前的治疗方法有：化疗、支持治疗、造血干细胞移植。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是CAR细胞治疗药物的核心部件，其可包括抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。到目前为止，抗原识别结构域从抗体的单链可变区(Single Chain Variable Fragment，缩写为scFv)、或者从受体配体相互作用、TCR模拟物、可变的淋巴细胞受体(Variable Lymphocyte Receptors，VLR)衍生而来；其中最为常见的来源就是scFv抗体。CAR-T细胞免疫疗法，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。CAR-T细胞就是利用基因改造的方法使T细胞表达CAR蛋白，这种CAR蛋白有能力在不依赖于抗原提呈的情况下识别膜表面的完整蛋白，进而引起T细胞的活化和功能效应。目前，CAR-T细胞免疫疗法在多种血液系统肿瘤的治疗中取得了显著的成效，如：用于治疗B细胞淋巴瘤的CD19 CAR-T和用于治疗多发性骨髓瘤的BCMA CAR-T已有上市药物。然而，由于AML的异质性，较难发现治疗AML的理想CAR-T靶点，现有针对AML的靶点有CD33、CD123、LeY、NKG2D等，但这些靶点均未有上市的CAR-T药物。

研究发现，CLL1(C-type Lectin-like Molecule 1，C-型凝集素样分子-1)是有治疗AML前景的理想靶标，因为CLL1在正常造血干细胞中不表达，在AML原始细胞和白血病干细胞中高表达，因此寻找以CLL1为靶点的适合药物的抗体，尤其是以CLL1为靶点的适合CAR-T细胞治疗药物的抗体具有现实意义。

发明内容

本申请提供了一种CLL1抗体及其应用，发明人开发了多个靶向CLL1的抗体，并将其相应scFv抗体作为CLL1 CAR结构的胞外抗原识别结构域，以此构建了嵌合抗原受体表达载体、制备了靶向CLL1的CAR-T细胞，还在细胞水平验证了CLL1CAR以及CLL1 CAR-T细胞的多项指标，并从中选择了表现最好的3条抗体。

一种CLL1抗体或其抗原结合部位，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:54所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQID NO:55所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同；

或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:56所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:57所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同；

或，所述所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:58所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:59所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同。

一种CLL1抗体或其抗原结合部位，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；

或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；

或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。

上述CLL1抗体或其抗原结合部位在某些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ IDNO:55所示的氨基酸序列；

或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；

或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。

上述CLL1抗体或其抗原结合部位在某些实施方式中，为CLL1 scFv抗体、CLL1Sc(Fv)

上述CLL1抗体或其抗原结合部位在某些实施方式中，所述CLL1 scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列、如SEQ IDNO:59所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；可选地，所述CLL1scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:56所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；进一步可选地，所述CLL1 scFv抗体包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位在一些实施例中，连接序列选自以下序列的一种或多种：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68。

本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述CLL1抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列。

上述分离的核酸分子在某些实施方式中，编码上述CLL1抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列包含：

1)编码如SEQ ID NO:54所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:60所示；和编码如SEQ ID NO:55所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:61所示；或

2)编码如SEQ ID NO:56所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:62所示；和编码如SEQ ID NO:57所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:63所示；或

3)编码如SEQ ID NO:58所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:64所示；和编码如SEQ ID NO:59所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:65所示。

本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。

本申请还提供了一种细胞，其包含上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子或载体。

本申请还提供了一种药物组合物，其包括上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞，以及药学上可接受的辅料。

本申请还提供了一种抗体药物，其包含上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位。

上述抗体药物在某些实施方式中，所述抗体药物为单特异性抗体药物、双特异性抗体药物、三特异性抗体药物或四特异性抗体药物。

本申请还提供了一种抗体药物偶联物，其包含上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位。

本申请还提供一种上述CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞在制备用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的药物中的应用。

上述应用在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。

上述应用在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。

本申请还提供了上述CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞在制备用于诊断与CLL1的表达相关的疾病或病症的检测试剂中的应用。

上述应用在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。

上述应用在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。

本申请还提供了一种治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的方法，包括以下步骤：将有效量的包含上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞的药物施用于具有治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的需求的受试者。

上述方法在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。

上述方法在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。

本申请还提供了一种药物，其包含上述CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞，用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症。

上述药物在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。

上述药物在某些实施方式中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。

附图说明

图1表示了本申请实施例2中各种CLL1 CAR的结构示意图，在该示意图中从上到下分别为：CD8a信号肽、抗CLL1 scFv、CD8a铰链区和跨膜区、4-1BB、CD3ζ。

图2表示了本申请实施例5中抗原刺激之后各组CAR-T细胞中CD3

图3A-图3C表示了本申请实施例6中各种CLL1 CAR-T细胞、阳性对照M26CLL1 CAR-T细胞在不同效靶比对不同靶细胞的裂解杀伤效果；其中：图3A中靶细胞是HL60；图3B中靶细胞是K562-CLL1；图3C中靶细胞是K562。

