TLR4抑制剂在制备缓解索拉非尼所致胃肠道毒性的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及TLR4抑制剂在制备缓解索拉非尼所致胃肠道毒性的药物中的应用。

背景技术

索拉非尼(Sorafenib)是最早用于肝癌治疗的分子靶向药物。多项临床研究表明，索拉非尼对于不同国家地区、不同肝病背景的晚期肝癌患者都具有很好的疗效。然而，索拉非尼在使用过程中常伴随众多不良反应，其中胃肠道毒性是索拉非尼十分常见的不良反应，主要表现形式为腹泻、恶心呕吐等，发生率高达40％以上，部分患者甚至发展成胃肠道穿孔。这些不良反应常使患者生活质量降低，对索拉非尼的耐受性下降，导致临床用药减量甚至停药，极大地影响了其临床疗效。

因此，如何缓解索拉非尼引起的胃肠道副作用是目前临床上急需解决的问题。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出TLR4抑制剂在制备缓解索拉非尼所致胃肠道毒性的药物中的应用。

根据本发明的第一方面实施例的TLR4抑制剂在制备预防和/或缓解索拉非尼所致胃肠道毒性的药物中的应用。

根据本发明实施例的应用，至少具有如下有益效果：

本发明证明TLR4抑制剂对索拉非尼诱导的胃肠道毒性具有缓解作用，能够回调索拉非尼导致的小鼠体重增加缓慢，缓解索拉非尼导致的小鼠肠黏膜损伤，减轻索拉非尼导致的肠道氧化应激。这不仅拓宽索拉非尼在临床治疗中的应用，还对抑制索拉非尼胃肠道毒性药物的研究和开发提供了证据和基础，具有临床实用性。本发明同时也拓展了TAK-242的适应症，令人放心的安全性也表明其在未来的潜在应用。

根据本发明的一些实施例，所述药物可以回调索拉非尼导致的小鼠体重增加缓慢。

根据本发明的一些实施例，所述药物可以预防和/或缓解索拉非尼导致的小鼠肠黏膜损伤。

根据本发明的一些实施例，所述预防和/或缓解索拉非尼导致的小鼠肠黏膜损伤包括A1)至A5)中的至少一种；

A1)增加结肠长度；

A2)增加小肠长度；

A3)增加回肠的绒毛长度；

A4)提高绒毛长度与隐窝深度的比值；

A5)改善回肠绒毛萎缩、结构松散、缺损症状中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述药物可以减轻索拉非尼导致的肠道氧化应激。

根据本发明的一些实施例，所述减轻索拉非尼导致的肠道氧化应激包括B1)至B4)中的至少一种；

B1)降低肠道MDA含量；

B2)升高CAT活性；

B3)升高SOD活性；

B4)提高总抗氧化能力。

根据本发明的一些实施例，所述TLR4抑制剂可以是小分子、肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段、抗体模拟物、适体或核酸分子。

根据本发明的一些实施例，所述TLR4抑制剂包括TAK-242、E5531、E5564、(+)纳洛酮(Naloxone)、(-)纳洛酮、(+)纳曲酮(Naltrexone)、(-)纳曲酮、T5342126、TP6034019、IAANS、金诺芬(auranofin)、JTT705、姜黄素、樟芝酸A、黄连素中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述药物的活性成分包括TLR4抑制剂和其他可用于预防和/或缓解索拉非尼所致胃肠道毒性的成分。所述成分以不影响TLR4抑制剂的效果为宜。所述成分包括但不限于盐酸洛哌丁胺、蒙脱石散、甲氧氯普胺(胃复安)、地塞米松、苯海拉明、氯丙嗪、昂丹司琼或利达脒。

根据本发明的一些实施例，所述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

根据本发明的一些实施例，所述药物的剂型为颗粒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、片剂、乳剂或混悬剂。

在本发明中，药物治疗的对象为哺乳动物类，包括人、小鼠等。本领域技术人员可以根据人与实验动物的等剂量换算关系，利用人体的剂量换算出动物的单位体重剂量。按照单位体重剂量换算，小鼠的等效剂量约为人的0.75倍。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

附图说明

图1为本发明的TLR4抑制剂对索拉非尼所致胃肠道毒性的缓解作用的技术路线图；

图2为各处理组小鼠的体重变化结果；

图3为各处理组小鼠的结肠(A)和小肠(B)长度检测结果；

图4为各处理组小鼠的回肠组织病理变化；

图5为各处理组小鼠的回肠绒毛长度(A)、隐窝深度(B)及V/C值(C)的变化；

图6为各处理组小鼠的肠组织中T-AOC(A)、CAT(B)、SOD活性(C)和MDA含量(D)的检测结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本发明的实施例中，C57BL/6J小鼠购自维通利华实验动物技术有限公司，饲养于深圳市药品检验研究院实验动物中心的SPF级屏障环境中；

