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形态学标志物染色

文献发布时间：2024-04-18 19:58:26

相关申请的交叉引用

本公开要求于2021年4月18日提交的美国临时专利申请第63/176,326号的权益，该申请的公开内容全文通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及用不同的可检测部分来标记一种或多种形态学标志物和/或一种或多种生物标志物。

背景技术

免疫组织化学(IHC)是指使用对抗原具有特异性的抗体来检测、定位和/或定量生物学样品中的抗原(诸如蛋白质)的过程。在细胞样品(诸如组织样品)中，IHC提供以下实质性优势：提供有关特定蛋白质在生物学样品中的位置的信息。原位杂交(ISH)是指使用核酸探针来检测、定位和/或定量样品中可能存在的DNA和RNA内的特异性核酸序列的过程。可以对各种生物学样品，例如组织样品(例如经新鲜冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE))和细胞学样品执行IHC和ISH两者，并且可以将两者用于检测各种特异性抗原和序列靶标。可以使用各种标记物(例如，显色的、荧光的、发光的、辐射的)来检测(诸如可视化)抗体和核酸探针对样品内靶标的辨识。辨识事件的扩增是期望的，和置信地检测低丰度的细胞标志物的能力一样。例如，响应于单个抗原检测事件，在标志物位点沉积数百个或数千个标记物分子，通过扩增增强了检测识别事件的能力。

扩增通常伴随有不良事件，诸如随着背景信号的增加，非特异性信号变得明显。增加的背景信号将掩盖可能与较低但有临床意义的表达相关联的微弱信号，从而干扰临床分析。因此，虽然辨识事件的扩增是期望的，但非常期望将背景信号最小化的扩增方法。

甚至经样品内的核酸和蛋白质靶标的精确定位，还可以从这些靶标相对于具有细胞和组织的特异性形态学结构的位置获得附加诊断信息。用于形态学结构的可视化的常规明场染色剂通常为广泛吸收的染料，该染料可能对针对单个样品将IHC和ISH检测与形态学染色相结合提出挑战，特别是当存在对在单个样品内多种靶标在其形态学环境中的多重检测的需求或期望时。例如，苏木精和伊红(H&E)染色剂的广泛吸收贡献整个可见光谱上的强烈吸收，这掩盖其他原本可以通过显微镜可见的显色化合物。H&E吸收使图像分析技术对靶标分子的定量复杂化，该图像分析技术依赖于用于检测靶标分子和形态学染料的可见色原的光谱贡献的解混。因此，更常见的是在所谓的“连续载玻片”中针对一种或多种靶标对第一组织切片进行染色，并针对形态学染色剂对第二组织切片进行染色。替代性地，可以首先针对一种或多种靶标或形态学染色剂中的任一者对组织进行染色以使组织切片脱色，并且然后针对一种或多种靶标或形态学染色剂中的另一者进行染色。另一种可能性是通过对染色剂的稀释或减少样品与染色剂接触的时间来减小常规形态学染色剂的强度，以免遮盖靶标IHC和ISH信号。这些替代方案中的每一个均具有缺点。

在用切片机从组织切割的连续薄片中，每次相继切割时均切下新的一组细胞，并且因此，来自组织块的连续薄片在形态上并不总是彼此匹配。染色、脱色和再染色可能损害组织结构和形态，尤其是如果必须重复进行染色、脱色和再染色以实现更高阶的多重的话。如果对常规形态学染色剂的染色强度的减小进行利用，精细的形态学特征可能因不充分的染色而变得难以辨别，然而，无论苏木精染色水平是否较低，可用检测光谱的大部分对于检测生物标志物来说不太有用，因为必须将广泛苏木精吸收从与其重叠的任何生物标志物信号解混。因此，期望提供用于建立针对一个或多个生物标志物信号的形态学环境同时仍允许对一个或多个生物标志物信号本身的检测的改进方法。

发明内容

在一个方面，本公开涉及标记生物学样品中的一种或多种形态学标志物以在手动或自动化显微分析期间提供样品内的形态学环境的方法。在一些实施例中，所公开的形态学标志物标记方法与生物标志物检测方法组合，以向在生物学样品内检测到的一种或多种生物标志物的位置提供形态学环境。例如，对一种或多种形态学标志物和一种或多种医学相关生物标志物的组合进行染色可以用于帮助确定一种或多种医学相关生物标志物相对于通过对一种或多种形态学标志物的染色可视化的形态学特征(例如细胞成分、细胞核等)的一个或多个位置。在一些实施例中，一种或多种形态学标志物可以表示相同形态学特征或者具有相同形态学特征的特性。在其他实施例中，一种或多种形态学标志物可以表示不同标志物形态学特征或者具有不同标志物形态学特征的特性。生物标志物存在以及样品中相对于形态学特征的生物标志物位置通常指示特定的医学状况，并且可以决定患者对于利用特定类别的治疗剂的靶向治疗是否符合条件。生物标志物存在以及生物标志物位置还可以作为针对染色过程本身的质量控制，实现对异常染色模式的检测，该异常染色模式可能表明各种过程步骤失败，例如未能正确地将试剂分配到样品。在一些实施例中，一种或多种形态学标志物和/或一种或多种生物标志物用可检测部分(诸如包括香豆素核、吩噁嗪酮核、4-羟基-3-吩噁嗪酮核、7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮核、硫堇鎓核、吩噁嗪核、吩噁噻-3-酮核、氧杂蒽核、七甲川菁核和克酮酸盐核的那些)来染色。

在另一方面，所公开的形态学标志物标记方法释放光谱波长范围来检测单个样品中的一种或多种生物标志物，特别是针对明场多重(其中使用常规化学复染剂，生物标志物信号原本将变得被遮盖)。因此，在一些实施例中，具有窄第一吸收带的可检测部分沉积为在细胞或组织样品内的一个或多个形态学特征的至少一部分上、横跨该至少一部分或接近该至少一部分，从而保留用于对同一样品中的一种或多种生物标志物的检测的可用检测光谱，即使它们以低丰度存在。在特定实施例中，对具有电磁光谱的UV部分(诸如UVA部分)中的窄第一吸收带的可检测部分进行利用。在其他特定实施例中，对具有电磁光谱的近IR(NIR)部分中的窄第一吸收带的可检测部分进行利用。在一些实施例中，可检测部分包括具有香豆素核、吩噁嗪酮核、4-羟基-3-吩噁嗪酮核、7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮核、硫堇鎓核、吩噁嗪核、吩噁噻-3-酮核、氧杂蒽核、七甲川菁核和克酮酸盐核的那些。

通过将可用波长的范围扩展到UV和NIR中并使用具有窄第一吸收带的可检测部分，可以执行高度多重测定。因此，例如，在一些实施例中，可以在单个样品中检测到与至少一个形态学特征处于空间关系的至少一种形态学标志物以及5种或更多种，诸如7种或更多种、9种或更多种、10种或更多种或者11种或更多种生物标志物。在其他实施例中，两种或更多种形态学标志物以及至少4种或更多种，诸如6种或更多种、8种或更多种或者10种或更多种生物标志物与两种或更多种形态学标志物处于空间关系。例如，图13示出了可以经选择和沉积用于检测形态学标志物和生物标志物的所公开的可检测部分的特定光谱调色板，显然多个生物标志物信号和形态学标志物信号的极高阶多重是可能的。

在一些实施例中，可检测部分共价沉积到生物学样品上，产生可以相对于生物学样品的特定部分(诸如一个或多个形态学特征和一种或多种生物标志物)所染色的次序灵活地处理的样品。例如，可以首先检测一个或多个形态学特征，接着检测一种或多种生物标志物。替代性地，可以首先执行对一种或多种生物标志物的检测，接着是对一个或多个形态学特征的染色。总体来说，生物标志物染色和形态学染色的任何特定次序均是可能的。

在一些实施例中，发色团或可检测部分的共价沉积是使用酪酰胺信号放大(TSA)完成的，该TSA也称为催化报告沉积(CARD)。美国专利第5,583,001号公开了一种使用分析物依赖性酶活化系统检测和/或定量分析物的方法，该系统依赖催化报告沉积来放大可检测标记物信号。通过使带标记的苯酚分子与酶反应来增强CARD或TSA方法中酶的催化作用。利用TSA的现代方法有效地增加了从IHC和ISH测定中获得的信号，同时不产生显著的背景信号放大(参见例如美国申请公开第2012/0171668号，其有关与酪酰胺扩增试剂的公开内容据此通过引用全文并入本文)。用于这些扩增方法的试剂正被应用于临床上重要的靶标，以提供先前无法实现的稳定的诊断能力(VENTANA OptiView扩增试剂盒，Ventana MedicalSystems，Tucson AZ，目录号760-099)。

TSA利用作用于酪酰胺的辣根过氧化物酶(HRP)所催化的反应。在H

在其他实施例中，使用醌甲基化物化学来执行发色团或可检测部分的共价沉积。于2019年1月1日授权的名称为"Quinone Methide Analog Signal Amplification"的美国专利第10,168,336号描述了一种与TSA一样可用于增加信号放大而不显著增加背景信号的技术("QMSA")。特别地，美国专利第10,168,336号描述了新颖的醌甲基化物类似物前体以及使用这些醌甲基化物类似物前体检测生物学样品中的一个或多个靶标的方法。在特定实施例中，检测方法包括使样品与检测抗体或探针接触，然后使样品与包含碱性磷酸酶(AP)和结合部分的标记缀合物接触，其中该结合部分识别抗体或探针(例如，通过与半抗原或物种特异性抗体表位或其组合结合)。标记缀合物的碱性磷酸酶与包含可检测部分的醌甲基化物类似物前体相互作用，从而形成反应性醌甲基化物类似物，该反应性醌甲基化物类似物与生物学样品近端或直接在靶标上共价结合。然后检测(诸如目视或通过成像技术)可检测标记物。美国专利第10,168,336号全文以引用方式并入本文。

另一种用于沉积可检测部分的技术采用“点击”化学来形成样品中可检测部分与形态学标志物或生物标志物之间的共价键。“点击化学”是一种化学原理，其由Sharpless和Meldal的研究组独立地定义，描述了定制以通过将小单元连接在一起而快速可靠地生成物质的化学过程。“点击化学”已应用于一组可靠并且自主的有机反应(Kolb,H.C.；Finn,M.G.；Sharpless,K.B.Angew.Chem.Int.Ed.2001,40,2004-2021)。在将可检测标记物共价沉积到生物学样品上的背景下，US2019/0204330中描述了一种点击化学技术，其通过引用并入本文。在该技术中，利用如上所述的酪酰胺沉积或同样如上所述的醌甲基化物沉积将能够参与点击化学反应的第一反应性基团共价锚定至生物学样品。该检测系统的第二组分具有对应的能够参与点击化学反应的第二反应性基团，其然后与第一反应基团反应以将使该第二组分与生物学样品共价结合。在特定实施例中，所述技术包括使生物学样品与特定于第一靶标的第一检测探针接触。第一检测探针可以为一抗探针或核酸探针。随后，使样品与第一标记缀合物接触，该第一标记缀合物包含第一酶。在一些实施例中，第一标记缀合物为二抗，该二抗特定于一抗(诸如由其获得抗体的物种)或缀合至核酸探针的标记物(诸如半抗原)。接下来，使生物学样品与点击缀合物对的第一成员接触。第一酶切割具有酪酰胺或醌甲基化物前体的点击缀合物对的第一成员，从而将该第一成员转化为反应性中间体，该反应性中间体与生物学样品近端或直接在第一靶标上共价结合。接下来，使点击缀合物对的第二成员与生物学样品接触，该点击缀合物对的第二成员包括第一报告部分(例如，发色团)和第二反应性官能团，其中第一击缀合物对的第二成员的第二反应性官能团能够与该点击缀合物对的第一成员的第一反应性官能团反应。最后，检测来自第一报告部分的信号。

在一个实施例中，公开了一种用于检测生物学样品内形态学环境中的生物标志物的方法，其中该方法包括用第一可检测部分来标记生物学样品的第一形态学特征的至少一部分，其中标记第一形态学特征(例如细胞核或其部分)包括使具有第一形态学特征的特性的形态学标志物(例如DNA或组蛋白标志物)与结合至形态学标志物的第一检测探针接触。该方法进一步包括将第一可检测部分共价沉积在第一检测探针与具有形态学特征的特性的形态学标志物结合的位置处或附近。用第二可检测部分对生物学样品中的第一生物标志物的标记也是该方法的一部分，其中第二可检测部分不同于第一可检测部分，并且其中对第一生物标志物的标记包括使第一生物标志物与结合至第一生物标志物的第二检测探针接触。该方法进一步包括将第二可检测部分共价沉积在第二抗体与第一生物标志物结合的位置处或附近。在一些实施例中，第一和第二可检测标志物包括具有香豆素核、吩噁嗪酮核、4-羟基-3-吩噁嗪酮核、7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮核、硫堇鎓核、吩噁嗪核、吩噁噻-3-酮核、氧杂蒽核、七甲川菁核和克酮酸盐核的那些。

在更特定的实施例中，形态学特征为细胞内的细胞核或细胞核的成分，并且形态学标志物存在于细胞中的细胞核或细胞核的成分中。在甚至更特定的实施例中，第一检测探针为针对生物学样品中的细胞核的成分(例如DNA、组蛋白等)以及一种或多种生物标志物的抗体。本文描述了其他合适的形态学特征以及形态学标志物和生物标志物的示例。

在一些实施例中，对一种或多种形态学标志物的标记向一种或多种经标记的生物标志物提供位置环境。在一些实施例中，对一种或多种形态学标志物的标记允许细胞和/或组织形态与一种或多种经标记的生物标志物同时经检测和/或可视化。在一些实施例中，对一种或多种形态学标志物的标记用作针对特殊染色剂的替代物。在其他实施例中，对一种或多种形态学标志物的标记用作针对复染剂(例如苏木精)的代替物。本文描述了根据本发明公开的方法对样品进行染色的这些和其他有利用途。

本公开的另一方面为一种检测生物学样品内的一种或多种靶标的方法，该方法包括：用第一可检测部分来标记第一形态学标志物，其中第一可检测部分具有FWHM小于约200nm的第一吸收峰以及介于330nm+/-10与950nm+/-10之间的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，第一和/或第二可检测部分的具有FWHM的第一吸收峰小于约130nm。在一些实施例中，第一和/或第二可检测部分的具有FWHM的第一吸收峰小于约100nm。在一些实施例中，第一和/或第二可检测部分的具有FWHM的第一吸收峰小于约80nm。在一些实施例中，第一和/或第二可检测部分的具有FWHM的第一吸收峰小于约60nm。

在一些实施例中，第一可检测部分的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，第一形态学标志物包括DNA。在一些实施例中，用第一可检测部分对DNA的标记包括：(a)使生物学样品与抗DNA一抗接触；(b)使生物学样品与对抗DNA一抗具有特异性的抗物种二抗接触，其中抗物种抗体直接或间接与至少一种酶缀合；以及(c)使生物学样品与第一可检测缀合物接触，该第一可检测缀合物包含：(i)第一可检测部分，以及(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物。在一些实施例中，用第一可检测部分对DNA的标记包括：(a)使生物学样品与抗DNA一抗接触；(b)使生物学样品与对抗DNA抗体具有特异性的抗物种二抗接触，其中抗物种抗体直接地或间接地与至少一种酶缀合；(c)使生物学样品与第一组织反应性缀合物接触，该第一组织反应性缀合物包含：(i)能够参与点击化学反应的反应性官能团对的第一成员，以及(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(d)使生物学样品与可检测缀合物接触，该可检测缀合物包含：(i)第一可检测部分，以及(ii)反应性官能团对的第二成员。在替代性实施例中，一抗用半抗原来标记，并且二抗特异性地结合至与一抗缀合的半抗原。

在一些实施例中，第一形态学标志物包括组蛋白。在一些实施例中，用第一可检测部分对组蛋白的标记包括：(a)使生物学样品与抗组蛋白一抗接触；(b)使生物学样品与对抗组蛋白一抗具有特异性的抗物种二抗接触，其中抗物种抗体直接或间接与至少一种酶缀合；以及(c)使生物学样品与第一可检测缀合物接触，该第一可检测缀合物包含：(i)第一可检测部分，以及(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物。在一些实施例中，用第一可检测部分对组蛋白的标记包括：(a)使生物学样品与抗组蛋白一抗接触；(b)使生物学样品与对抗组蛋白抗体具有特异性的抗物种二抗接触，其中抗物种抗体直接或间接与至少一种酶缀合；(c)使生物学样品与第一组织反应性缀合物接触，该第一组织反应性缀合物包含：(i)能够参与点击化学反应的反应性官能团对的第一成员，以及(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(d)使生物学样品与可检测缀合物接触，该可检测缀合物包含：(i)第一可检测部分，以及(ii)反应性官能团对的第二成员。在替代性实施例中，一抗用半抗原来标记，并且二抗特异性地结合至与一抗缀合的半抗原。

在一些实施例中，第一形态学标志物选自由以下项组成的组：针对胞质溶胶的标志物、细胞核标志物、细胞核膜标志物、针对细胞核的标志物、针对肌动蛋白丝的标志物、针对中心体的标志物、针对中心粒卫星的标志物、针对中间丝的标志物、针对微管结构的标志物、线粒体标志物、针对内质网的标志物、高尔基体标志物、质膜标志物和囊泡细胞器标志物。合适的形态学标志物、抗体和抗体源在下表4至10中提供。

在一些实施例中，第一生物标志物为蛋白质生物标志物。在一些实施例中，第一生物标志物选自由以下项组成的组：PD-L1、Ki-67、CD3、CD8、CD4、CD20、CD68、p40、p63、TTF-1、ERG、ERBB2(HER2)、α-甲基酰基-辅酶A消旋酶(AMACR)和突触素。在一些实施例中，第一生物标志物为选自由以下项组成的组的核酸生物标志物：ERBB2、EGFR、PTEN、p63、TOP2A、CCND1、RREB1、CKS1B、CDKN2C、MCL1、NTRK1、PBX1、ALK、N-MYC、BCL6、PIK3CA、RPN1、TERC、IGH、FGFR3、PDGFRA、EGR1、PDGFRB和NSD1。

在一些实施例中，第一可检测部分包含香豆素核。在一些实施例中，第二可检测部分在可见光谱范围内或红外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λ

在一些实施例中，第一可检测部分包含吩噁嗪酮核、4-羟基-3-吩噁嗪酮核、7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮核、硫堇鎓核、吩噁嗪核、吩噁噻-3-酮核或氧杂蒽核。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内或红外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在可见光谱范围内。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λ

在一些实施例中，第一可检测部分包含七甲川菁核或克酮酸盐核。在一些实施例中，第二可检测部分在可见光谱范围内或紫外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在红外光谱范围内。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λ