图4表示了本申请实施例7中各种CLL1 CAR-T细胞、阳性对照M26 CLL1CAR-T细胞、UTD细胞(未转导CAR的T细胞)被阳性靶细胞激活后的细胞因子IFN-γ释放情况。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

以下对本申请做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

在本申请中，术语“抗体”具有本领域常规的含义，是指由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，四条多肽链指通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。通过分析不同抗体重链和轻链的氨基酸序列发现，重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将抗体轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，重链和轻链的V区分别简称为VH和VL，重链和轻链的C区分别简称为CH和CL。在抗体可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区(hypervariable regions，HVR)；在L链、H链的V区中各有三个高变区，该部位因在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，故高变区又称互补性决定区(complementarity determining region，CDR)。抗体中，常见的划分CDR规则有Kabat、AbM、Chothia、Contact、IMGT，这些规则为本领域技术人员熟知的，当应用执行这些规则的网站时，只要将VH和VL序列输入并选择相应规则，即可得到依据不同规则的CDR序列。本领域技术人员应当理解，本申请的保护范围涵盖了通过采用不同规则分析获得的CDR序列的组合。抗体的6个CDR区共同决定了抗体对相应抗原的识别能力和特异性。本领域技术人员应当理解，当本申请限定了6个CDR区的氨基酸序列时，抗体对相应抗原的识别能力和特异性是可预期的。

在本申请中，术语“抗原结合部位”具有本领域常规的含义，是指抗体上可特异性识别并结合抗原的关键部位，包括VH和VL区。

在本申请中，术语“单克隆抗体”具有本领域常规的含义，是指高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，其可以通过已知的例如杂交瘤技术、抗体库技术、转基因小鼠技术或单细胞PCR技术来制备。

在本申请中，术语“scFv”具有本领域常规的含义，是指单链可变区(Single ChainVariable Fragment，缩写为scFv)，其是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽(linker，连接序列)连接而成的抗体。

在本申请中，术语“Sc(Fv)

在本申请中，术语“嵌合抗原受体”(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是CAR细胞治疗药物的核心部件，其可包括胞外抗原识别结构域(例如，结合肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigen，TAA)的部分)、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。CAR-T(ChimericAntigen Receptor T)细胞免疫疗法，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。CAR-T细胞就是利用基因改造的方法使T细胞表达CAR蛋白，这种CAR蛋白有能力在不依赖于抗原提呈的情况下识别膜表面的完整蛋白，进而引起T细胞的活化和功能效应。

在本申请中，术语“胞外抗原识别结构域”是指抗原识别结构域(AntigenRecognition Domain，ARD)。CAR细胞治疗产品(如CAR-T细胞)之所以能特异性识别和/或结合到肿瘤细胞表达的靶抗原，依赖于胞外抗原识别结构域，到目前为止，抗原识别结构域从抗体的单链可变区(Single Chain Variable Fragment，缩写为scFv)、或者从受体配体相互作用、TCR模拟物、可变的淋巴细胞受体(Variable Lymphocyte Receptors，VLR)衍生而来。到目前为止，最为常见的来源就是抗体的scFv段，scFv包括抗体重链可变区和轻链可变区，二者之间由一段肽链连接，如：由18个氨基酸组成的连接序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG。

本申请中，术语“特异性识别和/或结合”是指CAR和特异性靶标之间的识别和/或结合，是以比CAR结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标。

在本申请中，术语“铰链区”是指作用于胞外抗原识别结构域与跨膜结构域之间的连接段，这个区域通过给予抗原识别结构域一定的活动范围，允许CAR识别抗原。目前使用的铰链区主要来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种。此外，典型的铰链区还包含一些残基，这些残基参与CAR二聚化，有助于增强抗原的敏感性。

在本申请中，“跨膜区”是指连接着CAR结构的细胞内和细胞外成分的跨膜结构域。不同的跨膜结构域可以一定程度上影响CAR的表达和稳定性，但是并不直接参与信号传递，通过相互作用可以提高下游信号传递。所述跨膜区可以来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种。

在本申请内，术语“细胞内结构域”包括胞内信号传导区，还可以包括共刺激信号传导区。

在本申请中，术语“胞内信号传导区”是指负责表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能的活化。所述胞内信号传导区可以来源于CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种。

在本申请中，术语“共刺激信号传导区”之所以存在，是因为除了抗原特异性信号的刺激之外，很多免疫效应细胞还需要共刺激来促进细胞增殖、分化和存活，以及活化细胞的效应子功能。在一些实施例中，CAR还可以包括一个或多个共刺激信号传导区，其中，共刺激信号传导区可以来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上。

在本申请中，术语“引导肽”，是指胞外抗原识别结构域(如scFv序列)前的短肽，其作用是引导细胞内合成的重组蛋白质输出到细胞外。常用的引导肽有人CD8α信号肽，或者人GM-CSF受体α信号肽。

