一种银基多孔有机框架材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种银基多孔有机框架材料及其制备方法和应用。

背景技术

细菌是诱发感染的主要病原微生物之一，病原菌对人体的侵害促进了人类对病原菌的研究。在1929年青霉素的发现打开了抗生素治疗细菌感染的途径，20世纪中抗生素的迅速发展大大降低了细菌感染的发病率和死亡率，并提高了感染人类的生命质量和寿命。然而，抗菌素耐药性(AMR)也随之而来，其主要归结为两点：1)是由于患者长期过度使用抗菌药物刺激而出现的多重耐药性)前几年临床上抗生素的滥用。二者共同加剧了这一危害，致使AMR的产生是近年来现代医学中最大的威胁。因此迫切需要一种新型策略来对抗细菌感染并克服出现耐药性现状。近年来，纳米材料的问世及快速发展为克服抗生素耐药菌的现状提供了可能性和机会。

银基抗菌剂是目前研究最广泛的消灭耐药菌株的替代品。然而，作为一种典型的重金属，银基抗菌剂，包括金属银、银盐以及银纳米粒子，遇到了全身副作用的问题，这可能导致过敏反应和严重的细胞毒性，特别是在高剂量下。同时，银基纳米粒子固有的自聚集特性使银基抗菌剂的杀菌效果大打折扣。为了使银基抗菌剂在临床上的进一步应用，迫切需要新的载体，既能改善生物相容性，又能避免银基米粒子严重的自聚集，从而发挥更好的治疗作用。

多孔有机聚合物(POPs)，与石墨烯材料(GMs)、单壁或多壁碳纳米管(CNTs)以及金属有机框架类似但有所不同，POP是由轻元素通过共价键连接的人造多孔材料的一个子类。与蛋白质相似的固有结构特性赋予了持久性有机污染物良好的生物安全性，同时可调的化学结构和功能使其可用于但不限于环境、催化、生物传感器、能源和生物医学领域。因此，如何构建具有内在抗菌作用的多功能POPs，既能负载银基材料实现协同杀菌又能避免银基材料自聚集或者从载体上脱落、降低银纳米粒子的毒性，是需要解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种银基多孔有机框架材料及其制备方法和应用。本发明将硝普银与CEP-POP冠醚基多孔有机框架的联合作用，制备得到一种广谱的抗菌剂。实现硝普银和CEP-POP协同抗菌，达到显著的抗菌效果；且银基材料不易从载体中脱落、不会自聚集，生物相容性好，显著降低了含银基纳米粒子抗菌剂的毒性，无毒副作用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种银基多孔有机框架材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备4，4′-二甲酰基二苯并-18-冠-6：将二苯并-18-冠-6、三氟乙酸和六亚甲基四胺混合，在保护气氛下搅拌并加热反应，反应结束后进行冷却，得到黄棕色沉淀，将其洗涤、过滤、干燥得到4，4′-二甲酰基二苯并-18-冠-6；

(2)制备CEP-POP：将重蒸吡咯、步骤(1)得到的4，4′-二甲酰基二苯并-18-冠-6和FeCl

(3)制备CEP-POP-AgNNP：将步骤(2)得到的CEP-POP与SNP加入水中得到混合液，室温下搅拌过夜，离心后将得到的沉淀物洗涤、冻干得到SNP@CEP-POP，向得到SNP@CEP-POP中加入硝酸银溶液，室温下搅拌反应，将搅拌反应得到的固体进行洗涤、干燥，得到的多孔有机框架材料即为CEP-POP-AgNNP。