本公开的进一步方面为一种检测生物学样品内的一种或多种靶标的方法，该方法包括：用第一可检测部分来标记第一形态学标志物，该第一可检测部分包含选自由以下项组成的组的核：香豆素核、吩噁嗪酮核、4-羟基-3-吩噁嗪酮核、7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮核、硫堇鎓核、吩噁嗪核、吩噁噻-3-酮核、氧杂蒽核、七甲川菁核和克酮酸盐核；用第二可检测部分来标记第一生物标志物，该第二可检测部分包含选自有以下项组成的组的核：香豆素核、吩噁嗪酮核、4-羟基-3-吩噁嗪酮核、7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮核、硫堇鎓核、吩噁嗪核、吩噁噻-3-酮核、氧杂蒽核、七甲川菁核和克酮酸盐核；其中第一和第二可检测部分不同并且具有相差至少10nm的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，第一和第二可检测部分的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，第一生物标志物为癌症生物标志物。合适的癌症生物标志物包括Ki-67、PD-L1、ER、PR、ERBB2(HER2)、EGFR、AMACR、CD8、CD3或ERG。在一些实施例中，第一形态学标志物包括DNA。在一些实施例中，第一形态学标志物包括组蛋白。在一些实施例中，第一形态学标志物选自由以下项组成的组：针对胞质溶胶的标志物、针对细胞核的标志物、细胞核膜标志物、针对细胞核的标志物、针对肌动蛋白丝的标志物、针对中心体的标志物、针对中心粒卫星的标志物、针对中间丝的标志物、针对微管结构的标志物、线粒体标志物、针对内质网的标志物、高尔基体标志物、质膜标志物和囊泡细胞器标志物。

在一些实施例中，该方法进一步包括用第三可检测部分来标记第二生物标志物，其中第三可检测部分不同于第一和第二可检测部分，并且其中第一、第二和第三可检测部分具有相差至少10nm的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，第一和第二可检测部分选自由以下项组成的组：

其中符号

本公开的另一方面为一种生物学样品，该生物学样品包含：(a)用第一可检测部分标记的第一形态学标志物；以及(b)用第二可检测部分标记的第一生物标志物；其中第一和第二可检测部分各自具有FWHM小于约200nm的第一吸收峰以及介于330nm+/-10与950nm+/-10之间的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，第一形态学标志物选自由以下项组成的组：针对胞质溶胶的标志物、针对细胞核的标志物、细胞核膜标志物、针对细胞核的标志物、针对肌动蛋白丝的标志物、针对中心体的标志物、针对中心粒卫星的标志物、针对中间丝的标志物、针对微管结构的标志物、线粒体标志物、针对内质网的标志物、高尔基体标志物、质膜标志物和囊泡细胞器标志物。在一些实施例中，第一形态学标志物为DNA。在一些实施例中，第一形态学标志物为组蛋白。

本公开的进一步方面为一种生物学样品，该生物学样品包含：(a)用第一可检测部分标记的第一生物标志物；以及(b)用第二可检测部分标记的DNA或组蛋白中的一者；其中第一和第二可检测部分各自具有FWHM小于约200nm的第一吸收峰以及介于330nm+/-10与950nm+/-10之间的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，生物学样品进一步包含用第三可检测部分标记的第二生物标志物，其中第一、第二和第三可检测部分具有相差至少10nm的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，生物学样品进一步包含用第四可检测部分标记的第三生物标志物，其中第一、第二、第三和第四可检测部分具有相差至少10nm的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，第一和第二可检测部分选自由以下项组成的组：

其中符号

本公开的进一步方面为一种生物学样品，该生物学样品包含：(a)用第一可检测部分标记的第一形态学标志物；以及(b)用第二可检测部分标记的第一生物标志物；其中第一和第二可检测部分各自具有FWHM小于约200nm的第一吸收峰以及介于330nm+/-10与950nm+/-10之间的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，第一和第二可检测部分的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，第一可检测部分包含香豆素核。在一些实施例中，第二可检测部分在可见光谱范围内或红外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有间隔至少20nm的吸光度最大值(λmax)。

在一些实施例中，第一可检测部分包含吩噁嗪酮核、4-羟基-3-吩噁嗪酮核、7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮核、硫堇鎓核、吩噁嗪核、吩噁噻-3-酮核或氧杂蒽核。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内或红外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在可见光谱内。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。

在一些实施例中，第一可检测部分包含七甲川菁核或克酮酸盐核。在一些实施例中，第二可检测部分在可见光谱范围内或紫外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在红外光谱范围内。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。

在一些实施例中，第一和第二可检测部分的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，第一可检测部分包含香豆素核。在一些实施例中，第二可检测部分在可见光谱范围内或红外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。

本公开的还进一步方面为一种生物学样品，该生物学样品包含：(a)用第一可检测部分标记的第一形态学标志物；以及(b)用第二可检测部分标记的第一生物标志物；其中第一和第二可检测部分各自具有FWHM小于约200nm的第一吸收峰以及介于330nm+/-10与950nm+/-10之间的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，生物学样品通过使生物学样品与对第二生物标志物具有特异性的第三一抗接触来进一步制备。在一些实施例中，第一和第二可检测缀合物选自由以下项组成的组：

在一些实施例中，制备生物学样品的过程进一步包括使生物学样品与对第二生物标志物具有特异性的第三一抗接触。

在一些实施例中，第一和第二可检测部分选自由以下项组成的组：

本公开的进一步方面为一种试剂盒，该试剂盒包括：(a)对第一形态学标志物具有特异性的一抗；(b)对第一生物标志物具有特异性的一抗；以及(c)至少两种检测缀合物，其中至少两种检测缀合物各自包含不同的可检测部分，其中每个可检测部分具有FWHM小于约200nm的第一吸收峰以及介于330nm+/-10与950nm+/-10的吸光度最大值(λ

在一些实施例中，至少两种检测缀合物选自由以下项组成的组：

附图说明

本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，将向专利局提供带有彩色附图的专利或专利申请公布的拷贝。

图1展示了根据本公开的一个实施例的检测与生物学样品中的一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物相对应的信号的方法。

图2A展示了根据本公开的一个实施例的用可检测部分来标记一种或多种形态学标志物和/或一种或多种生物标志物的方法。

图2B展示了根据本公开的一个实施例的用可检测部分来标记一种或多种形态学标志物和/或一种或多种生物标志物的方法。

图2C展示了根据本公开的一个实施例的用可检测部分来标记一种或多种形态学标志物和/或一种或多种生物标志物的方法。

图2D展示了根据本公开的一个实施例的用可检测部分来标记一种或多种形态学标志物和/或一种或多种生物标志物的方法。

图3展示了根据本公开的一个实施例的检测与生物学样品中的一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物相对应的信号的方法，其中该方法利用可检测缀合物，该可检测缀合物包含：(i)可检测部分，以及(ii)酪酰胺部分、酪酰胺部分的衍生物、醌甲基化物前体部分或醌甲基化物前体部分的衍生物。

图4示出根据本公开的一个实施例的包含醌甲基化物前体部分的缀合物的沉积。

图5示出根据本公开的一个实施例的包含酪酰胺部分的缀合物的沉积。

图6展示了根据本公开的一个实施例的检测与生物学样品中的一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物相对应的信号的方法。

图7展示了根据本公开的一个实施例的检测与生物学样品中的一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物相对应的信号的方法，其中该方法利用可检测缀合物，该可检测缀合物包含：(i)可检测部分和(ii)能够参与点击化学反应的反应性官能团。

图8示出根据本公开的一个实施例的包含醌甲基化物前体部分的缀合物的沉积。

图9示出根据本公开的一个实施例的包含酪酰胺部分的缀合物的沉积。

图10提供了数种常规色原和常规化学染料苏木精(全部具有宽光谱吸收)的图。

图11提供了常规染料苏木精的宽光谱吸收与根据本公开的具有相对较窄光谱吸收的数种不同可检测部分的比较。

图12展示了福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)扁桃体组织样本的明场显微镜图像，该样本使用Cy7共价沉积发色团(CDC)以苏木精和抗ds DNA IHC两者来染色。在图的左侧使用来自770nm发光二极管(LED)的照明以单色CMOS相机以及在图的右侧使用来自卤钨灯的白光照明以彩色(RGB)CMOS相机以20X放大率记录图像。在770nm处，Cy7吸收强烈，并且苏木精具有可忽略的吸光度，因此左侧的图像表示通过抗ds DNA IHC进行的染色。Cy7吸收少得多的可见光，而苏木精在可见范围内吸收较广，使得右侧的图像反映苏木精吸光度。对同一显微镜视场的这两个图像的对比表明，抗ds DNA IHC以与苏木精相同的方式提供对所有细胞的特异性细胞核染色，并且因此该抗ds DNA可以代替苏木精作为有效的细胞核复染剂。

图13展示了使用Cy7 CDC以苏木精和抗组蛋白IHC两者染色的FFPE扁桃体组织样本的明场显微镜图像。在图的左侧使用来自770nm LED的照明以单色CMOS相机以及在图的右侧使用来自卤钨灯的白光照明以彩色(RGB)CMOS相机以20X放大率记录图像。在770nm处，Cy7吸收强烈，并且苏木精具有可忽略的吸光度，因此左侧的图像表示通过抗组蛋白IHC进行的染色。Cy7吸收少得多的可见光，而苏木精在可见范围内吸收较广，使得右侧的图像反映苏木精吸光度。对同一显微镜视场的这两个图像的对比表明，抗组蛋白IHC以与苏木精相同的方式提供对所有细胞的特异性细胞核染色，并且因此该抗组蛋白可以代替苏木精作为有效的细胞核复染剂。

图14展示了如图12所示使用Cy7 CDC以苏木精和抗ds DNA IHC两者染色的同一FFPE扁桃体组织样本的明场显微镜图像。在图的左侧使用来自770nm LED的照明以及在图的右侧使用来自595nm LED的照明以单色CMOS相机以20X放大率记录图像。苏木精在595nm处吸收强烈，而Cy7具有最小的吸光度，使得右侧的图像反映苏木精吸光度并且右侧的图像反映用Cy7 CDC进行的抗ds DNA IHC染色，如图12中。以单色呈现苏木精染色和抗ds DNAIHC染色两者提供对整个显微镜视场中的染色强度的更好的比较。针对抗体和HTX的染色模式看起来相似，如图12中，但针对抗ds IHC的抗体染色似乎提供了整个视场中更均匀的细胞核染色水平。由于复染目的通常是在不考虑细胞类型的情况下识别所有细胞核，因此均匀染色是期望性质，从而与常规苏木精复染相比，提供了基于IHC的复染的意想不到的优点。

图15展示了如图13所示使用Cy7 CDC以苏木精和抗组蛋白IHC两者染色的同一FFPE扁桃体组织样本的明场显微镜图像。在图的左侧使用来自770nm LED的照明以及在图的右侧使用来自595nm LED的照明以单色CMOS相机以20X放大率记录图像。苏木精在595nm处吸收强烈，而Cy7具有最小的吸光度，使得右侧的图像反映苏木精吸光度并且右侧的图像反映用Cy7 CDC进行的抗组蛋白IHC染色，如图13中。以单色呈现苏木精染色和组蛋白DNAIHC染色两者提供对整个显微镜视场中的染色强度的更好的比较。针对抗体和苏木精的染色模式看起来相似，如图13中，但针对组蛋白IHC的抗体染色似乎提供了整个视场中更均匀的细胞核染色水平。由于复染目的通常是在不考虑细胞类型的情况下识别所有细胞核，因此均匀染色是期望性质，从而与常规苏木精复染相比，提供了基于IHC的复染的意想不到的优点。

图16示出了使用常规苏木精染色的染色和根据本公开的复染的均匀性的比较。

图17提供了苏木精的宽光谱吸收与具有相对较窄光谱吸收的数种不同可检测部分的比较。

图18展示了在对FFPE扁桃体用抗ds DNA进行IHC时使用的Rhod614(左幅)和Rhod634(右幅)CDC的彩色图像。与图12和图13(右幅)中的彩色图像的比较表明苏木精与这两种CDC之间的色彩相似性，并证明这两种CDC中的任一种均可以提供类似着色的苏木精复染代替物。类似于苏木精的着色为显微镜操作者提供了熟悉的观看体验，但不是必需的。然而，两种CDC均确实提供了比苏木精更窄的吸收带，如图16所示，这减少光谱重叠，从而改善多重IHC图像的视觉色彩区分和光谱解混。

图19展示了在对FFPE扁桃体用抗组蛋白进行IHC时使用的Rhod614(左幅)和Rhod634(右幅)CDC的彩色图像。与图12和图13(右幅)中的彩色图像的比较表明苏木精与这两种CDC之间的色彩相似性，并证明这两种CDC中的任一种均可以提供类似着色的苏木精复染代替物。类似于苏木精的着色为显微镜操作者提供了熟悉的观看体验，但不是必需的。然而，两种CDC均确实提供了比苏木精更窄的吸收带，如图16所示，这减少光谱重叠，从而改善多重IHC图像的视觉色彩区分和光谱解混。

图20提供了根据本公开的数个可检测部分的光谱吸光度的比较。

图21示出了比较根据本公开的数个可检测部分的光谱吸光度的图。

图22示出了在单色相机(双相机系统)上记录的4个图像，其中选择照明通道以分别在dabsyl、TAMRA、Rhod634和Cy5.5的吸光度最大值附近对准。第五个图像为使用白光照明在彩色相机(双相机系统)上记录的相同显微镜视场。

图23示出了以常规苏木精复染剂代替抗ds DNA复染剂染色的组织切片的一组图像，其中使用438、549、620和689nm过滤的LED的透射光的图像从左到右分别呈现在前四个图像中。选择这些照明通道以分别在dabsyl、TAMRA、苏木精和Cy5.5的吸光度最大值附近对准。第五个图像为使用白光照明在彩色相机(双相机系统)上记录的相同显微镜视场。

图24示出了当选择苏木精染色时间(5s)以提供苏木精和根据本公开的Rhod634复染剂两者的如这两个切片的吸收光谱所示的相似复染吸光度时的结果。

图25从左到右示出了三个不同显微镜视场的图像，其中顶部图像在525nm LED照明(其中伊红吸收光)下记录，并且对应的下部图像在770nm LED照明(其中Cy7吸收光)下记录，反映了肌动蛋白的存在。

图26示出了对使用Cy7 CDC、TAMRA CDC和AMCA CDC在1/10典型发色团浓度下以抗ds DNA IHC染色的FFPE扁桃体组织记录的单色荧光图像。

图27示出了DAPI和AMCA的激发和发射光谱。

具体实施方式

本发明公开了可检测部分和包含一个或多个可检测部分的可检测缀合物。在一些实施方案中，所公开的可检测部分具有窄波长并且适用于多重分析。

定义

如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“该/所述”包括复数个指代物。同样，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。术语“包括”定义为包容性，如“包括A或B”是指包括A、B或A和B。

“包括”、“包含”、“具有”等术语可互换使用，且含义相同。类似地，“包括”、“包含”、“具有”等可互换使用并且具有相同的含义。具体而言，每个术语的定义都与普通美国专利法对“包括”的定义一致，因此每个术语都可理解为一个开放性术语，其含义为“至少以下”，并且也可理释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如“具有组件a、b和c的装置”是指所述装置至少包括组件a、b和c。同样，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”是指所述方法至少包括步骤a、b和c。此外，尽管本文可以特定的顺序概述步骤和过程，但是本领域技术人员将认识到，所述顺序步骤和过程可能会有所不同。

如本文所用，碱性磷酸酶(AP)是一种通过破坏磷酸酯-氧键并且暂时形成中间酶-底物键来去除(通过水解)并且转移磷酸酯基团有机酯的酶。例如，AP将萘酚磷酸酯(底物)水解为酚类化合物和磷酸酯。酚类与无色重氮盐(色原)偶联，以产生不溶性有色偶氮染料。在另一实施例中，AP水解

如本文所用，术语“抗体”，有时缩写为“Ab”，是指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括(例如)但不限于：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其组合；在任何脊椎动物(例如，在哺乳动物诸如人类、山羊、兔和小鼠等中)的免疫应答过程中产生的类似分子；以及特异性结合至目标分子(或一组高度相似的目标分子)并且基本上排除与其他分子的结合的抗体片段。“抗体”进一步是指至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其特异性识别并结合抗原的表位。抗体可由重链和轻链组成，每条重链和轻链均具有可变区，称为可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区。VH区和VL区共同负责结合由抗体识别的抗原。术语“抗体”还包括本领域中熟知的完整免疫球蛋白及其变体和部分。

如本文所用，术语“抗原”是指可以由特异性体液或细胞免疫的产物(诸如抗体分子或T细胞受体)特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如：半抗原、简单中间代谢物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子(诸如复合碳水化合物(例如多糖)、磷脂、核酸和蛋白质)。

如本文所用，术语“生物学样品”可为从包括但不限于单细胞生物体(诸如细菌、酵母、原生动物和变形虫等)、多细胞生物体(诸如植物或动物)的任何活生物体获得、由其排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括来自健康或表观健康人类受试者或受待诊断或研究的病状或疾病诸如癌症影响的人类患者的样品。例如，生物学样品可为从例如血液、血浆、血清、尿液、胆汁、腹水、唾液、脑脊液、房水或玻璃体获得的生物体液或任何身体分泌物、漏出液、渗出物(例如，从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的流体)或从关节(例如，正常关节或受疾病影响的关节)获得的流体。生物学样品也可为从任何器官或组织获得的样品(包括活检或尸检标本，诸如肿瘤活组织切片)，或者可包括细胞(无论是原代细胞还是培养细胞)或由任何细胞、组织或器官调节的培养基。在一些实例中，生物学样品为细胞核提取物。在某些实例中，样品为质量控制样品，诸如所公开的细胞沉淀切片样品中的一者。在其他实例中，样品为测试样品。样品可使用本领域普通技术人员已知的任何方法进行制备。样品可得自接受常规筛查的受试者，或得自疑似患有病症的受试者，诸如遗传异常、感染或瘤形成。本发明所公开的方法的所述实施例还可应用于无遗传异常、疾病、病症等的样品，这些样品称为“正常”样品。样品可包括可由一种或多种检测探针特异性结合的多个靶标。

如本文所用，术语“缀合物”是指共价连接至较大构建体的两个或更多个分子或部分(包括大分子或超分子)。在一些实施例中，缀合物包括共价连接至一个或多个其他分子部分的一种或多种生物分子(诸如肽、蛋白质、酶、糖、多糖、脂质、糖蛋白和脂蛋白)。

如本文所用，术语“偶联”是指一个分子或原子与另一分子或原子的结合、键合(例如共价键合)或连接。

如本文所用，术语“可检测部分”可产生可检测(诸如视觉、电子或其他方式)信号的分子或材料，该可检测信号指示在样品中的标记的存在(即，定性分析)和/或浓度(即，定量分析)。

