一种负载花色苷的纳米递送系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种负载花色苷的纳米递送系统及其制备方法和应用，尤其涉及一种负载花色苷的透明质酸包覆京尼平交联白蛋白纳米递送系统及其制备方法和应用。

背景技术

花色苷是一类天然水溶性食用色素，普遍存在于植物细胞质中，是许多水果、蔬菜和谷物呈现鲜红、紫色和蓝色的主要原因。研究表明，花色苷对人体健康具有多种益处，包括抗氧化、抗炎、抗衰老、缓解视觉疲劳、改善代谢紊乱及调节肠道功能等。然而，花色苷的稳定性差，易受氧气、pH、温度和光照等因素影响而发生降解，从而使其生物活性降低。此外，在复杂的胃肠道环境中，由于体内代谢酶和pH变化等因素的存在，花色苷在消化道中的稳定性较低，生物利用度甚至不足1％。上述因素的存在限制了花色苷在食品工业中的推广和应用。

目前，提高花色苷稳定性的策略主要可分为结构修饰、分子辅色和封装技术等。然而，结构修饰的转化率较低，所需时间较长，且所添加的化学修饰剂可能影响到人体健康。辅色剂的添加往往会给食品带来不良风味，如多酚类物质会加重食品的苦涩味。近年来，利用蛋白质、多糖和脂质作为递送载体封装花色苷，能够有效改善花色苷的稳定性和生物利用度，具有优良的生物相容性、安全、无毒等优点，是近年来的研究热点，且具有较好的应用前景，但是仍存在一些问题。例如，基于多糖的纳米粒在胃肠道环境中容易发生溶胀，使负载的花色苷从颗粒孔隙中提早泄漏，其中应用最广的壳聚糖在酸性条件下易发生解离，导致花色苷在胃环境中快速释放；基于蛋白质的纳米粒由于蛋白表面电荷和疏水性的作用，其对pH值和离子强度等因素变化十分敏感，并可以在胃肠道消化酶的作用下发生降解；传统的脂质体由于自身局限，稳定性较差，长期贮存易发生聚集、磷脂氧化、药物泄漏等现象。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种负载花色苷的纳米递送系统及其制备方法和应用，尤其涉及一种负载花色苷的透明质酸包覆京尼平交联白蛋白纳米递送系统及其制备方法和应用。旨在解决现有技术制备花色苷纳米粒子稳定性差、生物利用度低、功能活性易损失等弊端。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种负载花色苷的纳米递送系统，所述负载花色苷的纳米递送系统包括负载花色苷的交联白蛋白纳米颗粒以及包覆于所述交联白蛋白纳米颗粒表面的透明质酸。

本发明采用透明质酸和交联白蛋白对花色苷进行双重包覆的方式，使其形成一种稳定的花色苷纳米递送系统，对于提高花色苷胃肠道稳定性，修复肠屏障损伤并改善肠道功能，具有重要意义。其中透明质酸能与CD44天然配体结合，实现花色苷靶向CD44高表达的炎症组织或细胞；其中白蛋白生物相容性好，属于非专属转运蛋白，能与外源性物质形成复合物，可以躲避网状内皮系统的识别与吞噬，有利于生物活性物质的递送。

该纳米递送系统的形态呈类球状，粒径均匀且圆润，包封率可达到80％以上，并在胃肠道环境中具有良好的稳定性。相较于单纯的花色苷，该纳米递送系统在模拟生理环境条件下能够抵抗胃肠道极端环境和消化酶，从而减缓花色苷的降解，使更多的花色苷顺利抵达结肠组织，有利于花色苷递送至特定结肠炎症部位，实现精准释放。试验证明，其对于葡聚糖硫酸钠(DSS)介导的Caco-2细胞肠黏膜屏障损伤具有较好的保护作用，并且其相对于单独花色苷或透明质酸钠包覆白蛋白纳米粒子，对于肠黏膜屏障损伤具有更强的改善作用，表现出一定的协同增效作用，为医药和功能食品领域中改善肠黏膜屏障功能提供了一种新的策略。

