SNORD96在增加乳腺癌干细胞化疗敏感性的应用

技术领域

本发明属于肿瘤干细胞化疗耐药领域，具体涉及SNORD96在增加乳腺癌干细胞化疗敏感性的应用。

背景技术

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，也是恶性肿瘤死亡的主要原因之一，严重威胁女性的身心健康。化疗是乳腺癌主要的全身治疗方式，其虽然降低了乳腺癌死亡及复发风险，但仍有患者因为耐药复发。目前，化疗耐药是制约乳腺癌治疗效果的重要因素，在临床上亟待解决。乳腺癌干细胞因具有自我更新能力和多向分化潜能等特性，被认为是乳腺癌耐药的根源。化疗药能杀死正在分裂的肿瘤细胞，却无法有效靶向清除乳腺癌干细胞，从而使乳腺癌干细胞富集，进而导致乳腺癌耐药和复发。乳腺癌干细胞介导的耐药性是乳腺癌治疗的研究难点之一。因此，靶向乳腺癌干细胞产生耐药机制的研究具有重要的科学意义和临床价值。

SnoRNA是核仁中一类长度为60～300nt且具有保守二级结构的非编码 RNA，主要有C/D box snoRNAs与H/ACA box snoRNAs两个家族。SnoRNAs参与rRNA的加工处理，RNA可变剪切、翻译调控以及氧化应激反应等过程。SnoRNAs在多种恶性肿瘤中被证实与临床病理特征和预后相关，是近年肿瘤领域的研究热点。比如SNORA42在结直肠癌患者癌组织中明显高表达，可能是复发和预后的预测标志物。

肿瘤干细胞富集是乳腺癌化疗耐药的重要介导途径，但肿瘤干细胞耐药信号通路未完全明确，研究并明确肿瘤干细胞耐药的关键分子和重要调控通路，将为肿瘤化疗耐药提供特异且有效的靶向治疗手段，可能成为全新的肿瘤干细胞增敏措施。目前尚未见SNORD96对乳腺癌干细胞耐药性的作用尚不明确，因此，针对SNORD96在乳腺癌干细胞耐药中进行研究成为目前亟待解决的问题，靶向SNORD96促进肿瘤干细胞化疗增敏药物的应用。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于验证SNORD96作为乳腺癌的诊断标志物及治疗靶点，对调控乳腺癌干细胞化疗敏感性有一定的作用。

本发明通过球囊形成检测SNORD96对乳腺癌细胞的自我更新作用，通过流式细胞术、Westernblot实验检测SNORD96对乳腺癌细胞干性的影响，通过CCK8实验检测SNORD96对乳腺癌细胞在蒽环/紫杉类药物的杀伤作用及IC50值，有继续研究针对SNORD96的抑制剂的价值与意义。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下。

本发明提供了检测SNORD96的表达水平的试剂在制备诊断乳腺癌干细胞的产品中的应用。

本发明还提供了检测SNORD96的表达水平的试剂在制备检测乳腺癌化疗药物耐药性产品中的应用。

进一步地，所述化疗药物为蒽环或紫杉类药物。

如上任一项所述的应用，其特征在于，所述产品通过逆转录PCR、实时定量PCR、高通量测序平台检测样本中SNORD96基因的表达水平。

如上任一项所述的应用，其特征在于，所述产品中含有扩增SNORD96的特异性引物、与SNORD96核苷酸序列杂交的探针。

如上任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为芯片、制剂或试剂盒。

本发明还提供了SNORD96表达水平的抑制剂在制备增强乳腺癌干细胞对化疗药物治疗效果的药物中的应用。

本发明还提供了SNORD96表达水平的抑制剂在制备改善乳腺癌干细胞对化疗药物敏感性的药物中的应用。

如上任一项所述的应用，其特征在于，所述SNORD96的表达抑制剂包括特异性干扰SNORD96的ASO、shRNA。

更进一步地，所述的应用，其特征在于，所述ASO核苷酸序列如SEQ ID NO1.所示。

本发明相对现有技术，具有如下的优点及有益效果。

本发明首次发现了与乳腺癌干细胞化疗耐药相关的生物标志物SNORD96，通过检测患者血清/原发病灶中SNORD96的变化，结合新辅助化疗患者肿物退缩模式的变化，实现对乳腺癌化疗药物敏感性物的预测。