如本文所用，辣根过氧化物酶(HRP)是一种可以缀合至带标记分子的酶。当与适当的底物一起孵育时，其产生标记的分子的有色、荧光或发光衍生物，使其能够得到检测和定量。HRP在电子供体存在下发挥作用，首先形成酶底物复合物，然后作用以氧化电子供体。例如，HRP可作用于3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)以产生可检测的颜色。HRP也可以作用于带标记的酪酰胺缀合物或酪酰胺样反应性缀合物(即，阿魏酸盐、香豆酸、咖啡酸、肉桂酸盐、多巴胺等)，以沉积有色或荧光或无色报告子部分，用于酪酰胺信号放大(TSA)。

如本文所用，术语“多重”、“多重化的”或“多重化”是指同时、基本上同时或顺序检测样品中的多个靶标。多重化可以包括单独地和以任何和所有组合来鉴定和/或定量多种不同的核酸(例如，DNA、RNA、mRNA、miRNA)和多肽(例如，蛋白质)。

如本文所用，“醌甲基化物”是醌类似物，其中对应醌上的羰基氧中的一者被亚甲基基团(–CH

如本文所用，术语“特异性结合实体”是指特异性结合对的成员。特异性结合对是特征在于彼此结合以实质性地排除与其他分子结合的分子对(例如，特异性结合对的结合常数可以比生物学样品中其他分子的结合对的两个成员中的任一者的结合常数大至少10-3M、10-4M或10-5M)。特异性结合部分的特定实例包括特异性结合蛋白(例如，抗体、凝集素、抗生物素蛋白(诸如链霉抗生物素蛋白)和蛋白A)。特异性结合部分也可以包括由这种特异性结合蛋白特异性结合的分子(或其部分)。

如本文所用，术语“靶标”是指确定或可以确定存在、位置和/或浓度的任何分子。靶分子的实例包括蛋白质、核酸序列和半抗原，例如与蛋白质共价结合的半抗原。通常，使用一个或多个特异性结合分子的缀合物和一个可检测的标记来检测靶分子。

如本文所用，符号

如本文所用，术语“带”、“吸收带”、“峰”、“吸收峰”、“吸收峰值”和“第一吸收带”可以互换使用，并且全部指所公开的发色团的最低能量吸收带。本文中对峰吸收波长和FWHM的所有引用均是指该第一或最低能量吸收带的半最大吸光度处的光谱宽度

概述

本公开涉及用一种或多种可检测部分(诸如一种或多种不同可检测部分)来标记生物学样品内的一种或多种靶标。在一些实施例中，一种或多种靶标为一种或多种形态学标志物和/或一种或多种生物标志物(各自在本文中进行描述)。在一些实施例中，一种或多种靶标包括两种或更多种形态学标志物，例如，三种或更多种形态学标志物、五种或更多种形态学标志物、七种或更多种形态学标志物等。在一些实施例中，一种或多种靶标包括两种或更多种形态学标志物和/或一种或多种生物标志物，例如，两种或更多种生物标志物、三种或更多种生物标志物等。在一些实施例中，一种或多种靶标包括一种或多种形态学标志物和/或两种或更多种生物标志物，例如，三种或生物标志物、四种或更多种生物标志物等。

在一些实施例中，对生物学样品中的一种或多种形态学标志物的标记被认为向生物学样品中一种或多种生物标志物的检测和可视化提供环境。在一些实施例中，对一种或多种形态学标志物的标记向一种或多种生物标志物提供位置环境。在一些实施例中，对一种或多种形态学标志物的标记允许细胞和/或组织形态与一种或多种生物标志物同时检测和/或可视化。在一些实施例中，对一种或多种形态学标志物的标记用作针对特殊染色剂(例如将对细胞中的特定形态学结构或对象进行染色的特殊染色剂)的替代物。在其他实施例中，对一种或多种形态学标志物的标记用作针对特殊染色剂(例如粘蛋白胭脂红)或复染剂(例如苏木精)(见下文)的代替物。

在一些实施例中，本文描述的方法有利于使用明场显微镜对一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物的检测。在一些实施例中，本文描述的方法有利于使用一种或多种可检测缀合物对一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物的检测。在一些实施例中，可检测缀合物包含(i)可检测部分，以及(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分、酪酰胺部分的衍生物或类似物或者醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物。在其他实施例中，可检测缀合物包含(i)可检测部分，以及(ii)能够参与点击化学反应的反应性官能团。本文描述了合适的可检测缀合物及其使用方法。

在一些实施例中，与每种可检测缀合物偶联的可检测部分具有预定的半峰全宽和预定的吸光度最大值(本文描述的)。在一些实施例中，本文描述的方法利用两个或更多个可检测部分，其吸光度最大值诸如相差至少10nm、相差至少15nm、相差至少20nm、相差至少30nm、相差至少40nm、相差至少50m、相差至少60nm、相差至少70nm、相差至少80nm、相差至少90nm、相差至少100nm、相差至少120nm、相差至少140nm、相差至少160nm、相差至少180nm、相差至少200nm等。这样，一种或多种经标记的形态学标志物和一种或多种经标记的生物标志物彼此可区分，并且没有实质性光谱重叠。

在一些实施例中，本公开实现在不使用复染剂(诸如苏木精)的情况下对生物学样品中的一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物的标记。如此，在一些实施例中，经染色的生物学样品基本上不含苏木精。提供样本细胞和组织形态的测度的常规明场细胞核复染剂(苏木精)具有宽光谱吸收，据信该宽光谱吸收对于与免疫组织化学或者原位杂交的多重存在问题(参见图10)。宽吸收与光谱上相邻的色原具有相当的重叠，使得难以清楚地区分各种经染色的生物标志物(参见图10和11)。虽然苏木精作为有效的复染剂，但其宽光谱使经标记的生物标志物的视觉评估复杂化，尤其是在评估两种或更多种经标记的生物标志物时。

某些可检测部分(诸如本文描述的那些)具有相对窄的吸收带，并且因此有利于更高阶明场多重。例如，五个可检测部分(Dabysl、R10、TAMRA、SR101和Cy5)的吸收光谱绘制在图11中。苏木精吸收光谱也包括在图11中，其用于强调苏木精吸收的广泛性质，以及随之而来的苏木精与上述五个可检测部分之间的光谱重叠的问题(将苏木精与图11中的R110、TAMRA、SR101和Cy5进行比较)。这些可检测部分之间的减少的光谱重叠(参见本文中关于半峰全宽和吸光度最大值的讨论)提供了用此类可检测部分标记的生物标志物的改进的视觉区分。然而，仍然需要复染来向经标记的生物标志物提供环境。

在IHC和ISH中，苏木精染色通常减少到不干扰生物标志物染色的可视化或定量的程度。对于多重测定，苏木精通常减少到细胞核染色几乎不可见的程度，从而对识别/定量一种或多种经标记的生物标志物的能力与辨别细胞核染色(以及由此的环境信息，诸如细胞和/或组织形态)的能力进行“权衡”。尽管苏木精染色水平降低，但苏木精与色原或可检测部分之间仍然存在一定程度的光谱串扰。

在本公开的一些实施例中，使用任何本文描述的可检测部分来标记形态学标志物(本文描述的)，从而避免对复染剂(诸如苏木精)的需求。因此，可以在最小的光谱串扰的情况下对一种或多种经标记的形态学标志物和一种或多种经标记的生物标志物进行检测、可视化和/或定量。

用于标记的靶标

当前公开的方法能够标记生物学样品内的一种或多种靶标，包括如本文所描述的“形态学标志物”和“生物标志物”。

形态学标志物

在一些实施例中，一种或多种靶标为蛋白质标志物、核酸标志物或细胞成分，它们允许对生物学样品内不同类型的细胞(或细胞成分)上或内和/或不同类型的组织上或内的不同形态学特征(下文称为“形态学标志物”)的识别。例如，形态学特征可以为细胞核，并且不同的形态学标志物(诸如DNA、组蛋白等)可以用来促进或表征对细胞核的识别，例如可视化。在一些实施例中，对具有相同形态学特征(例如细胞核)的特性的两种或更多种形态标志物进行染色或与可检测部分接触。

形态学标志物(其可以用于识别各种形态学特征)的非限制性示例包括DNA、组蛋白、针对胞质溶胶的标志物、针对内质网的标志物；细胞核膜标志物、核仁或其亚结构的标志物；针对细胞核及其亚结构的标志物；肌动蛋白丝、黏着斑或其亚结构的标志物；针对中心体和中心粒卫星的标志物；针对中间丝或其亚结构的标志物；针对微管结构或亚结构的标志物；针对线粒体的标志物；用于跨不同细胞系定位内质网蛋白的标志物；针对高尔基体的标志物；用于跨不同细胞系定位高尔基体相关蛋白质的标志物；针对质膜的标志物；用于跨不同细胞系对质膜蛋白进行高表达单一定位的标志物；以及针对囊泡细胞器的标志物。

形态学标志物的具体非限制性示例在下面进行描述。除了本文枚举的形态学标志物之外，可以参考人类蛋白质图谱(https://www.proteinatlas.org/)来选择与那些形态学标志物特别结合的附加形态学标志物和抗体。用于制备用于共价检测方案诸如酪酰胺、醌甲基化物或点击检测中的任一者中的抗体的方法是众所周知的。此外，可从AtlasAntibodies获得的抗体通常可从Sigma-Aldrich获得。

DNA

组蛋白

胞质溶胶标志物

表1–胞质溶胶标志物

举例来说，可以标记两种或更多种胞质溶胶标志物(诸如用本文公开的任何可检测部分)以表征胞质溶胶。在一些实施例中，对两种或更多种胞质溶胶标志物的标记可以与对一种或多种生物标志物的标记组合，以便表征胞质溶胶形态学特征和/或一种或多种生物标志物。

针对内质网的标志物

表2–内质网标志物

举例来说，可以标记两种或更多种内质网标志物(诸如用本文公开的任何可检测部分)以表征内质网。在一些实施例中，对两种或更多种内质网标志物的标记可以与对一种或多种生物标志物的标记组合，以便表征内质网形态学特征和/或一种或多种生物标志物。

细胞核膜标志物

表3–细胞核膜标志物

举例来说，可以标记两种或更多种细胞核膜标志物(诸如用本文公开的任何可检测部分)以表征细胞核膜。在一些实施例中，对两种或更多种细胞核膜标志物的标记可以与对一种或多种生物标志物的标记组合，以便表征细胞核膜形态学特征和/或一种或多种生物标志物。

核仁或其亚结构的标志物

表4–核仁标志物

举例来说，可以标记两种或更多种核仁标志物(诸如用本文公开的任何可检测部分)以表征核仁或其亚结构。在一些实施例中，对两种或更多种核仁标志物的标记可以与对一种或多种生物标志物的标记组合，以便表征核仁形态学特征和/或一种或多种生物标志物。

针对细胞核及其亚结构的标志物

表5–细胞核标志物

举例来说，可以标记两种或更多种细胞核标志物(诸如用本文公开的任何可检测部分)以表征细胞核。在一些实施例中，对两种或更多种细胞核标志物的标记可以与对一种或多种生物标志物的标记组合，以便表征细胞核形态学特征和/或一种或多种生物标志物。

肌动蛋白丝、黏着斑或其亚结构的标志物

表6-肌动蛋白丝标志物

举例来说，可以标记肌动蛋白丝、黏着斑或其亚结构的两种或更多种标志物(诸如用本文公开的任何可检测部分)以表征肌动蛋白丝、黏着斑或其亚结构。在一些实施例中，对两种或更多种标志物肌动蛋白丝、黏着斑或其亚结构可以与对一种或多种生物标志物的标记组合，以便将肌动蛋白丝或黏着斑表征为形态学特征和/或一种或多种生物标志物。

针对中心体和中心粒卫星的标志物

表7–中心体标志物

针对中间丝或其亚结构的标志物

表8–中间丝标志物

举例来说，可以标记两种或更多种中间丝标志物(诸如用本文公开的任何可检测部分)以表征中间丝。在一些实施例中，对两种或更多种中间丝标志物的标记可以与对一种或多种生物标志物的标记组合，以便表征中间丝形态学特征和/或一种或多种生物标志物。

针对微管结构或亚结构的标志物

表9–微管标志物

举例来说，可以标记两种或更多种针对微管的标志物(诸如用本文公开的任何可检测部分)以表征微管结构或亚结构。在一些实施例中，对两种或更多种针对微管的标志物的标记可以与对一种或多种生物标志物的标记组合，以便表征微管结构或亚结构形态学特征和/或一种或多种生物标志物。

针对线粒体的标志物

表10–线粒体标志物

举例来说，可以标记两种或更多种线粒体标志物(诸如用本文公开的任何可检测部分)以表征线粒体。在一些实施例中，对两种或更多种线粒体标志物的标记可以与对一种或多种生物标志物的标记组合，以便将线粒体表征为形态学特征和/或一种或多种生物标志物。

用于跨不同细胞系定位内质网蛋白的标志物

针对高尔基体的标志物

用于跨不同细胞系定位高尔基体相关蛋白的标志物

针对质膜的标志物

用于跨不同细胞系对质膜蛋白进行高表达单一定位的标志物

针对囊泡细胞器的标志物

在一些实施例中，一种或多种形态学标志物为组蛋白(例如用抗组蛋白抗体靶向)。在一些实施例中，一种或多种形态学标志物为DNA(例如用抗DNA抗体靶向)。在一些实施例中，形态学标志物为组蛋白和DNA两者。

在一些实施例中，一种或多种形态学标志物为细胞膜标志物。细胞膜标志物的示例为：钠钾ATP酶(其负责钠离子的细胞外转运和钾离子的细胞内转运；并且该酶可以用抗钠钾ATP酶抗体来靶向)；质膜钙ATP酶(质膜钙ATP酶(PMCA)通过从细胞去除Ca2+来调节细胞内钙浓度，并且该酶可以用抗钙泵泛ATP酶抗体来靶向)；钙粘蛋白(介导钙依赖性细胞间粘附的跨膜蛋白。钙粘蛋白的Ca2+结合结构域受高度保守，实现跨钙粘蛋白超家族的所有成员均有效的抗体的形成，并且该钙粘蛋白可以用抗泛钙粘蛋白抗体来靶向)；CD98(脊椎动物中发现的跨膜糖蛋白；它形成异二聚体中性氨基酸转运系统的一部分；它可以用抗CD98抗体来靶向)；小窝(复杂质膜结构，其性质似乎使其置于包被凹陷与脂筏之间，并且该小窝可以通过抗小窝蛋白1抗体来靶向)。

在一些实施例中，一种或多种形态学标志物为细胞质标志物。细胞质标志物的示例包括：微管(由13条α微管蛋白和β微管蛋白异二聚体的原丝(其在间期和有丝分裂期间不断生长和收缩)组成的高度动态聚合物，并且该微管可以通过抗α微管蛋白抗体来靶向)；波形蛋白(在各种非上皮细胞，尤其是间充质细胞中发现的III类中间丝。波形蛋白侧向地或者末端地附着到细胞核、内质网和线粒体，并且该波形蛋白可以通过抗波形蛋白抗体来靶向)；结蛋白(肌肉细胞中发现的III类中间丝。在成人横纹肌中，该III类中间丝形成纤维网络，将肌原纤维彼此连接并从Z线结构的外围与质膜连接，并且该结蛋白可以通过抗结蛋白抗体来靶向)；细胞角蛋白(存在于所有上皮细胞中以及也在数种非上皮细胞中的中间丝。这些可以经由与整合素β-1(ITB1)和活化蛋白激酶C的受体结合来调节激酶诸如PKC和SRC的活性，并且该细胞角蛋白可以通过抗细胞角蛋白19抗体来靶向)。

在一些实施例中，一种或多种形态学标志物为细胞核标志物。细胞核标志物的示例包括细胞核(抗KDM1/LSD1抗体)；核孔(抗NUP98抗体)；核被膜(抗核纤层蛋白A+C抗体)；核斑点(抗SC35抗体)；核仁(抗核仁纤维蛋白抗体)；异染色质(抗HP1α抗体)；以及着丝粒(抗CENPA抗体)。

在一些实施例中，一种或多种形态学标志物为细胞器标志物。细胞器标志物的示例包括：内质网(抗钙网蛋白抗体)；高尔基体(抗GM130抗体)；线粒体(抗ATP5A抗体)；核糖体(抗RPS3抗体)；溶酶体(抗M6PR抗体)；核内体(抗EEA1抗体)；过氧化物酶体(抗过氧化氢酶抗体)；以及自噬体(抗SQSTM1/p 62抗体)。

生物标志物

在一些实施例中，生物学样品内的一种或多种靶标为生物标志物。如本文所用的术语“生物标志物”是指一种可在生物学样品中检测到的指示物，例如预测性的、诊断性的和/或预后性的，例如PD-L1。生物标志物可以用作以某些分子特征、病理特征、组织学特征和/或临床特征为特征的疾病或病症(例如，癌症)的特定亚型的指示物。在一些实施例中，生物标记物为基因。生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如DNA和/或RNA)、多核苷酸拷贝数改变(例如，DNA拷贝数)、多肽、多肽和多核苷酸修饰(例如，翻译后修饰)、碳水化合物和/或基于糖脂的分子标志物。作为说明性实施例包括的是抗原、表位、细胞蛋白质、跨膜蛋白质和DNA或RNA序列。Her-2/neu基因和蛋白质均为生物标志物的说明性实施例。

如上所述，生物标志物靶标可以是核酸序列或蛋白质。在整个本公开中，当提及靶生物标志物蛋白质时，应当理解，与该蛋白质相关联的核酸序列也可以用作靶标。在一些实施例中，生物标志物靶标为来自病原体(诸如病毒、细菌)或细胞内寄生物(诸如来自病毒基因组)的蛋白质或核酸分子。例如，生物标志物靶蛋白可以由与疾病相关联(例如，关联、存在因果关系等)的靶核酸序列产生。

生物标志物靶核酸序列的大小可以存在实质性差异。不受限制地，核酸序列可具有可变数量的核酸残基。例如，生物标志物靶核酸序列可以具有至少约10个核酸残基或至少约20、30、50、100、150、500、1000个残基。类似地，生物标志物靶多肽的大小可以存在实质性差异。不受限制地，生物标志物靶多肽将包括至少一个与肽特异性抗体或其片段结合的表位。在一些实施例中，该多肽可包括至少两个与肽特异性抗体或其片段结合的表位。

在具体的非限制性实施例中，生物标志物靶标蛋白由与肿瘤(例如，癌症)相关联的靶标核酸序列(例如，基因组靶标核酸序列)产生。在肿瘤细胞中，尤其是在癌细胞(诸如B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、神经系统癌等)中，已经鉴定出许多染色体异常(包括易位及其他重排、扩增或缺失)。因此，在一些实施例中，生物标志物靶标分子的至少一部分由样品中的至少细胞亚群中扩增或缺失的核酸序列(例如，基因组靶标核酸序列)产生。