优选的，步骤(1)中，所述二苯并-18-冠-6-醚、六亚甲基四胺和三氟乙酸的加入量之比为10mmol：10mmol：7mL。

优选的，步骤(1)中，所述保护气氛为氩气；所述加热反应的温度为90℃，所述加热反应的时间为12～15h。

优选的，步骤(2)中，所述重蒸吡咯、4，4′-二甲酰基二苯并-18-冠-6、FeCl

优选的，步骤(2)中，所述保护气氛为氩气；所述回流反应的温度为140℃，所述回流反应的时间为48h。

优选的，步骤(3)中，所述CEP-POP与SNP的质量比为1：12所述混合液中CEP-POP的浓度为2.5mg/mL。

优选的，步骤(3)中，所述SNP@CEP-POP和硝酸银溶液的加入量之比为65:68；所述硝酸银溶液的浓度为1×10

本发明的第二方面，提供上述制备方法得到的银基多孔有机框架材料。

本发明的第三方面，提供银基多孔有机框架材料在制备抗革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的药物中的应用。

优选的，所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌；所述革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌。

本发明的有益效果：

(1)本发明将硝普银与CEP-POP冠醚基多孔有机框架的联合作用，制备的银基多孔有机框架材料既能负载银基材料、释放硝普银纳米粒子，实现协同杀菌；又能避免银基材料自聚集或者从载体上脱落，以此策略实现多孔有机聚合物材料协同广谱抗菌。

(2)本发明制备的银基多孔有机框架材料CEP-POP-AgNNP生物相容性好、对血红细胞的溶血率低于1％，对人体无毒副作用、对HEK293细胞的细胞活力影响微小，显著降低了含银基纳米粒子抗菌剂的毒性，这将推动含银基纳米粒子的多功能抗菌平台的发展。

附图说明

图1是CEP-POP-AgNNP的表征谱图，其中(a)为CEP-POP-AgNNP、AgNNP、CEP-POP和SNP的红外光谱；(b)为CEP-POP-AgNNP的

图2是CEP-POP-AgNNP的电镜图和元素映射，其中(a)为CEP-POP-AgNNP在5μm处的扫描电镜；(b)为CEP-POP-AgNNP在100nm处的扫描电镜；(c)为CEP-POP-AgNNP在500nm处的透射电镜；(d)为CEP-POP-AgNNP在200nm处的透射电镜；(e)为CEP-POP-AgNNP在200nm处的透射电镜；(f)为CEP-POP-AgNNP在50nm的比例尺下的HRTEM；(g)为CEP-POP-AgNNP在5nm的比例尺下的HRTEM；(h)为CEP-POP-AgNNP在5nm的比例尺下的HRTEM；(i)为CEP-POP-AgNNP在50nm的比例尺下的元素映射；(j)为CEP-POP-AgNNP在50nm的比例尺下的C元素映射；(k)为CEP-POP-AgNNP在50nm的比例尺下的N元素映射；(l)为CEP-POP-AgNNP在50nm的比例尺下的O元素映射；(m)为CEP-POP-AgNNP在50nm的比例尺下的Fe元素映射；(n)为CEP-POP-AgNNP在50nm的比例尺下的Ag元素映射；

图3是CEP-POP-AgNNP、AgNNP、CEP-POP的Zeta电位分布图；

图4是CEP-POP-AgNNP的EDX图；

图5是CEP-POP的抗菌活性，其中(a)为通过平板计数处理CEP-POP和大肠杆菌形成的菌落照片；(b)为CEP-POP处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的存活率；

图6是体外细菌生长抑制测量；其中(a)为根据平板计数法(浓度:CEP-POP-AgNNP＝0、1、3、5μg mL

(b)为CEP-POP治疗后金黄色葡萄球菌的存活率；(c)为AgNNPs处理后金黄色葡萄球菌的存活率；(d)为CEP-POP-AgNNP治疗后金黄色葡萄球菌的存活率；(e)为基于平板计数法(浓度:CEP-POP-AgNNP＝0、1、3、5μg mL

图7是各组处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的荧光图和电镜图，其中(a)为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌与PBS、CEP-POP、AgNNPs、CEP-POP-AgNNP共孵育的荧光图像，通过PI和SYTO-9共染色试验(比例尺＝200μm)，I-Ⅳ)PBS、CEP-P-POP、AgNNPs、CEP-POP-AgNNP处理后获得的金黄色葡萄球菌；V-Ⅷ)PBS、CEP-POP、AgNNPs、CEP-POP-AgNNP处理后获得的大肠杆菌；(b)为金黄色葡萄球菌和PBS、CEP-POP、AgNNPs、AgNP-PEP-PGNNP孵育的大肠杆菌的TEM图像(比例尺＝2μm)，I-Ⅳ)PBS、CEP-P-POP、AgNNPs、CEP-POP-AgNNP处理后获得的金黄色葡萄球菌；V-Ⅷ)PBS、CEP-POP、AgNNPs、CEP-POP-AgNNP处理后获得的大肠杆菌；