小鼠饲料由深圳市药品检验研究院实验动物中心提供；

索拉非尼购自MedChemExpress(MCE)，货号为HY-10201；

TLR4抑制剂(TAK-242)购自MedChemExpress(MCE)，货号为HY-11109；

羧甲基纤维素钠(CMC)购自Macklin，货号为C804625；

二甲基亚砜(DMSO)购自Solarbio，货号为D8370；

无菌生理盐水购自广州云源生物科技有限公司，货号为GY-128；

磷酸缓冲盐溶液(PBS,phosphate buffer saline)购自武汉赛维尔(Servicebio)生物科技有限公司，货号为G4202；

通用型组织固定液购自武汉赛维尔(Servicebio)生物科技有限公司，货号为G1101；

过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒购自Solarbio，货号为BC0205；

总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒购自Solarbio，货号为BC1315；

丙二醛(MDA)含量检测试剂盒购自Solarbio，货号为BC0025；

超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒购自Solarbio，货号为BC0175。

TLR4抑制剂对索拉非尼所致胃肠道毒性的缓解作用

将30只C57BL/6J小鼠(20g±2g，雄性，五周龄)适应性饲养一周后，随机分成4组，分别为正常对照组(Control，n＝7)、索拉非尼组(Sorafenib，n＝7)、TLR4抑制剂组(TAK-242-C，n＝8)、索拉非尼+TLR4抑制剂联用组(TAK-242-S，n＝8)；共给药处理21天，并每天记录小鼠体重。最后一次给药24h后处死小鼠，收集小鼠的肠组织，并记录结肠长度和小肠长度；同时，剪取1～1.5cm长度的回肠末端组织，用4℃提前预冷的PBS溶液冲洗干净后置于通用型组织固定液中固定24h，送武汉赛维尔生物科技有限公司进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,H&E)染色，以进行组织病理分析(用Aperio GT 450自动大容量数字病理载玻片扫描仪进行图像采集，并进行组织病理学评估；从各组样本中各随机选取3个样本，利用Aperio ImageScope病理学载玻片检视软件测量回肠绒毛长度和隐窝深度(n＝3))；其余的肠组织在液氮中速冻，保存于超低温冰箱中，用于后续生化指标(CAT活性、T-AOC、MDA含量、SOD活性)的分析(n＝6，从各组样本中各随机选取6个样本)，步骤按照相应的试剂盒的说明书进行。

实验的技术路线图如图1所示。各组小鼠的给药情况如下：

正常对照组(Control)：经口灌胃助溶剂0.5％的羧甲基纤维素钠溶液，用量为0.1mL/kg，每天一次；

索拉非尼组(Sorafenib)：以120mg/kg的剂量经口灌胃索拉非尼混悬溶液，用量为0.1mL/kg，每天一次；

TLR4抑制剂组(TAK-242-C)：以3mg/kg的剂量经腹腔注射TAK-242溶液，用量为0.1mL/kg，每2天一次；

索拉非尼+TLR4抑制剂联用组(TAK-242-S)：以120mg/kg的剂量经口灌胃索拉非尼混悬溶液，用量为0.1mL/kg，每天一次；以3mg/kg的剂量经腹腔注射TAK-242溶液，用量为0.1mL/kg，每2天一次。

其中，索拉非尼混悬溶液的制备方法为：准确称量0.5g羧甲基纤维素钠，取100mL蒸馏水于玻璃烧杯中；将烧杯置于加热型磁力搅拌器上，多次少量地将称量好的羧甲基纤维素钠(CMC)撒于水面，边加边搅拌，直至溶液澄清透明，得到0.5％羧甲基纤维素钠溶液(现配现用)；将索拉非尼加入0.5％羧甲基纤维素钠溶液中进行超声溶解，即得索拉非尼混悬溶液。

TAK-242溶液的制备方法为：将TAK-242溶解于DMSO中，然后在无菌生理盐水中稀释至DMSO最终浓度为1％(现配现用)。

采用GraphPad Prism 8进行统计分析。除非另有说明，所有值均表示为均值±标准差(Mean±SEM)。使用单因素方差分析(One-way ANOVA)或双因素方差分析(Two-wayANOVA)分析各组间的差异。在所有情况下，p<0.05被认为具有统计学意义，其中，*表示有显著性差异(p<0.05)，**表示有极显著性差异(p<0.01)，***表示有极显著性差异(p<0.001)。

结果如图2至图6所示。

在实验期间，正常对照组小鼠体重保持稳定增长。与正常对照组相比，在给药后，索拉非尼组小鼠体重在实验前期出现明显的下降，实验后期开始慢慢恢复，但仍然呈现体重增加缓慢的趋势。而联用TAK-242后能够回调索拉非尼导致的小鼠体重增加缓慢。如图2所示。

各肠段的长度是评估肠道炎症的重要参数之一。与正常对照组相比，索拉非尼组小鼠结肠和小肠长度明显变短，而联用TAK-242后能够逆转索拉非尼所致的小鼠结肠和小肠长度变短。如图3所示。

正常对照组小鼠回肠的绒毛和隐窝排列规则、形态完整，索拉非尼组小鼠的回肠绒毛萎缩，结构松散，甚至出现缺损等症状。而联用TAK-242后，回肠绒毛萎缩，结构松散，甚至出现缺损等症状较轻。如图4所示。

绒毛长度(Villi length)、隐窝深度(Crypt depth)和绒毛长度与隐窝深度的比值(V/C)是评估肠道形态结构的常用指标，可用来表征肠道的健康状况；绒毛的缩短和更深的隐窝会减少肠道表面积的养分吸收，V/C比值下降表明黏膜受损，消化吸收能力下降。与正常对照组相比，索拉非尼组小鼠回肠的绒毛长度显著降低，隐窝深度变化不大，V/C值显著降低；与索拉非尼组相比，索拉非尼+TLR4抑制剂联用组小鼠回肠的绒毛长度显著升高，V/C值显著增加。如图5所示。

MDA水平和抗氧化酶的活性可用于评估肠组织的氧化应激状态。与正常对照组相比，索拉非尼组小鼠肠组织的总抗氧化能力降低，CAT活性和SOD活性显著降低，MDA含量升高(表明机体处于脂质过氧化状态)；而联用TAK-242能显著减轻由索拉非尼导致的肠组织CAT活性、SOD活性的降低以及MDA含量的升高。

综上可知，TAK-242能够回调索拉非尼导致的小鼠体重增加缓慢，缓解索拉非尼导致的小鼠肠黏膜损伤，减轻索拉非尼导致的肠道氧化应激。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。