已知癌基因是导致若干人恶性肿瘤的原因。例如，涉及位于染色体18q11.2断点区的SYT基因的染色体重排常见于滑膜肉瘤软组织肿瘤中。可使用具有不同标记物的探针来鉴别t(18q11.2)易位：第一探针包括从SYT基因向远侧延伸的靶核酸序列所产生的FPC核酸分子，第二探针包括从延伸至SYT基因3'端或近侧的靶核酸序列所产生的FPC核酸。当与这些靶标核酸序列(例如，基因组靶标核酸序列)对应的探针用于原位杂交程序时，在SYT基因区缺乏t(18q11.2)的正常细胞表现出两个融合(由非常邻近的两个标记物产生)信号，反映SYT的两个完整拷贝。具有t(18q11.2)的异常细胞表现出单一融合信号。

在其他实施例中，选择的由核酸序列(例如，基因组靶标核酸序列)产生的生物标志物靶标蛋白为肿瘤细胞中缺失(丢失)的肿瘤抑制基因。例如，在某些膀胱癌中，位于染色体9p21上的p16区(包括D9S1749、D9S1747、p16(INK4A)、p14(ARF)、D9S1748、p15(INK4B)和D9S1752)缺失。涉及染色体1的短臂的远端区域(包括例如SHGC57243、TP73、EGFL3、ABL2、ANGPTL1和SHGC-1322)和19号染色体(包括MAN2B1、ZNF443、ZNF44、CRX、GLTSCR2和GLTSCR1)的着丝粒区域(例如19p13-19q13)的染色体缺失是某些类型的中枢神经系统实体瘤的特征性分子特征。

上述实施例仅出于举例说明的目的提供，并非旨在进行限制。与致瘤性转化和/或生长相关的许多其他细胞遗传学异常是本领域的普通技术人员所知的。由核酸序列(例如，基因组靶标核酸序列)产生的与致瘤性转化相关并且可用于本发明所公开的方法中的靶标蛋白还包括EGFR基因(7p12；例如，GENBANK

在其他实施例中，生物标志物靶蛋白选自与疾病或病症相关联的病毒或其他微生物。检测细胞或生物学样品中的病毒或微生物来源的靶标核酸序列(例如，基因组靶标核酸序列)，指示该生物体的存在。例如，生物标志物靶肽、多肽或蛋白质可以选自致癌或病源病毒、细菌或细胞内寄生虫(诸如恶性疟原虫和其他疟原虫种类、利什曼原虫种、细小隐孢子虫、溶组织内阿米巴和蓝氏贾第鞭毛虫以及弓形虫、艾美耳球虫、泰勒氏虫和巴贝虫种)。

在一些实施例中，生物标志物靶蛋白由来自病毒基因组的核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。示例性病毒和相应的基因组序列(括号中为GENBANK

在某些实施例中，生物标志物靶蛋白由致癌病毒(例如，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)或人乳头瘤病毒(HPV，例如，HPV16、HPV18)的核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。在其他实施例中，由核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生的靶蛋白来自病源病毒，诸如呼吸道合胞病毒、肝炎病毒(例如，丙型肝炎病毒)、冠状病毒(例如，SARS病毒)、腺病毒、多瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)或单纯疱疹病毒(HSV)。

可检测部分

目前公开的方法利用一个或多个可检测部分。在一些实施例中，可检测部分是可检测缀合物的组分。在一些实施例中，可以用于目前公开的方法的可检测缀合物包含可检测部分以及酪酰胺部分(或其衍生物或类似物)、醌甲基化物前体部分(或其衍生物或类似物)或能够参与“点击化学”反应的官能团(另外参见美国专利第10,041,950号和美国公开第2019/0204330、2017/0089911和2019/0187130号，其公开内容全文通过引用并入本文)中的一者。在其他实施例中，可以用于目前公开的方法的可检测缀合物包含可检测部分以及半抗原、酶或抗体中的一者。

在一些实施例中，合适的可检测部分可以根据在本文中称为FWHM(“半峰全宽”)的半最大吸光度处的其第一吸收峰的全宽来表征。FWHM由因变量等于其最大值的一半时的自变量的两个极值之差所给出的函数范围来表示。换句话说，它是在y轴上最大幅值的一半的那些点之间测量的光谱曲线的宽度。它由函数达到其最大值一半的曲线上的点之间的距离给出。本质上，FWHM是一个通常用于描述曲线上或函数“凹凸”宽度的参数。在一些实施例中，虽然吸光度最大值(λ

在一些实施例中，可检测部分具有窄FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有第一吸收峰，该第一吸收峰具有的半峰全宽(FWHM)小于传统染料或色原(例如，通常通过沉淀沉积的染料或色原)的FWHM。例如，传统色原(例如，DAB、Fast Red、Fast Blue或如SISH技术中所用的纳米颗粒银染剂)可具有约200nm或更大的FWHM；而本公开的可检测部分可具有小于约200nm(例如，小于约150nm、小于约130nm、小于约100nm、小于约80nm或小于约60nm)的FWHM。

在一些实施例中，可检测部分的FWHM比常规染料或色原(例如，苏木精、伊红或特殊染色剂)的FWHM低40％；比常规染料或色原的FWHM低50％；比常规染料或色原的FWHM低55％；比常规染料或色原的FWHM低65％；比常规染料或色原的FWHM低70％；比常规染料或色原的FWHM低75％；比常规染料或色原的FWHM低80％；比常规染料或色原的FWHM低85％；比常规染料或色原的FWHM低90％；或比常规染料或色原的FWHM低95％。

在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约200nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约190nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约180nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约170nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约150nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约140nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约120nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约110nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约90nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约70nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约60nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约50nm的第一吸收峰。

紫外光谱范围内的可检测部分

在一些实施例中，可检测部分具有在紫外光谱范围内的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约420nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约415nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约410nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约405nm的峰吸收波长。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约395nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约390nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约385nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约380nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约375nm的峰吸收波长。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约370nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有在约100nm至约400nm之间、约100nm至约390nm之间、约100nm至约380nm之间或约100nm至约370nm之间范围内的峰吸收波长。

在一些实施例中，可检测部分具有小于约420nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约415nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约410nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约405nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约395nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约390nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约385nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约380nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约375nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约370nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分具有小于约420nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约415nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约410nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约405nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约395nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约390nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约385nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约380nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约375nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约370nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分具有小于约420nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约415nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约410nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约405nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约395nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约390nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约385nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约380nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约375nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约370nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分具有小于约420nm的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约415nm的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约410nm的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约405nm的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约395nm的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约390nm的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约385nm的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约380nm的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有小于约375nm的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约370nm的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分包括或衍生自香豆素(即，可检测部分包括香豆素核)。美国专利第10,041,950号中描述了具有香豆素的合适的可检测部分的实例，该美国专利的公开内容全文通过引用并入本文。在一些实施例中，香豆素核为氨基香豆素核。在一些实施例中，香豆素核为7-氨基香豆素核。在一些实施例中，香豆素核为羟基香豆素核。在一些实施例中，香豆素核为7-羟基香豆素核。

在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)一个或多个吸电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)一个吸电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)两个吸电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)三个吸电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)三个不同的吸电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)四个吸电子基团。在一些实施例中，一个或多个吸电子基团各自具有在1.5至约3.5之间范围内的电负性。

在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)一个或多个供电子基团(其中各供电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)一个供电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)两个供电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)三个供电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)三个不同的供电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)四个供电子基团。在一些实施例中，一个或多个供电子基团各自具有在1.5至约3.5之间范围内的电负性。在一些实施例中，掺入一个或多个吸电子和/或供电子基团以促进向“红色”光谱或“蓝色”光谱的移动。

在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有在约300nm至约460nm范围内的波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有在约320nm至约440nm范围内的波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有在约340nm至约430nm范围内的波长。这些范围可能随更多或更少电负性被引入香豆素核而改变或移动。

在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约460nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约455+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约450nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约445nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约440nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约435nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约430nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约425nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约420nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约415nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约410nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约405nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约400nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约395nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约390nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约385nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约380nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约375nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约370nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约365nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约360nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约355nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约350nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约345nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约340nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约335nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约330nm+/-10nm的峰吸收波长。

在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约460nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约455+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约450nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约445nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约440nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约435nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约430nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约425nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约420nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约415nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约410nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约405nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约400nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约395nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约390nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约385nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约380nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约375nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约370nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约365nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约3160nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约355nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约350nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约345nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约340nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约335nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约330nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约460nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约455+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约450nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约445nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约440nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约435nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约430nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约425nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约420nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约415nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约410nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约405nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约400nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约395nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约390nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约385nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约380nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约375nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约370nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约365nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约3130nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约355nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约350nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约345nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约340nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约335nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约330nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约460nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约455+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约450nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约445nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约440nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约435nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约430nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约425nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约420nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约415nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约410nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约405nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约400nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约395nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约390nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约385nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约380nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约375nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约370nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约365nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约360nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约355nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约350nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约345nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约340nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约335nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约330nm+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。

具有香豆素核的可检测部分的实例包括：

其中符号

美国专利第10,041,950号中描述了具有香豆素核的其他合适的可检测部分，其公开内容全文通过引用并入本文，前提条件是那些基于香豆素的化合物具有FWHM小于约200nm的第一吸收峰。

本文公开了其他实例。

可见光谱范围内的可检测部分

在一些实施例中，可检测部分具有在可见光谱范围内的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有在约400nm至约760nm之间的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有在440nm至约720nm之间的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有在460nm至约680nm之间的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有在500nm至约640nm之间的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有在540nm至约600nm之间的峰吸收波长。

在一些实施例中，可检测部分具有在可见光谱范围内的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有介于约400nm与约760nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约440nm与约720nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约460nm与约680nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约500nm与约640nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约540nm与约600nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分具有介于约400nm与约760nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约440nm与约720nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约460nm与约680nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约500nm与约640nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分具有介于约400nm与约760nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约440nm与约720nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约460nm与约680nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约500nm与约640nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分具有介于约400nm与约760nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约440nm与约720nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约460nm与约680nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有介于约500nm与约640nm之间的峰吸收波长以及FWHM小于80nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分包括或衍生自吩噁嗪或吩噁嗪酮(即，可检测部分包括吩噁嗪或吩噁嗪酮核)。在一些实施例中，衍生自吩噁嗪或吩噁嗪酮的可检测部分为4-羟基-3-吩噁嗪酮或为7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮。

在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)一个或多个吸电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)一个吸电子基团。在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)两个吸电子基团。在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)三个吸电子基团。在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)三个不同的吸电子基团。在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)四个吸电子基团。

在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)一个或多个供电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)一个供电子基团。在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)两个供电子基团。在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)三个供电子基团。在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)三个不同的供电子基团。在一些实施例中，吩噁嗪或吩噁嗪酮核包含(或被修饰为包含)四个供电子基团。

在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有在约580nm至约700nm范围内的峰吸收波长。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有在约600nm至约680nm范围内的峰吸收波长。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有在约620nm至约660nm范围内的峰吸收波长。

在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约700+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约695+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约690+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约685+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约680+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约675+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约670+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约665+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约660+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约655+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约650+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约645+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约640+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约635+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约630+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约625+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约620+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约615+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约610+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约605+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约600+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约595+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约590+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约585+/-10nm。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有峰吸收波长约580+/-10nm。

在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约700+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约695+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约690+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约685+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约680+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约675+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约670+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约665+/-10nmm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约660+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约655+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约650+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约645+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约640+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约635+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约630+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约625+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约620+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约615+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约610+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约605+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约600+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约595+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约590+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约585+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约580+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约700+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约695+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约690+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约685+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约680+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约675+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约670+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约665+/-10nmm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约660+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约655+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约650+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约645+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约640+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约635+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约630+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约625+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约620+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约615+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约610+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约605+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约600+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约595+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约590+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约585+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约580+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约700+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约695+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约690+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约685+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约680+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约675+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约670+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约665+/-10nmm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约660+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约655+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约650+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约645+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约640+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约635+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约630+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约625+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约620+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约615+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约610+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约605+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约600+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约595+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约590+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约585+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有吩噁嗪或吩噁嗪酮核的可检测部分具有约580+/-10nm峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分包括或衍生自硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核(即，可检测部分包括硫堇鎓或吩噁噻-3-酮核)。

在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)一个或多个吸电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)一个吸电子基团。在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)两个吸电子基团。在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)三个吸电子基团。在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)三个不同的吸电子基团。在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)四个吸电子基团。

在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)一个或多个供电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)一个供电子基团。在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)两个供电子基团。在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)三个供电子基团。在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)三个不同的供电子基团。在一些实施例中，硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核包含(或被修饰为包含)四个供电子基团。

在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约580nm至约720nm范围内的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约600nm至约720nm范围内的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约630nm至约720nm范围内的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约645nm至约700nm范围内的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约665nm至约690nm范围内的峰吸收波长。

在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约580nm至约720nm范围内的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约600nm至约720nm范围内的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约630nm至约720nm范围内的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约645nm至约700nm范围内的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约665nm至约690nm范围内的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约580nm至约720nm范围内的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约600nm至约720nm范围内的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约630nm至约720nm范围内的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约645nm至约700nm范围内的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约665nm至约690nm范围内的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约580nm至约720nm范围内的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约600nm至约720nm范围内的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约630nm至约720nm范围内的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约645nm至约700nm范围内的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有在约665nm至约690nm范围内的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约720+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约715+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约710+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约705+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约700+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约695+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约690+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约685+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约680+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约675+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约670+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约665+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约660+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约655+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约650+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约645+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约640+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约635+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约630+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约625+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约620+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约615+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约610+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约605+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约600+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约595+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约590+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约585+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约580+/-10nm的峰吸收波长。

在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约720+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约715+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约710+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约705+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约700+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约695+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约690+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约685+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约680+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约675+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约670+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约665+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约660+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约655+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约650+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约645+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约640+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约635+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约630+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约625+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约620+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约615+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约610+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约605+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约600+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约595+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约590+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约585+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约580+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约720+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约715+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约710+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约705+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约700+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约695+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约690+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约685+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约680+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约675+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约670+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约665+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约660+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约655+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约650+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约645+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约640+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约635+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约630+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约625+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约620+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约615+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约610+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约605+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约600+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约595+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约590+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约585+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约580+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约720+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约715+/-10nm第峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约710+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约705+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约700+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约695+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约690+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约685+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约680+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约675+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约670+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约665+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约660+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约655+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约650+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约645+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约640+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约635+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约630+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约625+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约620+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约615+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约610+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约605+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约600+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约595+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约590+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约585+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有硫堇鎓、吩噁嗪或吩噁噻-3-酮核的可检测部分具有约580+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分包括或衍生自氧杂蒽核(即，可检测部分包括氧杂蒽核)。

在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)一个或多个吸电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)一个吸电子基团。在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)两个吸电子基团。在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)三个吸电子基团。在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)三个不同的吸电子基团。在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)四个吸电子基团。

在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)一个或多个供电子基团(其中各供电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)一个供电子基团。在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)两个供电子基团。在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)三个供电子基团。在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)三个不同的供电子基团。在一些实施例中，氧杂蒽核包含(或被修饰为包含)四个供电子基团。

在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约580nm至约650nm范围内的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约590nm至约640nm范围内的波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约600nm至约630nm范围内的波长。在一些实施例中，当应用包含含有氧杂蒽核的可检测部分的缀合物以分发时，上述吸光度可能偏移在约5nm至约10nm之间，到达红色光谱范围。

在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约580nm至约650nm范围内的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约590nm至约640nm范围内的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约600nm至约630nm范围内的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，当应用包含含有氧杂蒽核的可检测部分的缀合物以分发时，上述吸光度可能偏移在约5nm至约10nm之间，到达红色光谱范围。

在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约580nm至约650nm范围内的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约590nm至约640nm范围内的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约600nm至约630nm范围内的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，当应用包含含有氧杂蒽核的可检测部分的缀合物以分发时，上述吸光度可能偏移在约5nm至约10nm之间，到达红色光谱范围。

在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约580nm至约650nm范围内的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约590nm至约640nm范围内的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有在约600nm至约630nm范围内的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，当应用包含含有氧杂蒽核的可检测部分的缀合物以分发时，上述吸光度可能偏移在约5nm至约10nm之间，到达红色光谱范围。

在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约650+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约645+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约640+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约635+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约630+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约625+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约620+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约615+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约610+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约605+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约600+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约595+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约590+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约585+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约580+/-10nm的峰吸收波长。

在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约650+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约645+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约640+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约635+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约630+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约625+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约620+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约615+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约610+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约605+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约600+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约595+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约590+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约585+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约580+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约650+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约645+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约640+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约635+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约630+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约625+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约620+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约615+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约610+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约605+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约600+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约595+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约590+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约585+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约580+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约650+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约645+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约640+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约635+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约630+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约625+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约620+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约615+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约610+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约605+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约600+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约595+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约590+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约585+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有氧杂蒽核的可检测部分具有约580+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。

具有吩噁嗪酮、4-羟基-3-吩噁嗪酮、7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮、硫堇鎓、吩噁嗪、吩噁噻-3-酮核或氧杂蒽的化合物的非限制性示例在下面进行阐述：

其中符号

红外光谱范围内的可检测部分

在一些实施例中，可检测部分具有在红外光谱范围内的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约740nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约750nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约760nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约765nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约770nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约775nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约780nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约785nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约790nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有在约760nm至约1mm、约770nm至约1mm或约780nm至约1mm之间的波长。

在一些实施例中，可检测部分具有大于约740nm的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约750nm的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约760nm的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约765nm的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约770nm的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约775nm的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约780nm的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约785的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约790nm的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分具有大于约740nm的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约750nm的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约760nm的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约765nm的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约770nm的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约775nm的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约780nm的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约785nm的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约790nm的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分具有大于约740nm的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约750nm的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约760nm的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约765nm的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约770nm的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约775nm的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约780nm的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约785nm的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有大于约790nm的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分包括或衍生自七甲川菁核(即，可检测部分包括七甲川菁核)。

在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)一个或多个吸电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)一个吸电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)两个吸电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)三个吸电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)三个不同的吸电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)四个吸电子基团。

在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)一个或多个供电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)一个供电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)两个供电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)三个供电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)三个不同的供电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)供个供电子基团。

在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有在约780nm至约950nm范围内的波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有在约810nm至约920nm范围内的波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有在约840nm至约880nm范围内的波长。

在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有在约780nm至约950nm范围内的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约810nm至约920nm的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约840nm至约880nm的波长以及FWHM小于约160nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有在约780nm至约950nm范围内的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约810nm至约920nm的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约840nm至约880nm的波长以及FWHM小于约130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有在约780nm至约950nm范围内的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约810nm至约920nm的波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约840nm至约880nm的波长以及FWHM小于约100nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约950+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约945+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约940+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约935+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约930+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约925+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约920+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约915+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约910+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约905+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长。