优选地，所述交联白蛋白纳米颗粒为采用天然生物交联剂进行交联的白蛋白纳米颗粒。

此外，为确保该纳米递送系统的安全性，交联白蛋白纳米颗粒的制备不采用化学交联剂(如戊二醛)，选用天然生物交联剂实现白蛋白纳米粒的交联。

优选地，所述天然生物交联剂包括京尼平。

优选地，所述白蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白或卵白蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述花色苷包括黑米花色苷、蓝莓花色苷、紫甘蓝花色苷、紫薯花色苷。

第二方面，本发明提供根据第一方面所述的负载花色苷的纳米递送系统的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将白蛋白溶液调节pH至6.5-8.5(例如pH＝6.5、pH＝6.8、pH＝7.0、pH＝7.2、pH＝7.5、pH＝7.8、pH＝8.0、pH＝8.2、pH＝8.5等)，水化处理后与无水乙醇混合，得到白蛋白纳米颗粒；

(2)将白蛋白纳米颗粒与天然生物交联剂混合孵育，得到交联白蛋白纳米颗粒；

(3)将交联白蛋白纳米颗粒与花色苷避光混合，得到负载花色苷的交联白蛋白纳米颗粒；

(4)将负载花色苷的交联白蛋白纳米颗粒与透明质酸溶液混合孵育并冷冻干燥，得到所述负载花色苷的纳米递送系统。

本发明创造性地利用透明质酸包覆京尼平交联白蛋白负载花色苷制备纳米递送系统，相较于现有技术，本发明通过特定的添加顺序和交联对花色苷进行双重包封，首先将花色苷负载于天然生物交联剂交联的白蛋白纳米粒子上，由于白蛋白与透明质酸之间的氢键和疏水作用，使得透明质酸包覆在白蛋白纳米粒子表面，实现了对花色苷的双重包封。该制备工艺简单，不使用任何具有潜在毒性的化学试剂，不需特殊设备，易于实现产业化。

优选地，步骤(1)所述白蛋白溶液的浓度为1-5％，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等，更优选1.5-2.5％。

优选地，步骤(1)所述pH采用氢氧化钠和/或盐酸溶液进行调节。

优选地，步骤(1)所述水化处理在1-8℃(例如1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等)下静置10-24h(例如12h、15h、18h、20h、24h等)。

优选地，步骤(1)所述无水乙醇与白蛋白溶液的体积比为(2.5-5):1，例如2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1等，更优选(3.5-4.5):1，以滴加的方式与白蛋白溶液混合。

优选地，步骤(2)所述天然生物交联剂在混合体系中的终浓度为2-10mg/mL，例如2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL等，更优选7-9mg/mL。

优选地，步骤(2)所述孵育在15-35℃(例如15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等)下进行18-30h(例如18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h等)。

优选地，步骤(2)所述孵育完成后还进行离心，洗涤沉淀，复溶，超声分散沉淀。

优选地，所述超声的功率为200-400W，工作1-3s，间隙2-4s，5-15min。

优选地，步骤(3)所述交联白蛋白纳米颗粒与花色苷的质量比为(16-32):1，例如16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、30:1、32:1等，更优选(22-26):1。

优选地，步骤(3)所述避光混合在20-30℃(例如20℃、22℃、25℃、27℃、30℃等)，100-300rpm(例如100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm等)摇床中避光混合30-120min(例如30min、50min、70min、80min、100min、110min、120min等)。

优选地，步骤(4)所述透明质酸在混合体系中的终浓度为0.1-0.5mg/mL，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL等，更优选0.25-0.35mg/mL。

优选地，步骤(4)所述孵育在30-42℃(例如32℃、35℃、37℃、38℃、40℃、42℃等)下进行1-5h(例如1h、2h、3h、4h、5h等)。

优选地，步骤(4)所述冷冻干燥的温度为-83～-80℃，真空度为0-8MPa，干燥时间为48-72h；冷冻干燥前先预冷，预冷温度为-83～-80℃，预冷时间为0.5～1h。