在本申请中，决定CAR-免疫细胞治疗效果的关键因素之一是对肿瘤靶抗原的选择。在本申请中，所选择的肿瘤靶抗原“CLL1”具有本领域常规的含义，其还被称为KLR1、CLEC12A，其是一种II型跨膜糖蛋白，是与免疫调节相关的C型凝集素样受体大家族的成员。研究发现，CLL1(C-type Lectin-like Molecule 1)是有治疗AML前景的理想靶标，因为CLL1在正常造血干细胞中不表达，在AML原始细胞和白血病干细胞中高表达。

在本申请中，术语“连接序列”通常是指长度为约1至100个氨基酸的寡肽或多肽区，其将本发明的嵌合抗原受体的任何结构/区域连接在一起。连接序列可由不同的氨基酸残基(如甘氨酸和丝氨酸)组成，以便相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。当期望确保两个相邻结构域在空间上不相互干扰时，可使用较长的连接序列。

在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除从天然状态下经人工手段获得后，经过人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，其可以是从其天然环境分离的或人工合成的类似物。

在本申请中，CAR基因转导/转染和靶基因表达时，基因转导/转染方法主要包括病毒和非病毒的方法。如：通过γ反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒相关病毒载体、质粒DNA依赖的载体、转座子依赖的基因转移、mRNA介导的基因转导。

术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。术语“转座子”是指不连续的DNA片段，具有在染色体位点之间迁移和携带基因信息的能力，如：睡美人SB系统和来源于鳞翅目昆虫的PB系统。在一些实施例中，还可以使用电转的方法将mRNA转导进T细胞。

在本申请中，术语“免疫效应细胞”通常是指参与免疫应答，例如促进免疫效应应答的细胞。免疫效应细胞可以选自以下组：T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、外周血单个核细胞(PBMC细胞)、多能干细胞、多能干细胞分化成的T淋巴细胞、多能干细胞分化成的NK细胞和胚胎干细胞中的一种或多种。

在本申请中，术语“药物组合物”通常指适合施用于患者的药物组合物，其可以包含本申请所述的免疫效应细胞，还可以包含一种或多种药学上可接受的辅料，如：载剂、保护剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂中的一种或多种。在一些实施例中，药学上可接受的辅料包括保护剂，如：细胞冻存液。在一些实施例中，本申请的药物组合物为细胞悬液或其冻存细胞。

在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、马、猪、牛、羊或猴。

在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下本领域技术人员可接受的波动范围，如：在±0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％的范围内变动。

CLL1抗体或其抗原结合部位、相应核酸分子、相应载体、相应细胞、相应药物组合物

一方面，本申请提供了一种CLL1抗体或其抗原结合部位，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:54所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:55所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同；

或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:56所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:57所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同；

或，所述所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:58所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:59所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同。

在抗体中，常见的划分CDR规则有Kabat、AbM、Chothia、Contact、IMGT，这些规则为本领域技术人员熟知的，当应用执行这些规则的网站时，只要将VH和VL序列输入并选择相应规则，即可得到依据不同规则的CDR序列。本领域技术应当理解，即使针对相同的重链可变区和轻链可变区，根据不同的CDR划分规则可得到不同的CDR序列。本领域技术人员应当理解，本申请的保护范围涵盖了通过采用不同规则分析获得的CDR序列的组合。

另一方面，本申请还提供了一种CLL1抗体或其抗原结合部位，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；

或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；

或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。

在本申请中，采用了KABAT规则进行CDR的划分。

上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位在一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQID NO:55所示的氨基酸序列；

或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；

或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。

本申请通过实验筛选出3条性能最好的抗体，分别为1-3、1-28和3-67抗体。其中，1-3scFv抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ IDNO:55所示的轻链可变区；1-28scFv抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示的轻链可变区；3-67scFv抗体包含氨基酸序列如SEQID NO:58所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的轻链可变区。

上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位在一些实施例中，为CLL1 scFv抗体、CLL1Sc(Fv)

上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位在一些实施例中，所述CLL1 scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；可选地，所述CLL1 scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；进一步可选地，所述CLL1 scFv抗体包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在上述描述中，“-”表示相互连接，并且在上述描述中“-”具有方向性，其表示从氨基酸的N端向C端的连接。

上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位在一些实施例中，连接序列选自以下序列的一种或多种：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68。

再一方面，本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列。

上述分离的核酸分子在一些实施例中，编码上述CLL1抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列包含：

1)编码如SEQ ID NO:54所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:60所示；和编码如SEQ ID NO:55所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:61所示；或

2)编码如SEQ ID NO:56所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:62所示；和编码如SEQ ID NO:57所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:63所示；或

3)编码如SEQ ID NO:58所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:64所示；和编码如SEQ ID NO:59所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:65所示。

再一方面，本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。载体可以任意地选自以下载体地一种或几种：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。

再一方面，本申请还提供了一种细胞，其包含上述CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子或载体。

再一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其包括上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞，以及药学上可接受的辅料。药学上可接受的辅料包括但不限于：载剂、保护剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂中的一种或多种。

