一种可用于防控芋头疫病的超敏多肽及其应用

技术领域

本发明属于新型农药研发领域，涉及一种可用于防控芋头疫病的超敏多肽及其应用。

背景技术

化学农药在农业生产中发挥积极的作用，它能够有效防控作物病虫害的发生，保障作物产量的稳定。但是传统化学农药具有高毒性、高残留、对人畜及生态环境危害较大，目前被视为食品安全和环境污染的主要原因之一。因此，传统化学农药已经不能满足现代绿色农业的发展需要。随着当今人们对环境保护和食品安全的意识逐步增强，研发对人畜安全、环境影响小的绿色生物农药已成为世界各国农业病害防控领域发展的主流趋势。

Harpin蛋白是由革兰氏阴性植物病原细菌通过三型分泌系统分泌的一类富含甘氨酸且具有热稳定性的蛋白。Harpin蛋白典型作用特征是外源处理可以诱导植物叶片产生细胞死亡，即超敏反应，同时诱导植物的免疫抗性提高。因此，Harpin蛋白也常被称为超敏蛋白。植物青枯菌PopA1分泌蛋白于1994年被首次报道，其具有热稳定性且可以诱导烟草的超敏反应，因此被认定为一类Harpin蛋白，但PopA1的蛋白序列和结构特征与其他Harpin蛋白具有明显区别。然而，PopA1蛋白中能诱导超敏反应的具体肽段以及其在防控作物病害中的实际作用，至今仍不明确。

芋头疫病由芋疫霉菌(PhytophthoracolocasiaeRacib.)所引起的真菌性病害，主要为害叶片，也为害叶柄及球茎。受侵染的芋头植株，最先从叶片开始发病，导致叶片组织干枯、破裂和脱落，仅残留叶脉。病情发展后期可危害整个植株，严重时导致芋头球茎发病变褐。芋头疫病发病周期长、危害损失大，被视为影响芋头产量的主要病害之一。生产中芋头疫病的防控主要依赖化学农药，常用的化学药剂包括：嘧菌酯、氟醚烯酰、甲霜灵等。然而，目前少有针对芋头疫病所研发的有效绿色新型生物农药。本发明研发了一种植物青枯菌PopA1蛋白多肽PA105，其具有诱导烟草超敏反应的功能并可以有效防控芋头疫病的发生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可诱导植物超敏反应并可用于防控芋头疫病的超敏多肽及其应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种可用于防控芋头疫病的超敏多肽，所述超敏多肽为1)或2)：

1)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的多肽；

2)在氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的多肽的N端连接GST标签得到的融合多肽。

一种编码可用于防控芋头疫病的超敏多肽的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

一种表达可用于防控芋头疫病的超敏多肽的重组载体，其是将核苷酸序列如SEQID NO.2所示的核酸分子插入骨架载体后得到，所述骨架载体为带有GST标签的pGEX-4T-1载体。

一种表达可用于防控芋头疫病的超敏多肽的重组菌，其是将权利要求3所述的重组载体导入宿主菌后获得，所述宿主菌为大肠杆菌。

一种可用于防控芋头疫病的超敏多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)构建携带有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的核酸分子的重组载体；

(2)将步骤(1)的重组载体导入大肠杆菌感受态细胞，获得重组菌；

(3)将步骤(2)的重组菌接种培养，IPTG诱导其表达；

(4)收获步骤(3)的表达产物，并进行纯化，得到可用于防控芋头疫病的超敏多肽。

上述一种超敏多肽在诱导烟草超敏反应中的应用。

上述一种超敏多肽在防控芋疫病中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明通过简单快速的方法制备出一种超敏多肽，其可以预防性的降低芋疫病的发生，提高芋头的抗病能力。