上述所列的各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

第三方面，本发明提供根据第一方面所述的负载花色苷的纳米递送系统在制备改善肠道屏障功能损伤的食品、药物或保健品中的应用。

本发明的试验结果显示，负载花色苷的纳米递送系统基本上可以完全被Caco-2细胞内化，增加了肠细胞对花色苷的摄取和利用。与单独花色苷相比，该花色苷纳米粒子对DSS损伤的Caco-2细胞的存活率和细胞膜完整性均有明显的改善作用，对肠细胞间紧密连接蛋白损伤的恢复作用也明显改善。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明采用透明质酸和交联白蛋白对花色苷进行双重包覆的方式，使其形成一种稳定的花色苷纳米递送系统，对于提高花色苷胃肠道稳定性，修复肠屏障损伤并改善肠道功能，具有重要意义。其中透明质酸能与CD44天然配体结合，实现花色苷靶向CD44高表达的炎症组织或细胞；其中白蛋白生物相容性好，属于非专属转运蛋白，能与外源性物质形成复合物，可以躲避网状内皮系统的识别与吞噬，有利于生物活性物质的递送。

该纳米递送系统的形态呈类球状，粒径均匀且圆润，包封率可达到80％以上，并在胃肠道环境中具有良好的稳定性。相较于单纯的花色苷，该纳米递送系统在模拟生理环境条件下能够抵抗胃肠道极端环境和消化酶，从而减缓花色苷的降解，使更多的花色苷顺利抵达结肠组织，有利于花色苷递送至特定结肠炎症部位，实现精准释放。试验证明，其对于葡聚糖硫酸钠(DSS)介导的Caco-2细胞肠黏膜屏障损伤具有较好的保护作用，并且其相对于单独花色苷或透明质酸钠包覆白蛋白纳米粒子，对于肠黏膜屏障损伤具有更强的改善作用，表现出一定的协同增效作用，为医药和功能食品领域中改善肠黏膜屏障功能提供了一种新的策略。

附图说明

图1是实施例1中制备本发明涉及的负载花色苷的纳米递送系统的工艺过程示意图；

图2是实施例1制得的HA-BSA

图3是实施例1制得的HA-BSA

图4是实施例1制得的HA-BSA

图5是实施例1制得的HA-BSA

图6是实施例1制得的HA-BSA

图7是流式细胞仪定量分析实施例1制得的HA-BSA

图8是实施例1制得的HA-BSA

图9是实施例1制得的HA-BSA

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供一种负载花色苷的纳米递送系统，其制备流程示意图如图1所示，具体操作如下：

(1)牛血清白蛋白纳米粒子的制备：

以超纯水配置浓度为2％的牛血清白蛋白溶液，使用1mol/L氢氧化钠或盐酸调节溶液pH值至7.0，并缓慢搅拌，4℃冰箱放置12h以充分水化。设置无水乙醇与牛血清白蛋白溶液的体积比为4:1，在600rpm搅拌速度下以1mL/min向牛血清白蛋白溶液中滴加无水乙醇，制得牛血清白蛋白纳米粒子。

(2)京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子的制备：

向上述牛血清白蛋白纳米粒子溶液中加入京尼平，使其终浓度为8mg/mL。将反应混合物在20℃下孵育24h后，10000rpm离心30min收集沉淀，然后用超纯水洗涤沉淀3次，随后用等体积的水复溶，超声分散(300w，工作2s，间隙3s，10min)，制得京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子。

(3)负载黑米花色苷的京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子的制备：

向上述制备的京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子溶液中加入黑米花色苷，使京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子与黑米花色苷的质量比为24:1，然后在25℃，200rpm的摇床中避光混匀60min，制得负载黑米花色苷的京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子。

(4)负载黑米花色苷的透明质酸包覆京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子(简称为HA-BSA

将等体积的负载黑米花色苷的京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子溶液逐滴加入至透明质酸溶液中，使透明质酸最终浓度为0.3mg/mL，37℃下孵育2h，随后将混合物进行冷冻干燥，制得负载黑米花色苷的透明质酸包覆京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子。

实施例2-5

本实施例提供四种负载花色苷的纳米递送系统，其具体操作与实施例1的区别仅在于步骤(1)中牛血清白蛋白溶液的浓度分别为1.0％、1.5％、2.5％和3.0％，其他操作条件均保持不变。