包含CLL1抗体或其抗原结合部位的抗体药物、抗体药物偶联物

一方面，本申请提供了一种抗体药物，其包含上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位。

上述抗体药物在一些实施例中，所述抗体药物为单特异性抗体药物、双特异性抗体药物、三特异性抗体药物或四特异性抗体药物。

另一方面，本申请还提供了一种抗体药物偶联物，其包含上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位。

CLL1抗体或其抗原结合部位的应用

一方面，本申请提供一种上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞在制备用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的药物中的应用。

上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。

上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。

另一方面，本申请还提供了上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞在制备用于诊断与CLL1的表达相关的疾病或病症的检测试剂中的应用。

上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。

上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。

再一方面，本申请还提供了一种治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的方法，包括以下步骤：将有效量的包含上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞的药物施用于具有治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的需求的受试者。

上述方法在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。

上述方法在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。

上述方法在一些实施例中，所述施用可以通过不同的方式进行，例如口服、静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。

上述方法在一些实施例中，针对不同的适应症，给药剂量可以不同；针对病情严重程度不同的患者，给药剂量也可以不同。

上述方法在一些实施例中，所述受试者可以包括人类和非人类动物。例如，所述受试者可以包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、马、猪、牛、羊、兔或猴。

再一方面，本申请还提供了一种药物，其包含上述任一种CLL1抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体或细胞，用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症。

上述药物在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。

上述药物在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。

CLL1嵌合抗原受体、相应核酸分子、相应载体、相应免疫效应细胞、药物组合物

一方面，本申请提供了一种靶向CLL1的嵌合抗原受体，其包含CLL1胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域，所述CLL1胞外抗原识别结构域包括CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区，其中：

所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:54所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:55所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同；

或，所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:56所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:57所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同；

或，所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:58所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:59所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列相同。

另一方面，本申请还提供了一种靶向CLL1的嵌合抗原受体，其包含CLL1胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域，所述CLL1胞外抗原识别结构域包括CLL1重链可变区和CLL1轻链可变区，其中：

所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；

或，所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；

或，所述CLL1重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述CLL1轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含如SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。

上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区序列包含如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；

或，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；

或，所述CLL1重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，所述CLL轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。

上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，CLL1胞外抗原识别结构域包括选自以下结构中的任意一种：如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列、如SEQ IDNO:59所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；可选地，所述CLL1scFv抗体包含选自以下序列的任意一种：如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ IDNO:56所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列-连接序列-如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；进一步可选地，所述CLL1 scFv抗体包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，连接序列选自以下序列的一种或多种：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68。

上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，所述铰链区来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种；可选地，所述铰链区的氨基酸来源于CD8α；进一步可选地，所述铰链区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。

上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，所述跨膜区来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种；可选地，所述跨膜区的氨基酸序列来源于CD8α；进一步可选地，所述跨膜区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。

上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，其中所述细胞内结构域包含胞内信号传导区；可选地，还包括共刺激信号传导区。

上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，其中所述胞内信号传导区来源于CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种；可选地，所述胞内信号传导区来源于CD3ζ；进一步可选地，所述胞内信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，其中所述共刺激信号传导区来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上；可选地，所述共刺激信号传导区来源于CD28或4-1BB；进一步可选地，所述共刺激信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。

上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，还包含位于所述嵌合抗原受体氨基酸序列N-末端的引导肽；可选地，其中所述引导肽来源于CD8α；进一步可选地，所述引导肽的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

上述任一种嵌合抗原受体在一些实施例中，所述嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。

再一方面，本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述任一种嵌合抗原受体的核苷酸序列。

上述分离的核酸分子在一些实施例中，编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列包含：

1)编码如SEQ ID NO:54所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:60所示；和编码如SEQ ID NO:55所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:61所示；或

2)编码如SEQ ID NO:56所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:62所示；和编码如SEQ ID NO:57所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:63所示；

3)编码如SEQ ID NO:58所示的CLL1重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:64所示；和编码如SEQ ID NO:59所示的CLL1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:65所示。

再一方面，本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。载体可选子以下的任意一种或几种：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。

上述载体在一些实施例中，为表达载体；在另一些实施例中，载体为病毒载体；在另一些实施例中，载体为慢病毒载体。

再一方面，本申请还提供了一种经工程化的免疫效应细胞，其包含上述嵌合抗原受体、上述分离的核酸分子，或上述载体。

上述经工程化的免疫效应细胞在一些实施例中，所述经工程化的免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、外周血单个核细胞(PBMC细胞)、多能干细胞、多能干细胞分化成的T细胞、多能干细胞分化成的NK细胞和胚胎干细胞中的一种或多种。

上述经工程化的免疫效应细胞在一些实施例中，所述经工程化的免疫效应细胞是T淋巴细胞；可选地，所述T淋巴细胞的来源为自体T淋巴细胞或同种异体T淋巴细胞。

上述经工程化的免疫效应细胞在一些实施例中，T淋巴细胞的αβT淋巴细胞或γδT淋巴细胞。

上述经工程化的免疫效应细胞在一些实施例中，所述经工程化的免疫效应细胞的表面可以表达或表达有本申请所述的嵌合抗原受体。

再一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其包括上述经工程化的免疫效应细胞和药学上可接受的辅料。药学上可接受的辅料包括但不限于：载剂、保护剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂中的一种或多种。