本发明公开了SNORD96潜在抑制剂，可用于制备乳腺癌干细胞化疗增敏药物，有利于增加乳腺癌干细胞对化疗药物的敏感性，以此提高乳腺癌患者的治疗效果及预后。

附图说明

图1为TCGA数据库中SNORD96在乳腺癌组织的表达情况以及干性标志物Nanog和OCT4在SNORD96高表达患者中的表达情况。其中，A为TCGA数据库中SNORD96在乳腺癌组织的表达情况；B为Nanog在SNORD96高低表达患者中的表达差异；C为OCT4在SNORD96高低表达患者中的差异情况。

图2为SNORD96在乳腺癌干细胞的表达情况。

图3为SNORD96促进乳腺癌细胞MDA-MB-453的自我更新能力。其中，A为转染SNORD96的乳腺癌细胞MDA-MB-453球囊形成的代表图；B为转染SNORD96的乳腺癌细胞MDA-MB-453球囊形成的统计图。

图4为过表达SNORD96的MDA-MB-453细胞CD44和CD24的表达情况。其中，A为转染SNORD96的乳腺癌细胞MDA-MB-453中CD44

图5为MDA-MB-453细胞过表达SNORD96后ALDH的表达情况。

图6为蒽环/紫杉类药物对过表达SNORD96乳腺癌细胞MDA-MB-453的杀伤作用及IC50值。其中，A为蒽环药物Doxorubicin对过表达SNORD96乳腺癌细胞MDA-MB-453的IC50值；B为紫杉类药物paclitaxel对过表达SNORD96乳腺癌细胞MDA-MB-453的IC50值。

图7为过表达SNORD96的MDA-MB-453 OCT4、Nanog和Pgp表达情况。

图8为加入抑制剂ASO-SNORD96后，乳腺癌细胞MDA-MB-453的自我更新能力、ALDH的表达情况以及对蒽环/紫杉类药物敏感性的影响。其中，A为ASO-SNORD96对乳腺癌细胞MDA-MB-453的自我更新能力作用；B为抑制SNORD96表达的MDA-MB-453细胞ALDH的表达情况；C为蒽环药物Doxorubicin对抑制SNORD96乳腺癌细胞MDA-MB-453的IC50值；D为紫杉类药物paclitaxel对抑制SNORD96乳腺癌细胞MDA-MB-453的IC50值。

具体实施方式

1.实验材料。

1.1细胞系：人乳腺上皮细胞MCF-10A、人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-453。

1.2实验试剂：DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、逆转录试剂盒（日本Toyobo公司）、荧光定量PCR试剂盒（日本Toyobo公司）、PCR相关引物（上海生工公司）、B27，bFGF，EGF三种细胞因子、PE抗人CD24抗体（美国BioLegend公司）、APC抗人CD44抗体（美国BioLegend公司）、ALDH检测试剂盒（STEMCELL公司）。

2.实验方法。

2.1 TCGA数据库分析。

（1）下载TCGA官网中（https://cancergenome.nih.gov/）乳腺癌转录组分析RNA-seq HT Seq-counts数据。

（2）将下载的数据按类型进行整合成一个文件，其中包括1222例组织的mRNA表达量，包括1109乳腺癌组织数据和113正常组织；用edge R分析包解析数据，并将数据进行标准化处理，分析SNORD96在正常组织和乳腺癌组织表达情况。

（3）从文件中提取SNORD96、OCT4、Nanog的表达值。

（4）按SNORD96表达值的中位数将TCGA数据库中1109样本分成两组：SNORD96高表达组和SNORD96低表达组，分析OCT4、Nanog在两组之间的表达差异。

2.2细胞转染。

（1）MDA-MB-453细胞转染前24h，当细胞生长密度达到70%～80%时，吸去培养基，用PBS洗涤3次，并用含有EDTA的0.25%胰蛋白酶消化约2～3min，细胞完全消化即将与培养皿完全分离前，用2mL含血清的完全培养基终止细胞消化，以1000rpm 转速离心5min后，弃去上清液，用含血清的完全培养基将细胞缓慢重悬，计数并转移接种到100mm培养皿，60mm培养皿或六孔板中以继续培养细胞，细胞密度为5×10

接下来弃去原培养基，添加配好的转染试剂，并将其置于37℃培养箱培养6h后，弃去转染用无血清培养基，更换新鲜的含血清完全培养基，培养48h。

（2）将MDA-MB-453乳腺癌细胞培养在六孔板中，待细胞生长达到50～60％时，分别使用ASO-NC和25nM、50nM、100nM浓度的ASO-SNORD96和lipo3000进行转染，当细胞生长达到80％时，可进行后续实验。

2.3细胞总mRNA提取和qRT-PCR分析。

（1）总mRNA提取，具体步骤如下。

1）按细胞量的多少加不同量的TRIZOL，一般来说，六孔板每孔加500mL TRIZOL，小皿每孔加1mL TRIZOL，静止5min后用枪吹打混匀，并将混悬液转移到EP管中，并做好标记。