实施例6-9

本实施例提供四种负载花色苷的纳米递送系统，其具体操作与实施例1的区别仅在于步骤(2)中京尼平的终浓度分别为2、4、6和10mg/mL，其他操作条件均保持不变。

实施例10-13

本实施例提供四种负载花色苷的纳米递送系统，其具体操作与实施例1的区别仅在于步骤(3)中京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子与黑米花色苷的质量比分别为16:1、20:1、28:1和32:1，其他操作条件均保持不变。

实施例14-17

本实施例提供四种负载花色苷的纳米递送系统，其具体操作与实施例1的区别仅在于步骤(4)中透明质酸的最终浓度分别为0.1、0.2、0.4和0.5mg/mL，其他操作条件均保持不变。

对比例1

本对比例提供一种纳米粒子，其与实施例1的区别仅在于省略实施例1中的步骤(4)，即不对黑米花色苷纳米粒子进行透明质酸包覆，其他条件或者参数与实施例1一致，得到负载黑米花色苷的京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子(简称为BSA

对比例2

本对比例提供一种纳米粒子，其与实施例1的区别仅在于省略实施例1中的步骤(2)，即不对白蛋白纳米粒子进行京尼平交联，直接采用白蛋白纳米粒子负载黑米花色苷，并进行透明质酸包覆，其他条件或者参数与实施例1一致，得到负载黑米花色苷的透明质酸包覆的白蛋白纳米粒子(简称为HA-BSA-BRA)。

对比例3

本对比例提供一种纳米粒子，其与实施例1的区别仅在于省略实施例1中的步骤(3)，即不进行黑米花色苷的负载，并进行透明质酸包覆，其他条件或者参数与实施例1一致，得到透明质酸包覆京尼平交联白蛋白纳米粒子(简称为HA-BSA

测试例1

本测试例对实施例1-17制得的负载花色苷的纳米递送系统的平均粒径(nm)、PDI、Zeta电位(mV)和包埋率进行表征，平行测定3次，结果如表1和表2所示：

表1

由表1结果可知，采用本发明的制备方法制得的负载花色苷的纳米递送系统粒径分布均匀，在500nm左右，且白蛋白浓度、交联剂浓度、白蛋白颗粒与花色苷的质量比、透明质酸的浓度影响产品的粒径分布和Zeta电位，其中，PDI<0.4说明体系粒径分布均匀，粒径越小且Zeta电位绝对值越高体系越稳定。依据此原则，从实施例1-17中选出效果较好的实施例1、3、8、12和13(PDI<0.4、粒径<600nm、Zeta电位绝对值>53.5mV)，对各递送系统的黑米花色苷包埋率进行测定：

取适量样品溶液置于超滤管中，在4℃、4000rpm下离心20min。将下层液体采用pH示差法测定花色苷含量按照下式计算包埋率。

结果如表2所示：

表2

由表2数据可知，实施例1、12和13对黑米花色苷的包埋率均达到了80％以上，说明与实施例3和8相比这三种递送体系对黑米花色苷的包封更为有效，由于实施例1、12和13所采用的京尼平交联牛血清白蛋白纳米粒子与黑米花色苷的质量比分别为24:1、28:1和32:1，说明同样质量负载花色苷的纳米递送系统中实施例1所负载的花色苷含量最高，因此实施例1的效果最优。

测试例2

对实施例1制得的HA-BSA

取少量冻干后的样品粉末，以KBr压片，扫描波段范围是400～1000cm

由图可知，黑米花色苷位于1071、1639、1446和1282cm

测试例3

对实施例1制得的HA-BSA

取少量冻干后的样品粉末，采用XRD进行测试，测试条件：10min，扫描角度范围为3°～80°，扫描速率6°/min，管电流40mA，管电压40kV，Cu靶波长是1.5406埃。结果如图3所示。

由图可知，黑米花色苷在15°～30°之间存在一个比较宽的馒头峰，说明花色苷为无定形态，结晶度差或者无结晶体。透明质酸在11.31°和19.73°的2θ值处检测到两个相对尖锐的衍射峰，表明为半结晶。牛血清白蛋白没有观察到尖峰，显示聚合物的无定形行为。与透明质酸相比，花色苷纳米粒子在19.73°的2θ值处的特征衍射峰基本消失，说明透明质酸与花色苷白蛋白纳米粒子相互作用后结构发生了改变，从侧面证实了透明质酸和黑米花色苷白蛋白纳米粒子的成功结合。