在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约950+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约945+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约940+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约935+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约930+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约925+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约920+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约915+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约910+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约905+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约950+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约945+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约940+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约935+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约930+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约925+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约920+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约915+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约910+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约905+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约950+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约945+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约940+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约935+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约930+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约925+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约920+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约915+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约910+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约905+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，可检测部分包括或衍生自克酮酸盐核(即，可检测部分包括克酮酸盐核)。

在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)一个或多个吸电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)一个吸电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)两个吸电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)三个吸电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)三个不同的吸电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)四个吸电子基团。

在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)一个或多个供电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)一个供电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)两个供电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)三个供电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)三个不同的供电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)四个供电子基团。

在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约780nm至约900nm范围内的波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约800nm至约880nm范围内的波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约820nm至约860nm范围内的波长。

在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约780nm至约900nm范围内的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约800nm至约880nm范围内的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约820nm至约860nm范围内的波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约780nm至约900nm范围内的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约800nm至约880nm范围内的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约820nm至约860nm范围内的波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长。

在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于160nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于130nm的第一吸收峰。

在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及FWHM小于100nm的第一吸收峰。

包括七甲川菁核或克酮酸盐核的可检测部分的非限制性示例包括：

其中符号

适用于与目前公开的方法一起使用的其他可检测部分包含任何具有重氮核的那些，诸如美国专利第10,041,950号中公开的那些，该专利的公开内容全文通过引用并入本文。此类化合物的示例为柠檬黄：

其具有约472nm的峰吸收波长以及FWHM小于约70nm的第一吸收峰。

适用于与目前公开的方法一起使用的其他可检测部分包含任何具有三芳基甲烷核的那些，诸如美国专利第10,041,950号中公开的那些，该专利的公开内容全文通过引用并入本文。适用于与目前公开的方法一起使用的其他可检测部分包含四甲基罗丹明和二芳基罗丹明，诸如美国专利第10,041,950号中公开的那些，该专利的公开内容全文通过引用并入本文。

包括偶联至(ii)可检测部分的(i)酪酰胺或醌甲基化物前体部分的可检测缀合物的非限制性示例包括以下：

(波长最大值＝604)，

(波长最大值＝614)，

(波长最大值＝598)，

(波长最大值＝588)，

(波长最大值＝634)，

(波长最大值＝631)，

(波长最大值＝649)，

(波长最大值＝665)，

(波长最大值＝694)，并且

包括偶联至(ii)可检测部分的(i)能够参与点击化学反应的官能团的可检测缀合物的非限制性示例包括以下：

波长最大值＝410，

(波长最大值＝380至390)，

波长最大值＝804，

本领域技术人员将认识到，虽然每个示例性化合物均包括叠氮化物基团(即，N

表11：能够参与点击化学反应的反应性光能团。

在一些实施例中，可检测缀合物选自以下：

羟基香豆素

香豆素343

罗丹明110

罗丹明6G

四甲基罗丹明

方法

本公开还提供了检测生物学样品中的一种或多种形态学标志物和/或一种或多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记一种形态学标志物和两种或更多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记一种形态学标志物和三种或更多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记一种形态学标志物和四种或更多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记一种形态学标志物和五种或更多种生物标志物的方法。

在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记两种或更多种形态学标志物(诸如具有相同或不同形态学特征的特性的两种或更多种形态学标志物)和两种或更多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记两种或更多种形态学标志物(诸如具有相同或不同形态学特征的特性的两种或更多种形态学标志物)和三种或更多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记两种或更多种形态学标志物(诸如具有相同或不同形态学特征的特性的两种或更多种形态学标志物)和四种或更多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记两种或更多种形态学标志物(诸如具有相同或不同形态学特征的特性的两种或更多种形态学标志物)和五种或更多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记两种或更多种形态学标志物和七种或更多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记两种或更多种形态学标志物(诸如具有相同或不同形态学特征的特性的两种或更多种形态学标志物)和九种或更多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记两种或更多种形态学标志物和十种或更多种生物标志物的方法。

在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记两种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)和一种或多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记三种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)和一种或多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记四种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)和一种或多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记五种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)和一种或多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记六种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)和一种或多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记七种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)和一种或多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记八种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)和一种或多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记九种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)和一种或多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记十种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)和一种或多种生物标志物的方法。在一些实施例中，本公开提供了用不同的可检测部分来标记十一种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)和一种或多种生物标志物的方法。

在一些实施例中，本公开提供了标记两种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)的方法。在一些实施例中，本公开提供了标记三种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)的方法。在一些实施例中，本公开提供了标记四种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)的方法。在一些实施例中，本公开提供了标记五种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)的方法。在一些实施例中，本公开提供了标记六种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)的方法。在一些实施例中，本公开提供了标记七种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)的方法。在一些实施例中，本公开提供了标记八种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)的方法。在一些实施例中，本公开提供了标记九种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)的方法。在一些实施例中，本公开提供了标记十种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)的方法。在一些实施例中，本公开提供了标记十一种或更多种形态学标志物(诸如具有相同形态学特征的特性的那些)的方法。

参考图1，在一些实施例中，第一形态学标志物用第一可检测部分来标记(步骤101)。在一些实施例中，重复步骤101多次(步骤102)以用一个或多个可检测部分来标记一种或多种形态学标志物(其中一个或多个可检测部分可以各自相同或不同)。

接下来，第一生物标志物用第二可检测部分来标记(步骤103)，其中至少第一和第二可检测部分不同。在一些实施例中，重复步骤103多次(步骤104)以用一个或多个可检测部分来标记一种或多种生物标志物，其中一个或多个可检测部分中的每一个彼此不同，并且与用于标记一种或多种形态学标志物的那些可检测部分不同。在一些实施例中，也可以根据需要重复步骤101、102、103和104(步骤105)。随后，检测至少第一和第二可检测部分的信号(步骤106)。

在一些实施例中，先执行步骤103或104；并且随后执行步骤101和102。在其他实施例中，顺序执行步骤101和103，并且然后重复步骤101和103一次或多次。在又一些实施例中，同时执行步骤101和103。

在一些实施例中，选择第一和第二可检测部分，使得该第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，并且其不存在实质性重叠(例如，该不同的峰吸收波长相差至少20nm、相差至少30nm、相差至少40nm、相差至少50nm、相差至少60nm、相差至少70nm、相差至少80nm、相差至少90nm、相差至少100nm、相差至少110nm、相差至少120nm、相差至少130nm、相差至少140nm、相差至少150nm、相差至少170nm、相差至少190nm、相差至少210nm、相差至少230nm、相差至少250nm、相差至少270nm、相差至少290nm、相差至少310nm等。

在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同峰吸光度波长，其中第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少20nm，并且其中第一和第二可检测部分中的每一者具有小于200nm，例如小于160nm、小于130nm、小于100nm等的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同峰吸收波长，其中第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少30nm，并且其中第一和第二可检测部分中的每一者具有小于200nm，例如小于160nm、小于130nm、小于100nm等的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同峰吸光度波长，其中第一和第二可检测部分的不同峰值吸收波长间隔至少40nm，并且其中第一和第二可检测部分中的每一者具有小于200nm，例如小于160nm、小于130nm、小于100nm等的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同峰吸收波长，其中第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少50nm，并且其中第一和第二可检测部分中的每一者具有小于200nm，例如小于160nm、小于130nm、小于100nm等的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同峰吸收波长，其中第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少70nm，并且其中第一和第二可检测部分中的每一者具有小于200nm，例如小于160nm、小于130nm、小于100nm等的FWHM。

在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少20nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于160nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少30nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于160nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少40nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于160nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少50nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于160nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少70nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于160nm的FWHM。

在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少20nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于130nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少30nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于130nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少40nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于130nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少50nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于130nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少70nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于130nm的FWHM。

在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少20nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于100nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少30nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于100nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少40nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于100nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少50nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于100nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少70nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于100nm的FWHM。

在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少20nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于80nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少30nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于80nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少40nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于80nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少50nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于80nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少70nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于80nm的FWHM。

本文描述了两种检测生物学样品中的一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物的方法。第一种方法利用缀合至酪酰胺或醌甲基化物前体部分(直接缀合或通过一个或多个接头间接缀合)的可检测部分(包括本文所述的那些中的任意一者)。第二种方法利用缀合(直接缀合或通过一个或多个接头间接缀合)至能够参与点击化学反应的反应性官能团的可检测部分(包括本文所述的那些中的任意一者)。美国专利第10,041,950号以及美国专利公开第2019/0204330、2017/0089911和2019/0187130号中描述了使用酪酰胺化学、醌甲基化物化学和点击化学检测生物学样品中的靶标的方法和试剂，其公开内容据此通过引用全文并入本文。

在两种方法中，首先用酶来标记生物学样品中的一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物。换句话说，任一种方法中的第一步骤均为形成一种或多种形态学标志物-酶复合物和一种或多种生物标志物-酶复合物。在一些实施例中，一种或多种形态学标志物-酶复合物和一种或多种生物标志物-酶复合物用作本文所述的两种方法中的任一种方法中的进一步反应的中间体。用于标记一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物的合适的酶包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶或β-内酰胺酶。在一些实施例中，一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶来标记。在一些实施例中，一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物各自用相同的酶来标记。在其他实施例中，一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物用不同的酶来标记。

为了促进用一种或多种酶对生物学样品中的一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物的标记，在一些实施例中，将对一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物具有特异性的一种或多种特异性结合实体引入到生物学样品(顺序地或者同时地)。参考图2A、2B、2C和2D，在一些实施例中，对一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物具有特异性的一种或多种特异性结合实体为一种或多种一抗(步骤201、211、221和231)。一经引入一种或多种一抗，即可以引入缀合至标记物(直接地或通过接头间接地)的一种或多种二抗，其中每种二抗对一种或多种一抗具有特异性(例如，二抗为抗一抗抗体)(步骤202、212、222和232)。在一些实施例中，二抗的标记物为酶，包括上述那些中的任一种(参见图2C和2D的步骤222和232)。

在其他实施例中，二抗的标记物为半抗原(参见图2A和2B的步骤202或212)。半抗原的非限制性实例包括噁唑、吡唑、噻唑、苯并呋咱、三萜烯、脲、除罗丹明硫脲外的硫脲、除二硝基苯基或三硝基苯基外的硝基芳基、类鱼藤酮、环木脂体、杂联芳基、偶氮芳基、苯二氮

在一些实施例中，一种或多种特异性结合实体为一抗缀合物和/或核酸探针缀合物。在一些实施例中，一种或多种特异性结合实体为与酶偶联的一抗缀合物。在一些实施例中，一抗缀合物缀合至辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。在其他实施例中，一种或多种特异性结合实体为缀合至酶(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的核酸探针。缀合至酶的一种或多种特异性结合实体的引入促进一种或多种形态学标志物-酶复合物和一种或多种生物标志物-酶复合物的形成。

在一些实施例中，一种或多种特异性结合实体为偶联至半抗原的一抗缀合物和/或缀合至半抗原(包括美国专利第8,846,320号中所述的那些半抗原中的任一者，该美国专利的公开内容全文通过引用并入本文)的一种或多种核酸探针。在这些实施例中，缀合至半抗原的一种或多种特异性结合实体的引入促进一种或多种半抗原标记的形态学标志物和一种或多种半抗原标记的生物标志物的形成。在这些实施例中，将对一种或多种半抗原标记的形态学标志物和一种或多种半抗原标记的生物标志物的半抗原具有特异性的一种或多种抗半抗原抗体-酶缀合物引入到生物学样品，以便用酶来标记一种或多种半抗原标记的形态学标志物和一种或多种半抗原标记的生物标志物以提供一种或多种形态学标志物-酶复合物和一种或多种生物标志物-酶复合物。一抗缀合物、二抗和/或核酸探针可以根据本领域普通技术人员已知的程序引入样品中，以实现用酶并且如本文所示那样对生物学样品中的一种或多种靶标进行标记。

本文更详细地描述了上述方法中的每一种。在一些实施例中，两种方法均可用于用可检测标记物来标记一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物，即，可以利用混合化学来促进对生物学样品中的一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物的标记。

使用酪酰胺和/或醌甲基化物缀合物来检测生物学样品中的一种或多种形态学标

在一些实施例中，本公开提供了使用可检测缀合物来检测一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物的方法，该可检测缀合物包含：(i)酪酰胺和/或醌甲基化物前体部分，以及(ii)可检测部分，其包括本文所述的任何可检测部分。

在一些实施例中，并且参考图3，具有第一形态学标志物的生物学样品用第一酶来标记(步骤301)，以形成第一形态学标志物-酶复合物。用第一酶来标记第一形态学标志物的方法如上所述，并且还在图2A和2C中展示。在一些实施例中，第一形态学标志物选自由以下项组成的组：针对胞质溶胶的标志物、针对细胞核的标志物、细胞核膜标志物、针对细胞核的标志物、针对肌动蛋白丝的标志物、针对中心体的标志物、针对中心粒卫星的标志物、针对中间丝的标志物、针对微管结构的标志物、线粒体标志物、针对内质网的标志物、高尔基体标志物、质膜标志物和囊泡细胞器标志物。在一些实施例中，第一形态学标志物选自由DNA和组蛋白组成的组。

然后使生物学样品与第一可检测缀合物接触(步骤302)，该第一可检测缀合物包含第一可检测部分(包括本文所述的那些中的任意一种)和酪酰胺、醌甲基化物或它们的衍生物或类似物。本文描述了包含酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或它们的衍生物或类似物的可检测缀合物的示例。一发生第一形态学标志物-酶复合物的第一酶与第一可检测缀合物的酪酰胺醌甲基化物部分的相互作用，该可检测缀合物的至少第一可检测部分即沉积在第一形态学标志物靶标的近侧或在其上(另外参见图4和5，其展示了可检测部分在生物学样品内的靶标分子的近侧或在其上的沉积，其中靶标分子5或50可以为形态学标志物)。

可以针对生物学样品内的任何数量的形态学标志物重复上述过程(步骤301和302)(步骤303)。在一些实施例中，每种形态学标志物用不同的可检测部分来标记。在其他实施例中，每种形态学标志物用相同的可检测部分来标记。例如，如果形态学标志物为DNA和组蛋白，则在一些实施例中，可以期望用相同的可检测部分来标记DNA和组蛋白标志物两者，使得细胞的核成分用单个可检测部分来染色。

接下来，具有第一生物标志物的生物学样品用第二酶来标记(步骤304)以形成第一生物标志物-酶复合物。用第二酶来标记第一生物标志物的方法如上所述，并且也在图2B和2D中展示。然后使包含第一生物标志物-酶复合物的生物学样品与第二可检测缀合物接触(步骤305)，该第二可检测缀合物包含第二可检测部分(包括本文所述的那些中的任意一种)和酪酰胺、醌甲基化物或它们的衍生物或类似物。一发生第二生物标志物-酶复合物的第二酶与第二可检测缀合物的酪酰胺醌甲基化物部分的相互作用时，第二可检测缀合物的至少第二可检测部分沉积在第一生物标志物靶标的近侧或在其上(另外参见图4和5，其展示了可检测部分在生物学样品内的靶标分子的近侧或在其上的沉积，其中靶标分子5或50可以为生物标志物)。

用酶(步骤304)以及随后的可检测部分(步骤305)来标记生物标志物的步骤可以任何次数并针对生物学样品内的任何不同类型的生物标志物(例如，蛋白质、核酸)重复(步骤306)。在一些实施例中，每种生物标志物用不同的可检测部分来标记(并且其中针对每种生物标志物的每种标记物也不同于针对每种形态学标志物的每种标记物)。例如，Ki-67生物标志物可以用可检测部分来标记，该可检测部分具有FWHM小于200nm(例如小于160nm、小于130nm、小于100nm等)的第一吸收峰以及介于440nm与470nm之间的峰吸收波长；并且PD-L1生物标志物可以用可检测部分来标记，该可检测部分具有FWHM小于130nm(例如小于160nm、小于130nm、小于100nm等)的第一吸收峰以及介于590nm与620nm之间的峰吸收波长。进一步按照该示例，Ki-67生物标志物可以用可检测部分来标记，该可检测部分具有FWHM小于130nm(例如小于160nm、小于130nm、小于100nm等)的第一吸收峰以及介于440nm与470nm之间的峰吸收波长；PD-L1生物标志物可以用可检测部分来标记，该可检测部分具有FWHM小于130nm(例如小于160nm、小于130nm、小于100nm等)的第一吸收峰以及介于590nm与620nm之间的峰吸收波长；并且形态学标志物(例如DNA或组蛋白)可以用可检测部分来标记，该可检测部分具有FWHM小于130nm(例如小于160nm、小于130nm、小于100nm等)的第一吸收峰以及介于510nm与540nm之间的峰吸收波长。

最后，检测来自第一和第二可检测部分的信号(例如，诸如使用明场显微镜)(步骤307)。检测来自一个或多个可检测部分的一个或多个信号的方法描述于美国专利第10,778,913号中，其公开内容据此通过引用全文并入本文并且在本文只进一步描述。

在一些实施例中，选择第一和第二可检测缀合物的第一和第二可检测部分，使得该第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，并且其不存在实质性重叠(例如，不同的峰吸收波长相差至少约20nm、相差至少约25nm、相差至少约30nm、相差至少约40nm、相差至少约50nm、相差至少约60nm、相差至少约70nm、相差至少约80nm、相差至少约90nm、相差至少约100nm、相差至少约110nm、相差至少约120nm、相差至少约130nm、相差至少约140nm、相差至少约150nm、相差至少约170nm、相差至少约190nm、相差至少约210nm、相差至少约230nm、相差至少约250nm、相差至少约270nm、相差至少约290nm、相差至少约310nm等)。

在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少20nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于200nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少30nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于200nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少40nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于200nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少50nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于200nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少70nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于200nm的FWHM。

在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少20nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于130nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少30nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于130nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少40nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于60nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少50nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于130nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少70nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于130nm的FWHM。

在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少20nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于60nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少30nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于60nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少40nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于30nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少50nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于60nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少70nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于60nm的FWHM。

在一些实施例中，第一可检测部分包含吩噁嗪酮核、4-羟基-3-吩噁嗪酮核、7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮核、硫堇鎓核、吩噁嗪核、吩噁噻-3-酮核或氧杂蒽核。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内或红外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在可见光谱范围内。在一些实施例中，其中第一和第二可检测部分具有间隔至少20nm的吸光度最大值(λmax)。

作为图3所描述的工作流程的替代方案，在一些实施例中，用第一酶对第一形态学标志物的标记可以与用第二酶对第一生物标志物的标记同时地或顺序地发生。然后，可以将第一和第二可检测缀合物同时地或顺序地添加到生物学样品，以便分别用第一和第二可检测部分来标记第一形态学标志物和第一生物标志物，同样前提是第一和第二可检测部分具有如本文所指出的不同峰吸收波长。