2）加入TRIZOL量五分之一的氯仿，激烈摇晃1min，并静止EP管10min，待EP管中液体分层，高速离心机14000rpm离心十五分钟，能观察到管内液体明显分层。

3）上层液体呈无色透明状态，用RNA-Free枪头将该液体转移到另外一个RNA-FreeEP管，向其中滴加相同量的异丙醇，颠倒混匀，室温状态下静置十分钟，与步骤（2）相同条件离心。

4）RNA量够多能够看到白色RNA沉淀，小心地吸掉上清液，缓缓滴入75%酒精溶液清洗沉淀，颠倒清洗，8000rpm转速下离心五分钟。

5）提前预热RNA-Free水到60℃，去除上清液，静置EP管，经酒精挥发晾干，加入60μL的提前预热的RNA-Free水。

6）使用仪器检测RNA的纯度和浓度，280/260的量应该在1.8-2.2之间能够说明RNA纯度达到标准。

（2）逆转录与qRT-PCR。

1）miRNA逆转录反应：取5μM RT引物工作液5 μL，加入45 μL RNase-free H

miRNA逆转录反应体系：

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混匀以上体系，瞬时离心，在70℃放置10 min。然后冰上孵育2 min，接下来加入以下试剂进行逆转录反应：

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逆转录反应程序：42℃ 60min，70℃ 10min。反应结束后可于4℃或-20℃保存备用。

2）逆转录条件：37℃ 30min、85℃ 5min、4℃恒温保存，产物为cDNA。

3）配置qRT-PCR体系，取2×SYBR 6.25μL、cDNA 1μL、ROX 0.25μL、引物（R，F）各1μL（10μM）、RNA-Free水3μL。

4）qRT-PCR反应条件：95℃ 90s，55℃ 45s，60℃ 30s该条件反复进行48个循环，在重复过程中进行荧光值的检测，并记录荧光值达到阈值的循环数。miRNA的变化情况用2

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2.4细胞增殖CCK8实验。

（1）在96孔板中配置100μL的5000 cell/mL三阴性乳腺癌细胞悬液。将培养板在培养箱预培养过夜细胞贴壁即可（37℃，5%CO

（2）对细胞进行加不同浓度的药物处理，每种处理设置3个复孔，并设不加细胞液的调零孔和只加细胞液、不做处理空白对照孔。

（3）将培养板在培养箱孵育24h。

（4）向每孔加入10μL CCK8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

（5）将九十六孔板在培养箱内孵育1-4h。

（6）用酶标仪测定在450nm处的吸光度，一般OD值范围在0.5到2.0之间较好。

（7）活力计算：

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A（转染处理）：具有细胞、CCK8溶液和转染溶液的孔的吸光度。

A（空白）：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度。

A（0转染处理）：具有细胞、CCK8溶液而没有转染溶液的孔的吸光度。

2.5干细胞球囊形成实验。

（1）用0.25%胰蛋白酶将SNORD96过表达的MDA-MB-453细胞消化为单细胞颗粒的悬浮液（1×10

2mL DMEM-F12，10μg/L b FGF，20μg/L EGF和2% B27。

（2）培养14天后，显微镜下计数大于150μm的克隆球数量，计算球囊的平均直径。拍照，用analysis software Quantity One (Bio Rad, Hercules, California,USA) 统计。

（3）实验重复3次，每次每组细胞设3个复孔。

2.6流式细胞术。

（1）将处理好的各组细胞用PBS缓冲液洗涤，消化离心1000rpm 5min，用PBS缓冲液重悬液体，再次离心，用100μL PBS缓冲液重悬细胞。

（2）在细胞悬液中加入流式荧光抗体CD24和CD44或者ALDH试剂盒，4℃避光孵育半个小时，要注意留一组空白细胞不加荧光抗体用于画门确定细胞群。

（3）孵育完毕后离心，弃去上清液，加入1mL PBS缓冲液洗涤细胞沉淀，再次离心之后加入500μL PBS缓冲液重悬，过程中注意避光。

（4）用流式细胞仪检测细胞表面标记物在各对照组和实验组的变化。

图1A-C表明TCGA数据库中SNORD96在乳腺癌组织的表达明显高于癌旁组织，且与干性标志物OCT4和Nanog表达呈显著正相关。图2表明SNORD96在乳腺癌干细胞中表达较高。图3表明SNORD96过表达的乳腺癌细胞球囊形成能力明显增强。图4表明过表达SNORD96的乳腺癌细胞CD24

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。