附图说明

图1为超敏多肽的蛋白电泳图。

图2为超敏多肽诱导烟草叶片超敏反应。

图3：A为超敏多肽抑制芋疫霉菌对芋头叶片的侵染；B为芋疫霉菌侵染芋头叶片后的生物量统计。

具体实施方式

以下结合实施例进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1：超敏多肽的获得

具体步骤如下：

1)人工合成植物青枯菌PopA1蛋白编码核苷酸序列后连接入pUC57质粒，获得重组载体pUC57-PopA1。其中，所述植物青枯菌PopA1蛋白编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2)以pUC57-PopA1质粒作为模板，利用PoP-F/PoP-R引物对PCR扩增多肽PA105的编码序列。其中，所述多肽PA105的编码序列如SEQ ID NO.2所示、其对应的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，所述PoP-F/PoP-R引物对核苷酸序列如下：

PoP-F(SEQ ID NO.4)：

5’-TCGGATCTGGTTCCGCGT

PoP-R(SEQ ID NO.5)：

5’-TCAGTCACGATGCGGCCG

3)纯化回收多肽PA105的PCR产物，通过infusion重组试剂盒(全式金，货号CU201-03)连接入经BamH I和Xho I双酶切的带有GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体上，并转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，经PCR验证和测序鉴定后提取质粒，得到重组载体pGEX-4T-1-PA105。

4)将重组载体pGEX-4T-1-PA105转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆经PCR验证后摇菌，将菌液转接入5mL含有氨苄青霉素(Amp,100μg/ml)抗性的液体LB中，37℃摇床220rpm振荡培养过夜，然后按照1：100v/v的比例转接菌液至新的含有Amp(100μg/ml)抗性的液体LB中，于37℃摇床220rpm振荡培养3h左右，直至OD600值为0.4～0.6。再加入工作浓度为0.5mM的IPTG，放入37℃摇床220rpm振荡培养3h左右诱导蛋白表达。

5)将诱导菌液装入离心瓶中，4℃、7000×g离心7min集菌，弃去上清，用20mL STEbuffer(10mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA)重悬菌体沉淀，加入100μg/mL溶菌酶，冰上放置15min。用超声破碎仪破碎细胞，频率为超声开5s，关8s，功率为50％，每次时间5min，反复超声破碎3～5次，全程在冰上操作。超声破碎结束后4℃、10000×g离心10min，取上清至新的50mL离心管。

6)在上清中加入Glutathione Sepharose 4B beads(Sigma，货号4B200)，4℃孵育3h，离心后用STE buffer清洗beads 5次，最后用Elution Buffer(50mM Tris-HCl pH8.0，10mM reduced glutathion)洗脱蛋白，最终获得GST-PA105融合表达短肽(图1)。

此外，将带有GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达纯化，获得GST蛋白。

实施例2：GST-PA105融合表达短肽诱导烟草叶片产生超敏反应将纯化所得的GST-PA105融合表达短肽稀释至浓度为20μg/mL，注射四周大小的烟草叶片，以GST蛋白作为阴性对照。5天后可观察到GST-PA105融合表达短肽注射的烟草叶片部位发黄(图2)，即GST-PA105融合表达短肽诱导植物发生超敏反应，使注射部位叶片出现细胞死亡，而对照组没有明显细胞死亡。

实施例3：GST-PA105融合表达短肽抑制芋疫霉菌对芋头叶片的侵染为检测纯化所得的GST-PA105融合表达短肽对芋疫病的防治效果，对芋头叶片进行喷雾接菌芋疫病菌。使用20μg/mL的GST-PA105融合表达短肽提前一天喷施在芋头叶片上并保湿，以GST蛋白作为阴性对照。24h后将芋疫病孢子喷雾接种在芋头叶片上，保湿培养7天，观察叶片的发病情况，并统计叶片的真菌生物量。由图3A可见，GST-PA105融合表达短肽处理组与对照组相比，芋头叶片发病较轻，病斑面积较小。结果表明，GST-PA105融合表达短肽对芋疫病有显著的防治效果。由图3B可见，经GST-PA105融合表达短肽处理后芋头叶片疫霉菌生物量显著低于对照组。以上结果表明，GST-PA105融合表达短肽对芋疫病有显著的防治效果。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出等效的变化或修饰的，都应涵盖在本发明的保护范围内。