图4和5进一步示出在引入生物学样品的各种组分之间发生的反应。参照图4，首先将特异性结合实体15引入具有靶标5的生物学样品中，以形成靶标-检测探针复合物。在一些实施例中，靶标5为形态学标志物，并且所形成的靶标-检测探针复合物为形态学标志物-检测探针复合物。在其他实施例中，靶标5为生物标志物，并且所形成的靶标-检测探针复合物为生物标志物-检测探针复合物。在一些实施例中，特异性结合实体15为一抗。随后，将标记缀合物25引入生物学样品中，该标记缀合物25包含至少一种与其缀合的酶。在所示实施例中，标记缀合物25为二抗，其中该二抗为缀合至酶的抗物种抗体。接下来，引入可检测缀合物10，诸如包括本文所述的直接或间接偶联至醌甲基化物前体部分或其衍生物或类似物的任何可检测部分的可检测缀合物。一发生酶(例如，AP或B-Gal)与可检测缀合物10的相互作用，该可检测缀合物10即经历结构、构象或电子改变20，以形成组织反应性中间体30。在该特定实施例中，可检测缀合物包含醌甲基化物前体部分，该醌甲基化物前体部分在与(标记缀合物25的)碱性磷酸酶相互作用时，导致氟离去基团放出，得到相应的醌甲基化物中间体30。然后醌甲基化物中间体30与组织近端或直接在组织上形成共价键，以形成可检测部分复合物40。然后，可以根据本领域普通技术人员已知的方法来检测来自可检测部分复合物40的信号，该方法诸如描述于美国专利第10,041,950和10,778,913号以及于美国公开号第2019/0204330、2017/0089911号的那些，该文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。图4的步骤可以针对靶标内的种或多种形态学标志物和/或一种或多种生物标志物重复。

参考图5，首先将特异性结合实体55引入具有靶标50的生物学样品中，以形成靶标-检测探针复合物，并且所形成的靶标-检测探针复合物为形态学标志物-检测探针复合物。在一些实施例中，靶标50为形态学标志物。在其他实施例中，靶标50为生物标志物，并且所形成的靶标-检测探针复合物为生物标志物-检测探针复合物。在一些实施例中，特异性结合实体55为一抗。随后，将标记缀合物60引入生物学样品中，该标记缀合物60包含至少一种与其缀合的酶。在所示实施例中，标记缀合物为二抗，其中该二抗为缀合至酶的抗物种抗体。接下来，引入可检测缀合物70，诸如包括本文所述的直接或间接偶联至酪酰胺部分或其衍生物或类似物的任何可检测部分的可检测缀合物。在酶与可检测缀合物70相互作用时，形成组织反应性中间体80。在该特定实施例中，可检测缀合物70包含酪酰胺部分，该酪酰胺部分在与辣根过氧化物酶相互作用时，引起自由基物种80的形成。然后自由基物质80与组织近端或直接在组织上形成共价键，以形成可检测部分复合物90。然后，来自可检测部分复合物90的信号可以根据本领域普通技术人员已知的方法进行检测，该方法诸如美国专利第10,041,950和10,778,913号以及美国公开第2019/0204330、2017/0089911和2019/0187130号中所述的那些，该文献的公开内容据此通过引用以其整体并入本文。图5的步骤可以针对靶标内的种或多种形态学标志物和/或一种或多种生物标志物重复。在一些实施例中，图4的步骤可以用于标记形态学标志物，而图5的步骤用于标记生物标志物。在其他实施例中，图5的步骤可以用于标记形态学标志物，而图4的步骤用于标记生物标志物。

在一些实施例中，将生物学样品用酶灭活组合物预处理，以基本上或完全灭活内源性过氧化物酶活性。例如，一些细胞或组织含有内源性过氧化物酶。使用HRP缀合的抗体可能导致高的、非特异性背景染色。该非特异性背景可通过用本文所公开的酶灭活组合物对样品进行预处理来减小。在一些实施例中，将样品仅用过氧化氢(约1重量％至约3重量％的适当的预处理溶液)进行预处理，以降低内源性过氧化物酶活性。一旦内源性过氧化物酶活性降低或失活，即可加入检测试剂盒，然后灭活检测试剂盒中存在的酶(如上所述)。所公开的酶失活组合物和方法也可用作灭活内源性酶过氧化物酶活性的方法。另外的灭活组合物描述于美国专利公开第2018/0120202号中，其公开内容据此通过引用全文并入本文。

在一些实施例中，如果样本是嵌入石蜡中的样品，则可使用一种或多种适当的去石蜡液对该样品进行脱蜡。在废物清除器去除去石蜡流体后，可连续地将任意数量的物质施加至样本上。这些物质可以用于预处理(例如蛋白质交联、暴露核酸等)、变性、杂交、洗涤(如严格洗涤)、检测(如将显示或标志物分子与探针连接)、扩增(如扩增蛋白质、基因等)、复染、盖玻片等。

使用一对点击缀合物检测样品中的靶标的方法

本公开提供了使用点击缀合物对来检测生物学样品内的一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物的方法。在这些测定中，点击缀合物对的一个成员包含可检测缀合物，该可检测缀合物包含：(i)能够参与点击化学反应的第一官能团，以及(ii)可检测部分，包括本文所述的任何可检测部分。合适的可检测缀合物的非限制性实例如本文所述。点击缀合物对(以下称为“组织反应性缀合物”)的另一成员包含缀合物，该缀合物包含：(i)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物类似物；以及(ii)能够与可检测缀合物的第一官能团反应的第二官能团。与可检测缀合物和组织反应性缀合物偶联并且能够彼此反应的合适的第一官能团和第二官能团在表12中列出：

表12：能够在“点击化学”反应中相互反应的第一官能团和第二官能团。

合适的组织反应性缀合物的非限制性实例如下所示：

酪酰胺-DBCO

酪酰胺-叠氮化物

酪氨酸叠氮化物

酪酰胺-TCO

酪酰胺-四嗪

其他合适的“组织反应性缀合物”描述于美国专利公开第2019/0204330、2017/0089911和2019/0187130号中，该美国专利的公开内容据此通过引用以其整体并入本文。

一般来说，作为用可检测部分来标记一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物的第一步骤，包括使用醌甲基化物信号放大(“QMSA”)和/或酪酰胺信号放大(“TSA”)将一种或多种组织反应性缀合物共价沉积到组织上(参见图6的步骤601)。一种或多种组织反应性缀合物的引入使反应性官能团对的第一成员引入到一种或多种形态学标志物和一种或多种生物标志物。这些放大程序描述于美国专利第2019/0204330、2017/0089911和2019/0187130号中，其公开内容各自据此通过引用全文并入本文。然后，将一种或多种可检测缀合物引入到组织(参见图6中的步骤602)。在两种“点击”缀合物(即，包含能够彼此反应的官能团组织反应性缀合物和可检测缀合物)之间迅速发生“点击”反应，将可检测部分共价结合至组织上如QMSA或TSA化学所指示的位置处。本文将更详细地描述这些步骤中的每一者。

在一些实施例中，并且参考图7，具有第一形态学标志物的生物学样品用第一酶来标记(步骤701)，以形成第一形态学标志物-酶复合物。用第一酶来标记第一形态学标志物的方法如上所述，并且还在图2A和2C中展示。在一些实施例中，第一形态学标志物选自由以下项组成的组：针对胞质溶胶的标志物、针对细胞核的标志物、细胞核膜标志物、针对细胞核的标志物、针对肌动蛋白丝的标志物、针对中心体的标志物、针对中心粒卫星的标志物、针对中间丝的标志物、针对微管结构的标志物、线粒体标志物、针对内质网的标志物、高尔基体标志物、质膜标志物和囊泡细胞器标志物。在一些实施例中，第一形态学标志物选自由DNA和组蛋白组成的组。

然后使生物学样品与第一组织反应性缀合物接触(步骤702)，该第一组织反应性缀合物包含酪酰胺、醌甲基化物或它们的衍生物或类似物和能够参与点击化学反应的第一官能团(包括本文表1和表2中所述的那些中的任一者)。组织反应性缀合物的非限制性实例如本文所提供。一发生第一形态学标志物-酶复合物的第一酶与第一组织反应性缀合物的酪酰胺或醌甲基化物部分的相互作用，至少第一固定化组织-点击缀合物复合物就沉积在第一形态学标志物靶标的近侧或在其上(另外参见图8和图9，其进一步示出可能发生的“点击化学”反应以及所得“第一固定化组织-点击缀合物复合物”和“第一固定化组织-点击加合物复合物”的形成)。在形成第一固定化组织-点击缀合物复合物后，然后使生物学样品与第一可检测缀合物接触，该第一可检测缀合物包含：(i)能够与第一固定化组织-点击缀合物复合物的第一反应性官能团反应的第二官能团，以及(ii)第一可检测部分(步骤703)。第一固定化组织-点击缀合物复合物与第一可检测缀合物的反应产物产生可检测的第一固定化组织-点击加合物复合物。

可以针对生物学样品内的任何数量的形态学标志物重复上述过程(步骤701、702和703)(步骤704)。在一些实施例中，每种形态学标志物用不同的可检测部分来标记。在其他实施例中，每种形态学标志物用相同的可检测部分来标记。例如，如果形态学标志物为DNA和组蛋白，则在一些实施例中，可以期望用相同的可检测部分来标记DNA和组蛋白标志物两者，使得细胞的核成分用单个可检测部分来染色。

接下来，具有第一生物标志物的生物学样品用第二酶来标记(步骤705)以形成第一生物标志物-酶复合物。用第二酶来标记第一生物标志物的方法如上所述，并且也在图2B和2D中展示。然后使生物学样品与第二组织反应性缀合物接触(步骤706)，该第二组织反应性缀合物包含酪酰胺、醌甲基化物或它们的衍生物或类似物和能够参与点击化学反应的第一官能团(包括本文表1和表2中所述的那些中的任一者)。组织反应性缀合物的非限制性实例如本文所提供。一发生第二生物标志物-酶复合物的第二酶与第二组织反应性缀合物的酪酰胺或醌甲基化物部分的相互作用，至少第二固定化组织-点击缀合物复合物就沉积在第一生物标志物靶标的近侧或在其上(另外参见图8和图9，其进一步示出可能发生的“点击化学”反应以及所得“第二固定化组织-点击缀合物复合物”和“第二固定化组织-点击加合物复合物”的形成)。在形成第二固定化组织-点击缀合物复合物后，然后使生物学样品与第二可检测缀合物接触，该第一可检测缀合物包含：(i)能够与第二固定化组织-点击缀合物复合物的第一反应性官能团反应的第二官能团，以及(ii)第二可检测部分(步骤707)。第二固定化组织-点击缀合物复合物与第二可检测缀合物的反应产物产生可检测的第二固定化组织-点击加合物复合物。

可以针对生物学样品内的任何数量的生物标志物重复上述过程(步骤705、706和707)(步骤708)。在一些实施例中，每种生物标志物用不同的可检测部分来标记(并且其中针对每种生物标志物的每种标记物也不同于针对每种形态学标志物的每种标记物)。例如，Ki-67生物标志物可以用可检测部分来标记，该可检测部分具有FWHM小于50nm的第一吸收峰以及介于440nm与470nm之间的峰吸收波长；并且PD-L1生物标志物可以用可检测部分来标记，该可检测部分具有FWHM小于50nm的第一吸收峰以及介于590nm与620nm之间的峰吸收波长。进一步按照该示例，Ki-67生物标志物可以用可检测部分来标记，该可检测部分具有FWHM小于50nm的第一吸收峰以及介于440nm与470nm之间的峰吸收波长；PD-L1生物标志物可以用可检测部分来标记，该可检测部分具有FWHM小于50nm的第一吸收峰以及介于590nm与620nm之间的峰吸收波长；并且形态学标志物(例如DNA或组蛋白)可以用可检测部分标记，该可检测部分具有FWHM小于50nm的第一吸收峰以及介于510nm与540nm之间的峰吸收波长。

最后，检测来自第一和第二可检测部分的信号(例如，诸如使用明场显微镜)(步骤709)。检测来自一个或多个可检测部分的一个或多个信号的方法描述于美国专利第10,778,913号中，其公开内容据此通过引用全文并入本文。

在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少20nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于60nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少30nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于60nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少40nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于60nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少50nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于60nm的FWHM。在一些实施例中，第一和第二可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该第一和第二可检测部分的不同峰吸收波长间隔至少70nm，并且其中第一和第二可检测部分中的任一者具有小于60nm的FWHM。

图8和图9进一步示出具有组织反应性部分的一对点击缀合物的第一成员(10，20)与靶标结合酶(11，21)之间的反应，以形成固定化组织-点击缀合物复合物(13，23)。该扩大方法的第一部分类似于QMSA和TSA扩大方法中所用的部分。图8和图9示出固定化组织-点击缀合物(13，23)复合物与一对点击缀合物的第二成员(14，24)之间的后续反应，该后续反应用于提供包含可检测报告部分的固定化组织-点击加合物复合物(15，25)。

参考图8，使包含反应性官能团的组织反应性缀合物(10)与靶标结合酶(11)接触，以产生反应性中间体(12)。在一些实施例中，靶标结合酶(11)为形态学标志物结合酶。在其他实施例中，靶标结合酶(11)为生物标志物结合酶。在该示例中，反应性中间体、醌甲基化物与生物学样品上或该生物学样品内的亲核试剂形成共价键，从而提供固定化组织点击-缀合物复合物(13)。然后，固定化组织-点击缀合物复合物可以与具有本文所述的任何可检测部分的可检测缀合物14反应，前提条件是该组织反应性缀合物10和可检测缀合物14具有可以彼此反应以形成共价键的反应性官能团。固定化组织-点击缀合物复合物13与点击缀合物14的反应产物产生固定化组织-点击加合物复合物15。组织-点击加合物15可借助由连接的可检测部分所发射的信号来检测。在一些实施例中，图8的步骤可以针对任何数量的形态学标志物和或生物标志物重复。

类似地并且参照图9，使包含反应性官能团的组织反应性缀合物20与靶标结合酶21接触，以产生反应性中间体22，即酪酰胺自由基物种(或其衍生物)。在一些实施例中，靶标结合酶(21)为形态学标志物结合酶。在其他实施例中，靶标结合酶(21)为生物标志物结合酶。然后，酪酰胺自由基中间体可以与生物学样品形成共价键，从而得到固定化组织-点击缀合物复合物23。然后，固定化组织-点击缀合物复合物可以与包含本文所述的任何可检测部分的可检测缀合物24反应，前提条件是组织反应性缀合物与可检测缀合物20和24分别具有可以彼此反应以形成共价键的反应性官能团。固定化组织-点击缀合物复合物23与点击缀合物24的反应产物产生组织-点击加合物复合物25。在一些实施例中，图9的步骤可以针对任何数量的形态学标志物和或生物标志物重复。在一些实施例中，图8的步骤可以用于标记形态学标志物，而图9的步骤用于标记生物标志物。在其他实施例中，图9的步骤可以用于标记形态学标志物，而图8的步骤用于标记生物标志物。

自动化

本公开的测定和方法可以是自动化的，并且可以与样本处理设备组合。样本处理设备可以是自动化设备，例如Ventana Medical Systems,Inc.销售的BENCHMARK XT仪器和DISCOVERY XT仪器。Ventana Medical Systems,Inc.是多项美国专利的代理人，这些专利公开了执行自动分析的系统和方法，包括美国专利第5,650,327号、第5,654,200号、第6,296,809号、第6,352,861号、第6,827,901号和第6,943,029号，以及美国已公布的专利申请第20030211630号和第20040052685号，其各自据此通过引用全文并入本文。替代地，还可以人工处理样本。

该样本处理设备可以将固定剂涂在样本上。固定剂可以包括交联剂(例如醛类，如甲醛、聚甲醛和戊二醛，以及非醛类交联剂)、氧化剂(如金属离子和络合物，例如四氧化二锇和铬酸)、蛋白质变性剂(如乙酸、甲醇和乙醇)、机理不明的固定剂(如氯化汞、丙酮和苦味酸)、组合试剂(如Carnoy固定剂、Methacarn、Bouin液、B5固定剂、Rossman液和Gendre液)、微波以及其他固定剂(如排除体积固定和蒸汽固定)。

如果样本为嵌入石蜡中的样品，可通过样本处理设备使用相应的去石蜡流体对样品进行去石蜡。在废物清除器去除去石蜡流体后，可连续地将任意数量的物质施加至样本上。这些物质可以用于预处理(例如蛋白质交联、暴露核酸等)、变性、杂交、洗涤(如严格洗涤)、检测(如将显示或标志物分子与探针连接)、扩增(如扩增蛋白质、基因等)、复染、盖玻片等。

样本处理设备可以将各种不同的物质应用到样本。这些化学物质包括但不限于染色剂、探针、试剂、漂洗剂和/或调节剂。这些化学物质可以是流体(如气体、液体或气体/液体混合物)或类似物质。所述流体可以是溶剂(如极性溶剂、非极性溶剂等)、溶液(如水溶液或其他类型的溶液)或类似物质。试剂可以包括但不限于染色剂、润湿剂、抗体(如单克隆抗体、多克隆抗体等)、抗原回收液(如水基或非水基抗原修复液、抗原回收缓冲液等)或类似物质。探针可为分离的核酸或分离的合成寡核苷酸，其连接至可检测标记。标记可以包括放射性同位素、酶底物、辅助因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。

标本处理完毕后，用户可以将标本载片运送到成像设备上。本文所用的成像设备为明视野成像器幻灯扫描仪。一个明场成像仪为由Ventana Medical Systems,Inc.出售的iScan Coreo

检测和/或成像

本发明所公开的实施例的某些方面或全部可实现自动化，并且由计算机分析和/或图像分析系统带来便利。在一些应用中，测量精确的颜色或荧光比率。在一些实施例中，利用光学显微镜进行图像分析。某些公开的实施例涉及采集数字图像。这可以通过将数码相机耦接至显微镜来完成。使用图像分析软件对获得的染色样品的数字图像进行分析。可以通过多种不同的方法来测量颜色或荧光。例如，颜色可以用红色、蓝色和绿色值以及色相、饱和度和强度值来衡量；和/或通过使用光谱成像相机测量特定的波长或波长范围。还可对样品进行定性和半定量评估。定性评估包括评估染色强度、鉴定阳性染色细胞和参与染色的细胞内结构以及评估总体样品或载玻片质量。对检测样品进行单独评估，并且该分析可包括与已知平均值的比较，以确定样品是否代表异常状态。