图8是CEP-POP-AgNNP的生物相容性验证，其中(a)为不同浓度CEP-POP溶血试验的比较；(b)为AgNNPs的溶血试验；(c)为CEP-POP-AgNNP溶血试验；(d)为AEP-POP溶血试验的比较；(e)为不同浓度CEP-POP处理的HEK293细胞活力(％)；(f)为CEP-POP-AgNNP、AgNNPs、CEP-POP对HEK293细胞活力(％)的比较；

图9是CEP-POP、AgNNPs、CEP-POP-AgNNP的体内抗菌效果验证，其中(a)为CEP-POP、AgNNPs、CEP-POP在6、4、6、8、10天时，BALB/c小鼠背部金黄色葡萄球菌感染伤口的代表性伤口照片；(b)为治疗期间伤口愈合区域变化；(c)为治疗期间小鼠体重的变化，n＝5；误差条表示标准偏差；

图10是第10天各创面组组织的H&E和Masson三色染色结果，红色的方框表示皮下出血；绿色的方框代表血管；黄色的方框代表毛囊，比例尺为500μm；

图11是治疗10天后，各组采集的主要器官(包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)具有代表性的H&E染色图像；

图12是不同组(第10天)的血液学检查结果，其中(a)为RBC检查结果，(b)为HGB检查结果，(c)为WBC检查结果，(d)为MCV检查结果，(e)为MCHC检查结果，(f)为HCT检查结果，(g)为MCH检查结果，(h)为PLT检查结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，与传统的无机金属材料相比，多孔有机聚合物具有良好的生物相容性、低毒性，使其获得了更好的应用于生物体的安全性。到目前为止，已经成功地制备了许多多孔有机聚合物用于抗菌应用。因此如果在多孔有机聚合物中负载银基材料，可提高杀菌效果；但Ag基抗菌剂自身的特性和严重的细胞毒性大大阻碍了其临床应用。

基于此，本发明的目的是提供银基多孔有机框架材料及其制备方法和应用。本发明制备的多孔有机聚合物CEP-POP-AgNNP是以冠醚和卟啉为结构单元，具备无机金属化合物所不具备的良好生物相容性。本发明首次将超细硝普银纳米颗粒(AgNNPs)限制在冠醚基POP载体的空隙空间中，不仅显著有效地降低了纳米颗粒的毒性，而且避免了银基抗菌剂与外部环境的直接相互作用，从而大大提高了其稳定性。CEP-POP与AgNNPs的协同作用使得CEP-POP-AgNNP在极低剂量(5μg mL

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

说明：本发明所使用的重蒸吡咯由以下方法制备：准备带有磁力搅拌子的50mL圆底烧瓶，向其中加入3mL吡咯，随后在圆底烧瓶瓶口连接25mL恒压分液漏斗，关闭恒压分液漏斗旋钮使其与下方的圆底烧瓶不流通。在恒压分液漏斗的上端安装球形冷凝管，球形冷凝管的上端安装单通接口。将上述装置置于90℃的水浴锅中，将真空泵的抽气胶皮管接口连接至单通接口处，开启真空泵同时开启搅拌。待装置下方圆底烧瓶内无显著液体残留即为吡咯重蒸过程结束，重蒸所获得的吡咯冷凝并保存至恒压分液漏斗中，随后取适量投入后续反应体系中。

本发明所用二苯并-18-冠-6的英文名称为Dibenzo-18-Crown-6，还可翻译成二苯并-18-冠-6-醚或二苯并-18-冠醚-6。4，4′-二甲酰基二苯并-18-冠-6同上。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1