上述药物组合物在一些实施例中，药学上可接受的辅料包括保护剂。

上述药物组合物在一些实施例中，药学上可接受的辅料包括细胞冻存液。

上述药物组合物在一些实施例中，药物组合物为细胞悬液或其冻存细胞。

上述药物组合物在一些实施例中，药物组合物为静脉注射剂。

制备方法和用途

一方面，本申请还提供了制备经工程化的免疫效应细胞的方法，其包括以下的步骤：向免疫效应细胞中转导本申请所述的载体。

上述方法在一些实施例中，所述经工程化的免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、外周血单个核细胞(PBMC细胞)、多能干细胞、多能干细胞分化成的T细胞、多能干细胞分化成的NK细胞和胚胎干细胞中的一种或多种。

上述方法在一些实施例中，所述经工程化的免疫效应细胞是T淋巴细胞；可选地，所述T淋巴细胞的来源为自体T淋巴细胞或同种异体T淋巴细胞。

上述方法在一些实施例中，T淋巴细胞为αβT淋巴细胞或γδT淋巴细胞。

另一方面，本申请还提供上述嵌合抗原受体、分离的核酸分子、载体或经工程化的免疫效应细胞在制备药物中的应用，所述药物用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症。

上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。

上述应用在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。

再一方面，本申请还提供了一种治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的方法，包括以下步骤：将有效量的上述经工程化的免疫效应细胞或药物组合物施用于具有治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症的需求的受试者。

上述方法在一些实施例中，所述施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。例如，施用的方式可以通过静脉注射的方式施用于受试者。在一些实施例中，有效剂量的经工程化的免疫效应细胞或药物组合物可以单次施用于受试者，也可以在一定期间内分次施用于受试者，如：每周施用一次、两周一次、三周一次、四周一次、一个月一次、3个月一次、或3-6个月一次。

上述方法在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。

上述方法在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。

上述方法在一些实施例中，所述施用的方式为静脉注射。

上述方法在一些实施例中，所述施用的方式为将有效量的经工程化的免疫效应细胞或药物组合物以单次注射的方式施用于受试者。

上述方法在一些实施例中，有效量的经工程化的免疫效应细胞或药物组合物为1×10

上述方法在一些实施例中，所述受试者可以包括人类和非人类动物。例如，所述受试者可以包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、马、猪、牛、羊、兔或猴。

再一方面，本申请还提供了一种药物，其包含上述经工程化的免疫效应细胞或药物组合物，用于治疗与CLL1的表达相关的疾病或病症。

上述药物在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为血液瘤。

上述药物在一些实施例中，与CLL1的表达相关的疾病或病症为急性髓系白血病。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的CLL1抗体、嵌合抗原受体、经工程化的免疫效应细胞、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais,T.(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press。

实施例1、CLL1抗体开发

CLL1抗体开发过程：采用BALB/c和C57bl/6小鼠作为免疫动物，以人CLL1作为抗原按照表1中的程序进行免疫。取免疫后各只小鼠血清进行FACS(流式细胞荧光分选技术)和ELISA检测，综合ELISA检测和FACS检测的结果，取免疫效果最好的小鼠，将其浆细胞经CD138抗体富集后铺种到Beacon筛选芯片上，进行抗体阳性B细胞株的分析和筛选，共获得单克隆细胞8561株、多克隆细胞1511株，其中抗体为IgG的690株。根据与抗原结合的情况，将阳性B细胞克隆导出、进行V区测序，共获得64条单克隆抗体的V区序列，根据序列相似性分类，选择14条代表序列用于合成CAR中的scFv。

表1、动物免疫程序

实施例2、CLL1 CAR-T细胞的获得

我们获得14条靶向CLL1的候选scFv，候选scFv序号和其序列分别如表2所示。我们还获得1条CLL1阳性对照抗体M26(其来源于Treatmen of Acute Myeloid Leukemia withT Cells Expressing Chimeric Antigen Receptors Directed to C-type Lection-likeMolecule 1,Molecular Therapy Vol.25No.9September 2017)

表2、14条靶向CLL1的候选scFv序号及其序列

我们选择在二代CAR结构上对14条候选scFv进行筛选。在各个CAR结构中，均采用了CD8α引导链为信号肽(如SEQ ID NO:16所示)，铰链区(如SEQ ID NO:17所示)和跨膜区(如SEQ ID NO:18所示)采用CD8α的结构，以4-1BB为胞内共刺激信号(如SEQ ID NO:19所示)，CD3ζ为T细胞激活信号(如SEQ ID NO:20所示)，结构示意图如图1所示。