合适的检测方法描述于美国专利第10,778,913号中，其公开内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，合适的检测系统包括成像设备、一个或多个镜头以及与成像设备通信的显示器。成像设备包括用于顺序发射能量的装置和用于捕获图像/视频的装置。在一些实施例中，定位用于捕获的装置以捕获样本图像，这些图像各自对应于暴露于能量的样本。在一些实施例中，用于捕获的装置可包括一个或多个定位在带有生物学样品的显微镜载玻片的正面和/或背面的相机。在一些实施例中，显示装置包括显示器或屏幕。在一些实施例中，用于顺序发射能量的装置包括多个能量发射器。每个能量发射器可包括一个或多个IR能量发射器、UV能量发射器、LED光发射器、它们的组合或其他类型的能量发射装置。成像系统可进一步包括用于基于通过用于捕获的装置所捕获的样本图像来产生对比度增强的彩色图像数据的装置。显示装置显示基于对比度增强的彩色图像数据来显示样本。

方法和技术

免疫组织化学-单一和多重

一抗(抗ds DNA[DSD/958](ab215896)和抗组蛋白H3(ab1791))从ABCAM(Cambridge MA)获得。其他一抗IHC试剂从Ventana Medical Systems,Inc.(VSMI；Tucson,AZ)获得，包括抗CD20(目录号760-2531)、抗CD3(目录号790-4341)和抗CD8(目录号790-4460)。与可检测部分一起使用的酶抗体缀合物为OmniMap抗Ms HRP(RUO)、DISCOVERY(VMSI目录号760-4310)、OmniMap抗Rb HRP(RUO)、DISCOVERY(VMSI目录号760-4311)、UltraMap抗Ms Alk Phos、DISCOVERY(VMSI目录号760-4312)和UltraMap抗Rb Alk Phos、DISCOVERY(VMSI目录号760-4314)。使用上述一抗和检测试剂在DISCOVERY Ultra系统上执行全自动多重化检测。使用Discovery Universal Procedure通用程序创建用于单个生物标志物IHC和多重IHC的方案。通常，除非另有说明，否则IHC在37℃执行，并且反应缓冲液洗涤溶液从10x浓缩物(目录号950-300)稀释。通过将载玻片温热至70℃进行3次循环(各8min长)，对载玻片固定的石蜡切片进行脱蜡。通过应用细胞前处理清洗1(VMSI目录号950-124)并温热载玻片至94℃达64min来执行抗原修复。对每种生物标志物的染色在连续步骤中执行，包括：与靶向该生物标志物的一抗一起孵育16至32min，在反应缓冲液中洗涤以去除未结合抗体，与缀合至过氧化物酶或碱性磷酸酶(具体取决于发色团是酪酰胺还是醌甲基化物衍生物)靶向一抗(抗小鼠或抗兔抗体)的抗物种抗体一起孵育8min，用反应缓冲液洗涤，与酪酰胺修饰的DBCO或酪酰胺修饰的显色试剂或醌甲基化物前体修饰的显色试剂孵育，以及用反应缓冲液洗涤。对于酪酰胺，在添加酪酰胺后添加稀H2O2以引发沉积，并孵育32min。所有沉积步骤之后均在反应缓冲液中进行洗涤。如果使用酪酰胺修饰的DBCO，则将载玻片进一步与叠氮化物修饰的色原一起孵育32min，并洗涤。在多重IHC情况下，在依次对下一生物标志物进行染色之前，将载玻片与细胞前处理清洗2(VMSI目录号950-123)在100℃孵育8min，然后在反应缓冲液中洗涤。最后，载玻片可以在环境温度下通过乙醇系列(2x80％乙醇，每个1min；2x90％乙醇，每个1min；3x100％乙醇，每个1min；3x二甲苯，每个1min)进行手动脱水。一抗和酶-抗体缀合物按照制造商推荐的浓度、体积和孵育时间使用。在VMSIDiscoveryTSA稀释剂(目录号000060900)中，将酪酰胺修饰的可检测缀合物(诸如本文所述的那些)、酪酰胺-色原或酪酰胺-DBCO在25与1,200μM之间的浓度范围以100μL体积添加到载玻片中。将叠氮化物修饰的可检测缀合物以100μL的体积添加到TSA稀释剂中，通常浓度与用于酪酰胺-DBCO的浓度相同。可检测缀合物(包括本文所述的可检测部分)的溶液浓度反映了它们的峰吸收消光系数和生物标志物表达水平，并且对于7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰(AMCA)，通常为1,200μM，对于7-羟基香豆素-3-羧基(HCCA)通常为400μM，对于7-二乙基氨基香豆素-3-羧基(DCC)，通常为600至800μM，以及对于Cy7可检测部分，通常为50至300μM。在TSA稀释剂中,将醌甲基化物前体修饰的Cy5添加到在100μL 400μM Cy5可检测部分中的载玻片。当使用修饰的染料作为荧光团时，浓度减小大约10倍。荧光IHC(免疫荧光)载玻片也封固在ProLong Glass抗淬灭封固剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)中。

常规组织学染色

在IHC之后，基于以下H&E染色程序来执行以苏木精或伊红(或两者)进行的染色。如果IHC样本在二甲苯中经历最终脱水，则将样本载玻片通过浸泡在100％乙醇中持续1min，在90％乙醇中持续1min，在80％乙醇中持续1min以及在水中持续1min来重新水合。然后将载玻片浸泡在苏木精溶液(Ventana HE 600苏木精；订购代码07024282001)中持续2min，在水中持续2min，在Define溶液(Leica Surgipath SelectTech Define MX-aq，目录号3803595)中持续1min，在水中持续1min，在上蓝溶液(VWR上蓝试剂；目录号95057-852)中持续1min，在水中持续1min，在95％乙醇中持续30s，在伊红溶液(Ventana HE 600伊红；订购代码06544304001)中持续1min，在70％乙醇中持续1min，在100％乙醇中两次，每次持续1min，以及在二甲苯中3次，每次持续1min。然后让载玻片空气干燥并用以1.5型盖玻片覆盖的Richard Allan Scientific Cytoseal XYL(ThermoFisher Scientifc,Kalamazoo,MI)来进行封固或在Sakura FineteK USA(Torrance,CA)Tissue-Tek Film自动化盖片机上进行封固。如果仅需要苏木精染色，则通过上蓝和水洗步骤来执行对水合载玻片的染色，在苏木精溶液中孵育数秒至2min以达到期望的染色深度，然后跳至通过乙醇/二甲苯系列在环境温度下进行的脱水(2x80％乙醇，每次1min，2x90％乙醇，每次1min，3x100％乙醇，每次1min，3x二甲苯，每次1min)，并盖上盖玻片。如果仅需要伊红染色，则在95％乙醇步骤开始水合载玻片的染色并进行至完成，在伊红溶液中孵育数秒至1min以达到期望的染色深度。

常规组织学染色和共价沉积发色团(CDC)染色的显微镜和单相机单色成像

对经染色的样本的多光谱成像在Olympus BX-51显微镜(Olympus,Waltham,MA)上执行，该显微镜配备有CoolSNAP ES2 CCD相机和12位分辨率的1392x1040像素传感器(Teledyne Photometrics,Tucson,AZ)和LED照射，如前所述[Morrison LE,Lefever MR,Behman LJ,Leibold T,Roberts EA,Horchner UB,Bauer DR.Brightfield MultiplexImmunohistochemistry with Multispectral Imaging.Lab Invest(2020)https://doi.org/10.1038/s41374-020-0429-0]。显微镜物镜最初为Olympus UPlanSApo 20x(NA0.75)和10x(NA 0.40)空气物镜，但后来更新为具有改善的色差校正的UPLXAPO 20X(NA0.80)和UPLXAPO 10X(NA 0.4)物镜。照射由光学滤光的连续光源和LED照明器的组合提供。对于前者，Sutter Lambda 10-3 10位滤光轮(Sutter Instruments,Novato,CA)与Olympus100W卤钨灯一起使用以定义多达九个波长通道。LED照射设置有CoolLED(Andover,UK)pE-4000 16通道照明器和2个Lumencor Spectra X光引擎(Lumencor,Inc.,Beaverton,OR)，每个引擎包含6个定制选择的LED。照明器输出聚焦到3mm液体光导上，并且光导与一个或两个Lumencor组合器组合成单个直径为3mm的液体光导。最终光导通过CoolLED pE准直器/显微镜适配器连接到显微镜的照射端。为了进一步降低照射带宽，每个Lumencor LED都用单个带通滤光器进行滤光。使用手动控制与计算机控制的选项一起来实现滤光轮上的滤光器选择和LED选择。对透射通过显微镜的光的各个显微镜视场在CCD相机上的成像由Micromanager软件[Edelstein AD,Tsuchida MA,Amodaj N,Pinkard H,Wale RD,StuumanN.Advanced methods of microscope control usingμManager software.J BiolMethods 2014；1:e10]控制。图像处理(包括透射图像和吸收图像之间的转换和彩色合成图像的形成)用ImageJ软件[Schneider CA,Rasband WS,Eliceiri KW.NIH Image toImageJ:25years of image analysis.Nat Methods 2012；9:671-675]。

通常，多色样本用滤光轮和/或LED上的多个滤光器成像，其中每个滤光器和/或LED提供波长接近用于对样本染色的染料中的一种染料的吸光度最大值的光带(例如，伊红和HTX或其他应用于样本的常规染色剂，加上每种CDC。用于对多重IHC进行成像的不同光通道的数量至少等于染料的数量(色原加上常规染色剂成分)。为了计算透射率和吸光度图像，在用染色样本内期望的感兴趣区域处的相同系列的光通道记录图像之前和/或之后，使用载玻片未染色区域(例如，组织/细胞样本的一侧)上的每个光通道来记录图像。将染色的区域的透射光图像除以未染色的区域的图像(100％透射)来提供透射率(T)图像。对数转换提供吸光度(A)图像(A＝-log10T)，根据比尔定律，A与染料浓度成比例。彩色合成图像通过添加单色A图像来产生，对期望的伪着色具有适当的权重以形成合成图像的红色、绿色和蓝色平面。这些合成图像提供了“荧光样”表示，并且可以通过对A图像到T图像的反对数转换来转换为明视场表示。

常规组织学染色和共价沉积发色团(CDC)染色的显微镜和双相机彩色/单色成像

使用附接到用于正置显微镜的双相机安装座(Thorlabs；目录号2SCM1-DC)(附接到Olympus BX-63显微镜的相机端口)的Kiralux 5兆像素彩色CMOS摄像头和Kiralux 5兆像素单色CMOS相机(Thorlabs Inc.，Newton，NJ)实现同时2相机视频成像。明场照明用Olympus 100W卤钨灯提供，其中使用透射介于420nm与690nm之间的光的热镜(NewportCorp.,Irvine,CA；目录号20HMS-0)将输出限制到可见光谱，与CoolLED pE-4000 16LED照明器的输出相结合。使用CoolLED pE-Combiner和50-50中性密度分束器(ChromaTechnology，Bellows Falls，VT)将来自钨丝灯和与CDC的吸光度相匹配的LED的光合并。替代性地，虽然可以从CoolLED pE-4000照明器中的数个可见光LED产生光，而无需合并器。来自显微镜物镜的光在双相机安装座内经50-50分束器分裂成两路，并引导至彩色和单色相机。当需要同时观察可见白光和不可见CDC光时，向单色相机引导的光通过NewportFSR-UG5彩色玻璃滤光片过滤，透射低于400nm以及高于690nm的光，并且向彩色相机引导的光用除了相机的集成可见光透射滤光片之外还使用420nm长通CGA-420彩色玻璃滤光片(Newport Corp.,Irvine,CA)进行过滤。互补过滤设计成排除来自彩色相机的可见光谱范围的边界附近和之外的光，并排除来自单色相机的大部分可见光谱，确保其中常规染色剂或可见CDC进行吸收的钨丝灯照明仅由彩色相机检测到，并且其中不可见CDC进行吸收的照明带仅由单色相机检测到。使用ThorCam软件(Thorlabs)实现两个相机图像的视频速率图像采集和视频速率叠加。

双相机彩色/单色成像系统还可以如针对单相机单色成像系统所描述利用Lumencor照明器、CoolLED照明器和/或连续光源加上带通过滤的任意组合来照明。可以去除互补过滤以容许任一相机接收任何波长的照明。在此类配置下，采用双相机系统的单色相机作为用于多光谱成像的单相机单色成像系统中的单色相机。

荧光显微镜

使用双相机系统的单色相机并采用配备用于荧光激发的Olympus 75W氙灯的BX-63显微镜的荧光光路来记录荧光图像。使用Chroma Technology单带通滤光片组ET-Cy7(目录号49007)、ET-Spectrum Orange(目录号49305)和ET-DAPI(目录号49000)来分别对Cy7、TAMRA和DAPI荧光进行成像。

载玻片上吸光度测量

在用Olympus 100W卤钨灯或75W氙显微镜灯进行的照明下，将共价沉积发色团(CDC)和常规染色剂的吸收光谱记录在放置在Olympus BX-63显微镜的载物台上的载玻片安装样本上。使用Pryor Scientific Inc.(Rockland,MA)Lumaspec 800功率计测量在350nm与800nm之间(增量为大约0.5nm)的透射光。将该功率计升级为Ocean HDX UV至NIR光谱仪，其允许测量在200nm与1100nm之间的光谱。将通过载玻片染色区透射的光谱除以通过未染色(无组织)区域透射的光谱以得到透射率(T)光谱，使用关系A＝log10(1/T)将其转换为色原吸光度(A)光谱。

实例

实例1

前言

常规明场细胞核复染剂苏木精(HTX)提供了细胞和组织环境的有价值的测度，该测度有助于对生物标志物和核酸序列的免疫组织化学(IHC)和原位杂交(ISH)染色的解释。然而，对于明场显微镜中使用的其他常规染色剂来说，HTX的吸收光谱相当宽，如图10所示，在该图中绘制了HTX和常见明场色原的吸收光谱。虽然当与一种或两种色原组合使用时，HTX充当有效的复染剂，但由于图10中绘制的任何两种染料之间较宽的光谱重叠区域，常规色原的宽光谱使高阶多重的视觉评估复杂化。本文描述的可检测部分容许具有更窄吸收带的色原的快速开发，促进更高阶的明场多重。五个可检测部分的吸收光谱展示于图11中。窄带可检测部分之间减少的光谱重叠提供对染色的生物标志物的改进的视觉区分，特别是在用单色相机进行成像并在光谱上对不同色原吸光度进行解混之后。然而，仍然需要复染，并且遗憾的是，仍然利用流行的常规HTX复染。HTX吸收光谱也包括在图11中，其用于强调HTX吸收的广泛性质，以及随之而来的HTX与所有多重窄带色原之间的光谱重叠的问题。尽管可检测部分具有较窄的吸收带，但HTX重叠仍然对视觉辨别和光谱解混提出了挑战。为了减少此问题，通常降低HTX染色水平，这通常使对复染剂的检测变得困难，同时仍然促成HTX与多重色原之间一定程度的光谱串扰。

通过使用针对形态学细胞核成分的一抗开发基于IHC的复染剂，解决了宽复染剂吸收的问题。形态学细胞核成分的示例为双链DNA(ds DNA)和组蛋白。DNA为苏木精结合的主要靶标，并且组蛋白为与DNA缔合以最终在细胞核内形成核小体和染色质的蛋白质，因此应用针对ds-DNA或组蛋白的IHC来实现类似于HTX的细胞核染色。由抗ds DNA或抗组蛋白抗体引导的具有窄吸收带的可检测部分(包括本文所述的那些中的任一者)已用于实现复染剂，该复染剂大大减少与其他色原的光谱串扰的量，从而改善通过显微镜进行的视觉辨别和/或经由成像和光谱解混进行的可视化和量化。

材料和方法

一抗(抗ds DNA[DSD/958](ab215896)和抗组蛋白H3(ab1791))从ABCAM(Cambridge MA)获得。

结果和讨论

在用HTX复染进行的IHC中测试抗ds DNA和抗组蛋白H3抗体，以确定针对细胞核成分的IHC是否可以提供类似于HTX的染色。IHC采用Cy7 CDC，其中主要吸光度位于光谱的不可见远红/近IR部分。在770nm处的Cy7吸光度最大值与光谱的红色部分中的HTX吸光度(吸光度最大值618nm)完全分离，因此可以单独地评估每种抗体和HTX的染色。图12示出了使用抗ds DNA IHC和HTX染色的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)扁桃体组织样本的明场显微镜图像。在图12的左侧用来自770nm发光二极管(LED)的照明使用单色CMOS相机以及在右侧用来自卤钨灯的白光照明使用彩色(RGB)CMOS相机以20X放大率记录图像。

使用双相机系统进行成像，并允许用单色和彩色相机进行同时成像。由于每个相机除了彩色相机上的拜耳过滤之外均还使用相同的CMOS传感器，因此可以将相机对准，从而容许两个图像以视频显示速率的重叠。彩色相机忠实地再现通过显微镜目镜视觉地观察到的情况，并且仅反射HTX染色剂，而单色相机经过滤以记录其中仅Cy7 CDC染色剂进行吸收的不可见770nm光。如图12所示，对两个图像的视觉评估证明，HTX复染剂和抗ds DNA IHC对所有细胞的细胞核进行类似的染色。使用抗组蛋白抗体对FFPE扁桃体组织进行的双重染色的结果显示在图13中。如针对抗ds DNA抗体所观察到的，抗组蛋白抗体对所有细胞核进行染色，再现常规HTX复染剂的一般染色模式。

为了进行对抗体/Cy7染色与HTX染色的更仔细的比较，使用针对Cy7的770nm LED照明和针对HTX的595nm LED照明来记录每一者的单色图像。图14示出了针对抗ds DNAIHC/HTX染色的FFPE扁桃体载玻片的20X放大视场的两个单色图像；并且图15示出了针对抗组蛋白IHC/HTX染色的FFPE扁桃体载玻片的20X放大视场的两个单色图像。如图15和16所示，针对抗体和HTX的染色模式看起来相似，但是针对两种抗体的抗体染色似乎提供了跨视场更均匀的细胞核染色水平。由于复染目的是在不考虑细胞类型的情况下识别所有细胞核，因此均匀染色是期望性质，从而与提供基于IHC的复染的意想不到的优点。

实例2

图12至15中的示例使用不可见近IR吸收色原C7，其容许对基于HTX和IHC的复染进行比较。也可以针对与HTX类似的颜色来设计可检测部分，以作为现有测定中的直接代替物或只提供预期的HTX着色。两种HTX代替可检测部分的吸收光谱与HTX吸收光谱绘制在图17中。Rhod614可检测部分具有与HTX密切匹配的吸光度最大值，并且Rhod634可检测部分具有红移吸光度最大值。还需注意，与HTX相比，两个代替可检测部分的吸收带要窄得多。图18和19示出了对FFPE扁桃体分别用抗ds DNA和抗组蛋白进行IHC时使用的可检测部分的Rhod614(左幅)和Rhod634(右幅)的彩色图像。与图12和13(右幅)中的彩色图像相比，示出了HTX与这些可检测部分之间的色彩相似性。