(1)4、4′-二甲酰基二苯并-18-冠-6的合成：

将二苯并-18-冠-6(10mmol)、CF

(2)CEP-POP的制备：

在一个250mL的三颈烧瓶中，将新鲜蒸馏的吡咯(重蒸吡咯)(16mmol)和4,4′-二甲酰基二苯并-18-冠-6(4mmol)加入120mL丙酸中。然后，在上述混合物中加入FeCl

(3)CEP-POP-AgNNP的制备

将5mg CEP-POP和60mg SNP加入2ml水中，在室温下搅拌过夜。将沉淀物离心，用蒸馏水洗涤2次，然后冷冻干燥得到SNP@CEP-POP。将40mL硝酸银溶液(1×10

实施例2

(1)4、4′-二甲酰基二苯并-18-冠-6的合成：

将二苯并-18-冠-6(10mmol)、CF

(2)CEP-POP的制备

在一个250mL的三颈烧瓶中。将新鲜蒸馏的吡咯(16mmol)和4,4′-二甲酰基二苯并-18-冠-6(4mmol)加入120mL丙酸中。然后，在上述混合物中加入(4.8mmol)的四水氯化亚铁，用氩气置换掉反应容器中的空气，将混合物在140℃的氩气气氛下回流2天。得到一种黑色粉末，用乙醇和四氢呋喃洗涤3次。最后，在真空烘箱中干燥，干燥温度为60℃，再用二氯甲烷和甲醇依次进行索氏萃取24h，萃取的温度是80℃，用蒸馏水严格洗涤，在真空烘箱中干燥，干燥温度为80℃，获得黑色固体粉末CEP-POP。

(3)CEP-POP-AgNNP的制备

将5mg CEP-POP和60mg SNP加入2ml水中，在室温下搅拌过夜。将沉淀物离心，用蒸馏水洗涤3次，然后冷冻干燥得到SNP@CEP-POP。40mL硝酸银溶液(1×10

对实施例1制备的CEP-POP-AgNNP进行表征：

(1)如图1(a)所示，最初通过傅里叶变换红外光谱FT-IR证实了CEP-POP中存在冠醚和金属卟啉单元。除了冠醚(1072cm

(2)通过图1(b)固态

(3)为了检查材料的结晶度，对实施例1制备得到的CEP-POP和CEP-POP-AgNNP进行XRD检测，见图1(c)。实施例1制备的CEP-POP的XRD显示无特征峰，揭示了无定形骨架结构。而在CEP-POP-AgNNP的衍射峰显示了AgNNPs的结晶性质，在2θ＝13.8、19.2、21.6、25.3、27.78和29.78处观察到典型峰，这些衍射峰指向AgNNPs的(010)、(110)、(210)、(-112)、(021)晶面，晶胞参数为a＝7.5218，b＝6.4087，c＝11.0134，α＝90.00000°β＝102.06°，γ＝90.00000°表明了AgNNPs单斜晶胞的结晶性质。

(4)图1(d)的热重分析表明了CEP-POP-AgNNP的热稳定性。热重分析(TGA)的热稳定性试验表明，在N

(5)图1(f)是用低温氮气吸附测定了合成材料CEP-POP-AgNNP的多孔性特征。CEP-POP-AgNNP呈现出了典型曲线，符合了IV型吸附等温线特征，这证实了大量介孔和大孔的存在。孔径分析(图1f)表明孔隙主要分布在1.96-12.72nm以内，比表面积为13.7m

(6)图2(a)-图2(b)的扫描电子显微镜(SEM)结果显示了CEP-POP-AgNNP的三维(3D)互联结构，它是由棒状粒子组成的。

(7)图2(c)-图2(f)的透射电镜(TEM)清晰地检测到CEP-POP-AgNNP多孔骨架上清晰的中孔和不规则分布的大孔。图2(h)的HRTEM可以进一步验证CEP-POP-AgNNP中AgNNPs的晶体结构，其晶格间距为0.241nm，对应于AgNNPs的(210)晶面。图2(i)-图2(n)的元素映射证实了AgNNPs的成功掺杂和元素的均匀分布。