1、慢病毒载体的构建

根据表1中各候选scFv的序列以及CAR结构组件的序列，分别人工合成14条CLL1CAR结构以及1条M26 CLL1 CAR结构，其氨基酸序列如表3所示。

表3、14条CLL1 CAR序号及其序列

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将上述15种CLL1 CAR结构分别构建到经过改造的空慢病毒载体(厂家：SBI公司，货号：CD500-CD800，如WO2021/121227实施例1中记载的改造抗性)中获得CAR表达载体，随后将CAR表达载体和三种包装质粒一起转染293T细胞，经过收集纯化之后得到有功能性的慢病毒载体。三种包装质粒分别是pMD2.G(购自Biovector公司，产品号Biovector012259)，pMDLg/pRRE(购自Biovector公司，产品号Biovector012251)，pRSV-Rev(购自Biovector公司，产品号Biovector012253)。

2、通过慢病毒转导的方式制备相应15种CLL1特异性CAR-T细胞。

转导实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行，简述转导步骤如下：

1)分选T细胞

从人单采血细胞中分离获得外周血单个核细胞(PBMC)，然后从PBMC细胞中分选获得T细胞。

2)对T细胞进行激活处理

将分离的T细胞用T细胞完全培养基(X-VIVO15培养基+5％ FBS+300IU/ml IL-2或X-VIVO15培养基+5％ FBS+5ng/ml IL-15+10ng/ml IL-7)进行重悬，使终浓度为(1～3)×10

3)慢病毒转导T细胞

取出激活培养的T细胞，用含终浓度为8μg/ml的聚凝胺(polybrene)的单纯X-VIVO15培养基重悬，混匀获得细胞悬液，并按每800ul细胞悬液(含2×10

4)转导后T细胞的扩增培养

取出转导后的细胞，用T细胞完全培养基扩增培养，隔天传代，使细胞密度维持在(0.8～2)×10

分别使用包含有表3中CAR结构的慢病毒感染T细胞后，获得的T细胞分别按其CAR序号进行命名，比如使用1-3CAR获得的T细胞即命名为1-3CAR-T细胞、使用2-8CAR获得的T细胞即命名为2-8CAR-T细胞。接下来，我们在细胞水平对14条CLL1CAR结构进行筛选，以确定各个scFv的优劣。

实施例3、CLL1 CAR-T细胞表面表达的CAR分子的检测及其抗原识别能力检测

1、CAR分子的检测：对实施例2中获得的转导后培养7天的14种CLL1 CAR-T细胞表面表达的CAR蛋白分子进行检测，我们用PE荧光标记的CLL1抗原(厂家：ACRObiosystems，货号：CLA-PH2Q3)和FITC荧光标记的CLL1抗原(厂家：ACRObiosystems，货号：CLA-HF24725ug)对实施例2中获得的14种CLL1 CAR-T细胞、M26 CLL1 CAR-T细胞和UTD细胞(未转导CAR的T细胞)进行染色，并通过流式细胞术进行CAR分子阳性比例检测分析，检测结果如表4所示。

2、CAR分子抗原识别能力的检测：对实施例2中获得的14种CLL1 CAR-T细胞表面表达的CAR蛋白分子进行抗原识别能力检测，我们用FITC荧光标记的IgG(厂家：abcam，货号：ab98658)对实施例2中获得的14种CLL1 CAR-T细胞、M26 CLL1 CAR-T细胞和UTD细胞(未转导CAR的T细胞)进行染色，并通过流式细胞术进行抗原识别能力的检测，检测结果如表4所示。

如表4所示：灰色底纹的细胞中，因CAR分子表达差和/或抗原识别能力差在筛选中被舍弃，其中：2-25、2-40、3-35的CAR不表达；3-11、3-13、3-16的CAR表达，但对抗原识别能力差，这些细胞在之后的实验中全部被舍弃。

表4、细胞表面表达的CAR分子的检测结果及其抗原识别能力检测结果

备注：CAR表达率低于10％认为不表达或者表达极差，低于筛选标准；抗原结合识别率低于10％认为抗原识别能力差，低于筛选标准。

实施例4、CLL1 CAR的特异性检测

在蛋白水平和细胞水平分别进行了CLL1 CAR的特异性检测。

1)蛋白水平的特异性检测

以荧光标记的CD19蛋白(购自ACRObiosystems，货号CD9-HP2H3)、CS1蛋白(购自ACRObiosystems，货号SL7-HP2H3)、BCMA蛋白(购自ACRObiosystems，货号BCA-HF254)、GPC3蛋白(购自ACRObiosystems，货号GP3-HF2H1)、EGFRvIII蛋白(购自ACRObiosystems，货号EGI-HP2E3)5种抗原蛋白按照如下方法对实施例3筛选得到的8种CLL1 CAR-T细胞(1-3、1-28、1-16、2-8、2-31、3-37、3-64和3-67CAR-T细胞)以及M26 CAR-T细胞进行蛋白水平的特异性检测：取每种CAR-T细胞0.5×10