测试例4

对实施例1制得的HA-BSA

将样品放置在铜网上，然后用磷钨酸进行染色。在100kV加速电压下，使用TEM对样品进行形态观察。结果如图4所示。

由图可知，产品形态呈类球状，粒径均匀且圆润，大小约为500nm，呈暗色核，周围有浅灰色边缘，表明含有花色苷的白蛋白纳米粒子被透明质酸包覆。

测试例5

对实施例1制得的HA-BSA

将装有各样品的透析袋置于盛有50mL模拟胃液的锥形瓶中，然后使其在37℃，150r/min的摇床上震荡，每20min取1mL释放介质，并补充新鲜释放介质。2h后，将90mL模拟肠液加入锥形瓶中，继续在37℃，120r/min的摇床上震荡4h，每30min取1mL释放介质，并补充新鲜释放介质，以未包埋的花色苷溶液作为对照。用pH示差法测定游离花色苷含量，计算花色苷释放率。结果如图5所示。

由图可知，游离花色苷呈爆发式零级释放，扩散速度快，在120min时累计释放量为100％。包埋后花色苷的累计释放量均显著降低。相较于黑米花色苷，本发明所涉及的纳米递送系统在模拟生理环境条件下具有显著的体外缓释特性，能够降低花色苷的降解，从而增加其生物利用率，并使更多的花色苷顺利抵达结肠，有利于提高花色苷对肠道屏障的保护作用。HA-BSA

测试例6

对实施例1制得的HA-BSA

Caco-2细胞以2×10

图6为利用荧光显微镜评估实施例1产品在Caco-2细胞中的摄取情况，左侧是由DAPI标记的Caco-2细胞，中间是由花色苷荧光纳米粒子标记的Caco-2细胞，合并图像显示细胞核周围有强烈的红色标记荧光纳米颗粒，这表明有足够数量的纳米粒子被有效地内化到Caco-2细胞中。

图7显示了流式细胞仪定量分析实施例1产品在Caco-2细胞中的摄取情况。对照组显示出最弱的荧光强度，仅为0.1％，采用实施例1方法制备出的纳米粒子的荧光强度为100％。与对照组相比，纳米粒子基本上可以完全摄入。定性和定量摄取实验结果均表明，本发明所涉及的负载花色苷的纳米递送系统表现出强大的转运能力，极大地促进细胞对花色苷的摄取。将三组样品的细胞摄取率定量结果归纳于表3中。

表3

由表3数据可知，与对比例1和2相比，采用实施例1方法制得的纳米粒子能够更好的促进黑米花色苷在细胞中的摄取，从而更有效的保护肠道屏障功能。因此，在制备花色苷纳米粒子的过程中，对白蛋白纳米粒子采用京尼平进行交联以及进行透明质酸包覆的步骤是必不可少的。

测试例7

本测试例探究实施例1制得的HA-BSA

将Caco-2细胞以2×10

HA-BSA

表4

由表4数据可知，与对比例1和2相比，采用实施例1方法制得的纳米粒子能够更好的改善Caco-2细胞的存活率和细胞膜完整性，从而更有效的保护肠道屏障功能。因此，在制备花色苷纳米粒子的过程中，对白蛋白纳米粒子采用京尼平进行交联以及进行透明质酸包覆的步骤是必不可少的。同时，与单独的黑米花色苷和载体HA-BSA

测试例8

本测试例探究实施例1制得的HA-BSA

将Caco-2细胞以2×10

图9显示了采用Western blot法进一步探究花色苷纳米粒子对DSS诱导的Caco-2细胞中紧密连接蛋白表达的影响，A为Western blot结果，B为定量结果。由图可知，DSS作用24h后，Caco-2细胞中三种紧密连接蛋白的表达水平较空白组显著降低，说明DSS会通过破坏细胞紧密连接引起细胞膜完整性受损。与DSS损伤组相比，采用实施例1方法制备的纳米粒子对Claudin 1、Occludin和ZO-1三种蛋白均有明显的恢复作用，表面花色苷纳米粒子可在一定程度上减轻DSS对紧密连接蛋白的破坏，有利于恢复肠道屏障功能。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种负载花色苷的纳米递送系统及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。