(8)图3通过zeta电势收集到的合成材料CEP-POP-AgNNP的表面电荷，CEP-POP中存在Fe

(9)图4的TEM-EDS再次证实了AgNNPs在多孔碳骨架中成功掺杂，均匀分布的C、N、O、Fe和Ag的质量比分别为53.3wt％、15.2wt％、6.18wt％、19.5wt％和5.81wt％。

试验例1：体外细菌生长抑制试验

为了全面评估所合成的实施例1制备的CEP-POP-AgNNP对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抗菌效果，采用了共培养和平板计数方法测试聚合物本身的抗菌效果。

(1)取100uL第二代金黄色葡萄球菌(10

(2)金黄色葡萄球菌或大肠杆菌取100μL(10

试验例2：细菌活/死染色

进一步证明上述结果平板计数方法的实验结果，通过活/死染色实验进行进一步印证，使用绿色荧光核酸染料(SYTO-9)和红色荧光碘化丙啶(PI)核酸染料的细菌处理不同组：取100μL大肠杆菌或金黄色葡萄球菌(108CFU mL

试验例3：细菌的透射电子显微镜扫描

为了进一步阐明CEP-POP-AgNNP的基本抗菌机制，通过比较不同组间培养前后细菌的透射电镜图像，研究了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的超微结构损伤和组织紊乱。实验分组：将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(100μL，10

试验例4：溶血试验

取8周龄BALB/c雌性小鼠的新鲜血液，BALB/c雌性小鼠(购自济南杰瑞康生物科技有限公司)，1500rpm离心20min收集红细胞，用PBS(pH＝7.4)洗涤3次。将红细胞(4％w/w)分别与CEP-POP、AgNNPs、CEP-POP-AgNNP的PBS溶液(浓度范围均为3～5μg mL

试验例5：细胞毒性试验

细胞毒性也是评价材料生物相容性的一个重要指标，选用人体胚胎肾细胞(HEK293细胞系，来自潍坊医学院药学院)进行测试。

在96孔板中，将HEK293细胞分别以每孔8×10

试验例5：创口愈合试验

为了进一步评估体内应用潜力，构建了具有金黄色葡萄球菌感染的皮肤创伤模型的6周龄雌性BALB/C小鼠。将每只小鼠的背毛剃去，穿孔形成6mm的伤口，然后用20μL金黄色葡萄球菌(1×10

为了进一步评估细菌根除后的伤口愈合过程，对感染伤口周围采集的皮肤样本进行了苏木精染色和马松三色染色，以提供更可靠的细节(图10)。对于对照组(PBS溶液)、CEP-POP和AgNNPs，该组小鼠能够观察到明显的结痂和不完整的皮肤组织，与伤口的数码照片一致，表明伤口没有完全闭合。此外，对照组还可出现严重的皮下出血(红框)。而CEP-POP、AgNNPs和CEP-POP-AgNNP组小鼠愈合程度不同，但表现出相似的组织再生、结构排列和丰富的毛细血管分布以提供营养(蓝框)，表明皮肤组织再生迅速。CEP-POP-AgNNP组也显示出较厚的皮肤组织上皮化区域和大量的毛囊(黄框)。马松三色染色可观察到不同治疗组胶原纤维的大量再生和分布。

在背部伤口金黄色葡萄球菌感染的BALB/C小鼠模型中，发现CEP-POP-AgNNP组在第10天导致伤口完全愈合。毒理研究证实，CEP-POP、AgNNPs和CEP-POP-AgNNP对主要脏器(心、肝、脾、肾和肺)无明显炎性损伤或形态学损伤(图11)，为了验证这一推测，进行了小鼠眼球血、血液常规检测。如图12所示，麻醉后健康小鼠的RBC、HGB、WBC、MCV、MCHC、HCT、MCH、PLT、血液指数(空白组为未建立动物模型的健康小白鼠)，均在正常波动范围内，说明协同策略对小鼠是安全的，无明显毒性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。