2)细胞水平的特异性

以细胞系K562(人慢性骨髓性白血病细胞)、K562-CLL1(外源表达CLL1蛋白的K562细胞)、HL60(人早幼粒急性白血病细胞)、THP1(人单核细胞白血病细胞)、OVCAR3(人卵巢腺癌细胞)、RAJI(人淋巴瘤细胞)、MM.1S(人多发性骨髓瘤细胞)、NALM6(人急性淋巴细胞白血病细胞)、SK-MEL1(人皮肤黑色素瘤细胞)、A549(人肺癌细胞)、HUH7(人肝癌细胞)这11种不同组织来源的细胞系按照如下方法对实施例3筛选得到的8种CLL1 CAR-T细胞(1-3、1-28、1-16、2-8、2-31、3-37、3-64和3-67CAR-T细胞)以及M26 CAR-T细胞进行细胞水平的特异性检测，其中：K562-CLL1、HL60、THP1、NALM6细胞系是CLL1阳性靶细胞，其余细胞系是阴性靶细胞。该研究中检测T细胞激活的方法为CD107a分析。CD107a在膜上的表达被认为是活化细胞毒性淋巴细胞(CD8+T细胞和NK细胞)的标志物，当细胞毒性淋巴细胞给予特定抗原刺激即发生免疫激活，表达CD107a，因此可做为检测CAR-T细胞特异性的手段。具体步骤为：肿瘤细胞和转染及未转染的T细胞进行计数，用X-VIVO培养基将肿瘤细胞调整至2×10

表5、蛋白水平检测CAR-T细胞特异性结果

备注：“-”表示CAR-T细胞不与该蛋白结合，“+”表示CAR-T细胞与该蛋白结合。

表6、细胞水平检测CAR-T细胞特异性结果

备注：“-”表示未检测到CD107a信号，“+”表示检测到CD107a信号。

如表6所示：2-31CAR能被阴性靶细胞激活，表现出CD107a信号，因此在细胞水平没有达到筛选标准，因此在后续的实验中也将其排除。

实施例5、CLL1 CAR-T细胞的持续增殖性

抗原刺激可以激活CAR-T细胞使CAR-T细胞增殖，而T细胞的持续激活会导致细胞耗竭，耗竭的T细胞的增殖能力和效应功能都会有所下降，我们通过检测CLL1 CAR-T细胞在多轮抗原刺激实验后CD3+细胞的增殖情况(即T细胞的增殖情况)，确定其持续增殖性。

抗原刺激(以HL60细胞作为抗原)之前，将经过实施例3、实施例4中筛选获得的7种CLL1 CAR-T细胞(即1-3、1-16、1-28、2-8、3-37、3-64、3-67)、M26 CAR-T细胞的CAR阳性比例都利用UTD调整到了与CAR阳性比例最低的一组CAR-T细胞一致的水平，在抗原刺激实验中，将各组CAR-T细胞分别与阳性靶细胞HL60按照效靶比1:2在24孔板中进行共培养，每孔2mlX-VIVO15培养基，每组细胞重复3孔。用荧光标记的CD3抗体(厂家：BioLegend，货号：300312)进行CD3，通过流式细胞术进行检测分析，显示T细胞的增殖情况(CD3是区分是否为T细胞的标记物)，根据体积倍数的换算计算CD3阳性细胞的细胞数，然后根据计算结果各组再取出一定量CAR-T细胞按照效靶比1:2加入对应的阳性靶细胞进行新一轮刺激，每隔2天一次，如此重复进行3-4轮刺激。经过多次重复实验，排除掉增殖最差的2-8和3-37CAR。其余5种CLL1 CAR-T细胞(即1-3、1-16、1-28、3-64、3-67)、M26 CAR-T细胞再用上述方法进行多轮刺激和增殖统计后，发现1-3和1-28具有更强的持续增殖能力，显著高于阳性对照M26CAR-T细胞。1-16和3-67的持续增殖能力也不错，3-64的持续增殖性相对较差，结果如图2所示。在本申请中，经过多轮刺激后的细胞几乎全为CAR+细胞，因此CAR+表达率不再作为重要指标。

实施例6、CLL1 CAR-T细胞进行细胞杀伤实验

细胞杀伤实验：将经过实施例3、实施例4、实施例5中筛选获得的5种CLL1 CAR-T细胞(即1-3、1-16、1-28、3-64、3-67)、M26 CAR-T细胞分别与靶细胞按照效应细胞与靶细胞不同效靶比(1:1、3:1或9:1)的条件在X-VIVO15培养基中共培养16～24小时后，通过检测靶细胞中稳定表达的荧光素酶活性检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤比例，靶细胞分别采用HL60细胞、K562-CLL1细胞、K562细胞，其中：HL60细胞是内源表达CLL1的阳性靶细胞、K562-CLL1是外源表达CLL1的阳性靶细胞、K562是不表达CLL1的阴性靶细胞。细胞杀伤结果如图3A-图3C所示：在HL60肿瘤细胞系中各CAR-T杀伤效果都很显著；在K562-CLL1肿瘤细胞系中1-16CAR-T细胞的杀伤效果差，其余CAR-T效果非常显著；在K562细胞系中，如预期的，各组均没有杀伤效果。根据细胞杀伤实验，可以进一步排除1-16。

实施例7、CLL1 CAR-T细胞进行细胞因子释放实验

细胞因子释放实验：将经过实施例3、实施例4、实施例5中筛选获得的5种CLL1CAR-T细胞(即1-3、1-16、1-28、3-64、3-67)、M26 CAR-T细胞以及UTD细胞分别与靶细胞按照效靶比1:1的条件在X-VIVO15培养基中共培养24h后，通过ELISA方法检测细胞上清中IFN-γ的浓度；靶细胞分别采用HL60细胞、K562-CLL1细胞、K562细胞，其中：HL60细胞是内源表达CLL1的阳性靶细胞、K562-CLL1是外源表达CLL1的阳性靶细胞、K562是不表达CLL1的阴性靶细胞。细胞因子释放实验结果如图4所示：1-3和1-28CAR-T细胞因子释放量显著高于阳性对照M26 CAR-T，3-67CAR-T细胞因子释放量也高于阳性对照M26和3-64。

综上，在体外药效学检测表明，以1-3scFv、1-28scFv作为胞外抗原识别结构域的CAR，在T细胞表面的表达率高、抗原识别能力强、在蛋白水平和细胞水平的特异性好、持续增殖性好、体外细胞杀伤能力强、细胞因子释放水平高；尤其是其持续增殖性和细胞因子释放水平都显著优于阳性对照M26 scFv。以3-67scFv作为胞外抗原识别结构域的CAR，抗原识别能力强、在蛋白水平和细胞水平的特异性好、持续增殖性好、体外细胞杀伤能力强、细胞因子释放水平高。

序列描述

SEQ ID NO:1：1-3scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：1-28scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:3：1-16scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:4：2-8scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:5：2-25scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:6：2-31scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:7：2-40scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:8：3-11scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:9：3-13scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:10：3-16scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:11：3-35scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:12：3-37scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:13：3-64scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:14：3-67scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:15：M26 scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:16：CD8α引导链作为信号肽的氨基酸序列；

SEQ ID NO:17：CD8α铰链区的氨基酸序列；

SEQ ID NO:18：CD8α跨膜区的氨基酸序列；

SEQ ID NO:19：4-1BB胞内共刺激信号的氨基酸序列；

SEQ ID NO:20：CD3ζT细胞激活信号的氨基酸序列；

SEQ ID NO:21：1-3CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:22：1-28CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:23：1-16CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:24：2-8CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:25：2-25CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:26：2-31CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:27：2-40CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:28：3-11CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:29：3-13CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:30：3-16CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:31：3-35CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:32：3-37CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:33：3-64CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:34：3-67CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:35：M26 CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:36:1-3scFv VH CDR1氨基酸序列；

SEQ ID NO:37:1-3scFv VH CDR2氨基酸序列；

SEQ ID NO:38:1-3scFv VH CDR3氨基酸序列；

SEQ ID NO:39:1-3scFv VL CDR1氨基酸序列；

SEQ ID NO:40:1-3scFv VL CDR2氨基酸序列；

SEQ ID NO:41:1-3scFv VL CDR3氨基酸序列；

SEQ ID NO:42:1-28scFv VH CDR1氨基酸序列；

SEQ ID NO:43:1-28scFv VH CDR2氨基酸序列；

SEQ ID NO:44:1-28scFv VH CDR3氨基酸序列；

SEQ ID NO:45:1-28scFv VL CDR1氨基酸序列；

SEQ ID NO:46:1-28scFv VL CDR2氨基酸序列；

SEQ ID NO:47:1-28scFv VL CDR3氨基酸序列；

SEQ ID NO:48:3-67scFv VH CDR1氨基酸序列；

SEQ ID NO:49:3-67scFv VH CDR2氨基酸序列；

SEQ ID NO:50:3-67scFv VH CDR3氨基酸序列；

SEQ ID NO:51:3-67scFv VL CDR1氨基酸序列；

SEQ ID NO:52:3-67scFv VL CDR2氨基酸序列；

SEQ ID NO:53:3-67scFv VL CDR3氨基酸序列；

SEQ ID NO:54：1-3scFv VH氨基酸序列；

SEQ ID NO:55：1-3scFv VL氨基酸序列；

SEQ ID NO:56：1-28scFv VH氨基酸序列；

SEQ ID NO:57：1-28scFv VL氨基酸序列；

SEQ ID NO:58：3-67scFv VH氨基酸序列；

SEQ ID NO:59：3-67scFv VL氨基酸序列；

SEQ ID NO:60：编码如SEQ ID NO:54所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:61：编码如SEQ ID NO:55所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:62：编码如SEQ ID NO:56所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:63：编码如SEQ ID NO:57所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:64：编码如SEQ ID NO:58所示的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:65：编码如SEQ ID NO:59所示的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:66：连接序列；

SEQ ID NO:67：连接序列；

SEQ ID NO:68：连接序列。