图20展示了先前在多重IHC中使用并在图11中示出的相同的五个可检测部分的吸收光谱以及Rhod614和Rhod634 IHC复染剂的光谱，示出了可检测部分与复染剂之间大幅减少的光谱串扰。用Rhod614代替HTX有望改善使用Dabsyl、Rh110、TAMRA、SRhod101和Cy5可检测部分的多重的可视化和光谱解混。替代性地，可以采用红移Rhod634复染剂，并用Cy5.5代替Cy5 CDC，以更多地分离色原吸收带并进一步减少光谱串扰。Cy5.5 CDC的吸收光谱也包括在图20中以进一步说明该选项。

如下面在表13A和13B中所示，其列出用于对HTX染色一致性与根据所公开的方法在(图16的)给定细胞内进行的复染进行染色的参数，根据所公开的方法的复染实际上在大多数情况下比用苏木精更一致。

表13A

表13B

实例3-利用复染剂的多重IHC

执行利用抗ds DNA复染剂或苏木精复染剂进行的多重IHC，以比较复染剂表现，并且尤其检查复染剂吸光度对多重生物标志物染色的解释的影响。对FFPE扁桃体组织执行多重IHC，以对CD3(使用dabsyl CDC)、CD20(使用TAMRA CDC)、CD8(使用Cy5.5 CDC)和ds DNA(使用Rhod634)进行染色。使用438、549、620和689nm过滤的LED的透射光的图像从左到右分别呈现在图22的前四个图像中，记录在单色相机(双相机系统)上。选择这些照明通道以分别在dabsyl、TAMRA、Rhod634和Cy5.5的吸光度最大值附近对准。第五个图像为使用白光照明在彩色相机(双相机系统)上记录的相同显微镜视场。需注意，在CD3、CD20和CD8图像中，这三种生物标志物所位于的膜存在清晰的染色，对于CD3和CD8，主要为T细胞，并且对于CD20，主要为B细胞。这些膜染色的细胞的中心细胞核区域的颜色也很浅，表明由于细胞核复染剂Rhod634，几乎没有可检测的吸收。另外，注意该图像和Rhod634复染剂图像中通过箭头在CD20 TAMRA图像中标识的清晰区域，这表明虽然这些区域中存在CD20阴性细胞的细胞核，但它们未在CD20图像中示出，因此不导致对哪些细胞为CD20阳性的误解。生物标志物染色与复染的良好分离是由于在照明波长下Rhod634复染剂吸光度与生物标志物吸光度之间的最小的重叠，如从图20中绘制的光谱可以看出的。

还执行多重IHC，以在同一FFPE扁桃体标本的另一切片上用相同的色原对相同的三种生物标志物进行染色。该切片用常规苏木精复染剂代替抗ds DNA复染剂进行染色。使用438、549、620和689nm过滤的LED的透射光的图像从左到右分别呈现在图23的前四个图像中。选择这些照明通道以分别在dabsyl、TAMRA、苏木精和Cy5.5的吸光度最大值附近对准。第五个图像为使用白光照明在彩色相机(双相机系统)上记录的相同显微镜视场。选择苏木精染色时间(5s)以提供苏木精和Rhod634两者的相似的复染剂吸光度，如图24中这两个切片的吸收光谱所示。注意，在CD3和CD8图像中，存在膜的明显染色，但细胞核区域比当使用Rhod634抗ds DNA复染剂时稍暗，表明在dabsyl和Cy5.5照明波长下虽小但明显的苏木精吸收水平。很明显在TAMRA照明波长下有相当多的苏木精吸收，以至于特性CD20膜染色可能被误解为整个细胞的染色，或者CD20阴性细胞可能被解释为CD20阳性。TAMRA照明通道中的这种高苏木精吸收水平是由苏木精的宽光谱吸收造成的，如图11中绘制的吸收光谱所证实。为了减少这个问题，通常使用相当低的苏木精染色水平来复染IHC标本。然而，由于微弱的染色，这使得难以辨别对样本中的所有细胞的识别，从而降低解释一般组织形态以及识别生物标志物阴性细胞的能力。采用基于IHC的细胞核复染允许选择复染光谱特性，并且就Rhod634来说提供了窄带吸光度，该窄带吸光度对生物标志物色原染色的可视化和解释的干扰微不足道。

实例4-细胞质复染剂

当观察细胞核内以低水平表达的生物标志物时，普遍存在的细胞质复染剂可以优选于细胞核复染剂。肌动蛋白为高度保守的蛋白质，其基本上存在于所有真核细胞中，其中β肌动蛋白(ACTB)为两种细胞质形式中的一种(Gunning,PW,Ghoshdastider,U,Whitaker,S,Popp,D和Robinson,RC.The evolution of compositionally and functionallydistinct actin filaments.J.Cell.Sci.(2015)128:2009-2019)。如此，基于抗ACTB的IHC染色应提供良好的细胞质复染。为了证明这一点，对FFPE扁桃体组织执行使用Cy7 CDC进行的抗肌动蛋白IHC，接着是伊红染色。伊红在光谱上与Cy7分离良好，并且除了结缔组织之外，还对细胞质进行染色。图25从左到右示出了三个不同显微镜视场的图像，其中顶部图像在525nm LED照明(其中伊红吸收光)下记录，并且对应的下部图像在770nm LED照明(其中Cy7吸收光)下记录，反映了肌动蛋白的存在。在比较上部图像和下部图像时，需注意伊红染色和肌动蛋白染色两者均勾画了单独细胞的细胞质。另外需注意，伊红也将其他非细胞区域染成深色。鉴于此，抗肌动蛋白IHC提供更好的细胞复染，因为它基本上识别所有细胞的细胞质区域，而不受结缔组织和与伊红结合的其他蛋白质区域的干扰。

实例5-荧光复染剂

荧光复染剂在免疫荧光(IF)和荧光原位杂交(FISH)中非常重要。DAPI使用广泛，并且可能是针对原位测定的最常见复染剂，与DNA结合并用蓝色荧光对细胞核进行染色。我们出于同样的目的检查了荧光CDC(fCDC)，提供对整个光谱内的荧光色彩的选择，并提供便捷的非细胞核复染途径。事实上，绘制在图11和20中的大多数CDC当在比针对显色染色所用的浓度更低的浓度下沉积时发出强荧光。图26示出了对使用Cy7CDC、TAMRA CDC和AMCA CDC在1/10典型色原浓度下以抗ds DNA IHC染色的FFPE扁桃体组织记录的单色荧光图像。所有三种fCDC均提供明亮且独特的染色，范围从光谱的远红(Cy7)端到远蓝(AMCA)端。AMCA特别有吸引力，因为其在类似于常见DAPI复染剂的波长下被激发并发出荧光，同时提供比DAPI更窄的发射光谱。这在图27中得到证明，该图绘制了DAPI和AMCA的激发和发射光谱。较窄的AMCA发射光谱减少与IF和FISH中使用的其他荧光染色剂和标记物的光谱串扰，减少在对生物标志物存在和/或表达水平的解释方面的潜在复染干扰，并通过允许更多地使用AMCA荧光附近的光谱区域来潜在地容许更高水平的多重。可以选择具有其他激发和发射最大值的CDC，以在光谱上远离特定测定中使用的生物标志物染色的荧光。

附加实施例

附加实施例1.

(a)用第一可检测部分来标记生物学样品的第一形态学特征的至少一部分，其中对第一形态学特征的标记包括：(i)使具有第一形态学特征的至少一部分的特性的第一形态学标志物与第一检测探针接触，所述第一检测探针与所述第一形态学标志物结合，以及(ii)将第一可检测部分共价沉积在第一形态学标志物上或在其近侧；以及

(b)用第二可检测部分来标记生物学样品中的第一生物标志物，其中第二可检测部分不同于第一可检测部分，并且其中对第一生物标志物的标记包括：(i)使第一生物标志物与第二检测探针接触，所述第二检测探针结合所述第一生物标志物；以及(ii)将第二可检测部分共价沉积为在第一生物标志物上或在其近侧。

附加实施例2.

附加实施例3.

附加实施例4.

附加实施例5.

附加实施例6.

附加实施例7.

附加实施例8.

附加实施例9.

附加实施例10.

附加实施例11.

附加实施例12.

附加实施例13.

附加实施例14.

附加实施例15.

附加实施例16.

附加实施例17.

附加实施例18.

附加实施例19.

附加实施例20.

附加实施例21.

附加实施例22.

附加实施例23.

附加实施例24.

附加实施例25.

附加实施例26.

附加实施例27.

附加实施例28.

附加实施例29.

附加实施例30.

(a)用第一可检测部分来标记第一形态学标志物，该第一可检测部分包含选自由以下项组成的组的核：香豆素核、吩噁嗪酮核、4-羟基-3-吩噁嗪酮核、7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮核、硫堇鎓核、吩噁嗪核、吩噁噻-3-酮核、氧杂蒽核、七甲川菁核和克酮酸盐核；

(b)用第二可检测部分来标记第一生物标志物，该第二可检测部分包含选自由以下项组成的组的核：香豆素核、吩噁嗪酮核、4-羟基-3-吩噁嗪酮核、7-氨基-4-羟基-3-吩噁嗪酮核、硫堇鎓核、吩噁嗪核、吩噁噻-3-酮核、氧杂蒽核、七甲川菁核和克酮酸盐核；

其中第一和第二可检测部分不同并且具有相差至少10nm的吸光度最大值(λ

附加实施例31.

附加实施例32.

附加实施例33.

附加实施例34.

附加实施例35.

附加实施例36.

附加实施例37.

附加实施例38.

附加实施例39.

附加实施例40.

附加实施例41.

附加实施例42.

附加实施例43.

附加实施例44.

附加实施例45.

附加实施例46.

附加实施例47.

附加实施例48.

附加实施例49.

其中符号

附加实施例50.

附加实施例51.

附加实施例52.

附加实施例53.

附加实施例54.

附加实施例55.

附加实施例56.

附加实施例57.

附加实施例58.

附加实施例59.

附加实施例60.

附加实施例61.

附加实施例62.

附加实施例63.

附加实施例64.

附加实施例65.

附加实施例66.

附加实施例67.

附加实施例68.

附加实施例69.

附加实施例70.

附加实施例71.

附加实施例72.

附加实施例73.

其中符号

附加实施例74.

(i)使生物学样品与对第一形态学标志物具有特异性的第一一抗接触；

(ii)使生物学样品与对第一一抗具有特异性的第一二抗接触，其中该第一二抗与酶缀合；

(iii)使生物学样品与第一可检测缀合物接触，该第一可检测缀合物包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(b)第一可检测部分；

(iv)使生物学样品与对第一生物标志物具有特异性的第二一抗接触；

(v)使生物学样品与对第二一抗具有特异性的第二二抗接触，其中该第二二抗与酶缀合；以及

(vi)使生物学样品与第二可检测缀合物接触，该第二可检测缀合物包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(b)第二可检测部分。

附加实施例75.

附加实施例76.

附加实施例77.

附加实施例78.

附加实施例79.

附加实施例80.

附加实施例81.

附加实施例82.

附加实施例83.

附加实施例84.

附加实施例85.

附加实施例86.

附加实施例87.

附加实施例88.

附加实施例89.

附加实施例90.

附加实施例91.

附加实施例92.

(i)使所述生物学样品与对所述第一形态学标志物具有特异性的第一一抗接触；

(ii)使所述生物学样品与对所述第一一抗具有特异性的第一二抗接触，其中所述第一二抗与酶缀合；

(iii)使生物学样品与第一组织反应性部分接触，该第一组织反应性部分包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(b)能够参与点击化学反应的第一反应性官能团；

(iv)使生物学样品与第一可检测缀合物接触，该第一可检测缀合物包含：(a)第一可检测部分；以及(b)第二反应性官能团；

(v)使所述生物学样品与对所述第一生物标志物具有特异性的第二一抗接触；

(vi)使生物学样品与对第二一抗具有特异性的第二二抗接触，其中该第二二抗与酶缀合；

(vii)使生物学样品与第二组织反应性部分接触，该第二组织反应性部分包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(b)能够参与点击化学反应的第一反应性官能团；

(viii)使生物学样品与第二可检测缀合物接触，该第二可检测缀合物包含：(a)所述第二可检测部分；以及(b)第二反应性官能团。

附加实施例93.

附加实施例94.

附加实施例95.

附加实施例96.

附加实施例97.

附加实施例98.

附加实施例99.

附加实施例100.

附加实施例101.

附加实施例102.

附加实施例103.

附加实施例104.

附加实施例105.

附加实施例106.

附加实施例107.

附加实施例108.

附加实施例109.

(i)使所述生物学样品与对所述第一形态学标志物具有特异性的第一一抗接触；

(ii)使所述生物学样品与对所述第一一抗具有特异性的第一二抗接触，其中所述第一二抗与酶缀合；

(iii)使所述生物学样品与第一可检测缀合物接触，所述第一可检测缀合物包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(b)所述第一可检测部分；

(iv)使所述生物学样品与对所述第一生物标志物具有特异性的第二一抗接触；

(v)使所述生物学样品与对所述第二一抗具有特异性的第二二抗接触，其中所述第二二抗与酶缀合；

(vi)使所述生物学样品与第一组织反应性部分接触，所述第一组织反应性部分包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(b)能够参与点击化学反应的第一反应性官能团；

(vii)使所述生物学样品与第二可检测缀合物接触，所述第二可检测缀合物包含：(a)所述第二可检测部分；以及(b)第二反应性官能团。

附加实施例110.

附加实施例111.

附加实施例112.

附加实施例113.

(i)使所述生物学样品与对所述第一形态学标志物具有特异性的第一一抗接触；

(ii)使所述生物学样品与对所述第一一抗具有特异性的第一二抗接触，其中所述第一二抗与酶缀合；

(iii)使所述生物学样品与第一组织反应性部分接触，所述第一组织反应性部分包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(b)能够参与点击化学反应的第一反应性官能团；

(iv)使所述生物学样品与第一可检测缀合物接触，所述第一可检测缀合物包含：(a)所述第一可检测部分；以及(b)第二反应性官能团；

(v)使所述生物学样品与对所述第一生物标志物具有特异性的第二一抗接触；

(vi)使所述生物学样品与对所述第二一抗具有特异性的第二二抗接触，其中所述第二二抗与酶缀合；以及

(vii)使所述生物学样品与第二可检测缀合物接触，所述第二可检测缀合物包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(b)所述第二可检测部分。

附加实施例114.

附加实施例115.

附加实施例116.

附加实施例117.

附加实施例118.

附加实施例119.

(a)用第一可检测部分来标记第一形态学标志物，其中第一可检测部分具有FWHM小于约160nm的第一吸收峰以及介于330nm+/-10与950nm+/-10之间的吸光度最大值(λ

(b)用第二可检测部分来标记第一生物标志物，其中第二可检测部分不同于第一可检测部分，并且其中第二可检测部分具有FWHM小于约160nm的第一吸收峰以及介于330nm+/-10与950nm+/-10之间的吸光度最大值(λ

附加实施例120.

附加实施例121.

附加实施例122.

附加实施例123.

附加实施例124.

附加实施例125.

(a)用第一检测探针来标记第一形态学标志物，所述第一检测探针与所述第一形态学标志物结合，其中所述第一检测探针包含酶；

(b)使生物学样品与对第一检测探针具有特异性的第一抗物种抗体接触，其中第一抗物种抗体直接地或间接地缀合至至少一种第一酶；

(c)使生物学样品与第一可检测缀合物接触，该第一可检测缀合物包含：(i)第一可检测部分，以及(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；

(d)用第二检测探针来标记所述生物学样品中的所述第一生物标志物，所述第二检测探针结合所述第一生物标志物；

(e)使生物学样品与对第二检测探针具有特异性的第二抗物种抗体接触，其中第二抗物种抗体直接地或间接地缀合至至少一种第二酶；以及

(f)使生物学样品与第二可检测缀合物接触，该第二可检测缀合物包含：(i)第二可检测部分，以及(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物。

附加实施例126.

(a)用第一检测探针来标记第一形态学标志物，所述第一检测探针与所述第一形态学标志物结合，其中所述第一检测探针包含酶；

(b)使所述生物学样品与对所述第一检测探针具有特异性的第一抗物种抗体接触，其中所述第一抗物种抗体直接地或间接地缀合至至少一种第一酶；

(c)使生物学样品与第一组织反应性缀合物接触，该第一组织反应性缀合物包含：(i)能够参与点击化学反应的反应性官能团对的第一成员，以及(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；

(d)使生物学样品与可检测缀合物接触，该可检测缀合物包含(i)第一可检测部分，以及(ii)反应性官能团对的第二成员；以及

(e)用第二可检测部分来标记第一生物标志物，其中第一和第二可检测部分不同。

附加实施例127.

(a)用第一可检测部分来标记第一形态学标志物，其中第一可检测部分具有FWHM小于约160nm的第一吸收峰；以及

(b)用第二可检测部分来标记第一生物标志物，其中第二可检测部分不同于第一可检测部分，并且其中第二可检测部分具有FWHM小于约160nm的第一吸收峰；其中第一可检测部分的吸光度最大值(λ

附加实施例128.

附加实施例129.

附加实施例130.

附加实施例131.

(a)用第一可检测部分来标记所述生物学样品的第一形态学特征的至少一部分，其中对所述第一形态学特征的所述标记包括：(i)使具有第一形态学特征的至少一部分的特性的第一形态学标志物与第一检测探针接触，所述第一检测探针与所述第一形态学标志物结合，以及(ii)将第一可检测部分共价沉积在第一形态学标志物上或在其近侧；以及

(b)用第二可检测部分来标记生物学样品的第一形态学特征的至少一部分，其中对第一形态学特征的标记包括：(i)使具有第一形态学特征的至少一部分的特性的第二形态学标志物与结合至第二形态学标志物的第二检测探针接触，以及(ii)将第二可检测部分共价沉积为在第二形态学标志物上或在其近侧；其中第一和第二可检测部分不同。如此，在一些实施例中，可以通过以下来用两种或更多种不同可检测部分来标记相同形态学特征：针对各自具有相同形态学特征的特性的至少两种不同形态学标志物的存在进行染色。举例来说，第一形态学特征可以为细胞核，并且第一和第二形态学特征可以为DNA和组蛋白。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少三种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少四种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少五种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少六种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少七种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少八种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少九种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少十种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少十一种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。

附加实施例132.

附加实施例133.

附加实施例134.

附加实施例135.

附加实施例136.

附加实施例137.

附加实施例138.

附加实施例139.

附加实施例140.

附加实施例141.

附加实施例142.

附加实施例143.

附加实施例144.

附加实施例145.

附加实施例146.

附加实施例147.

附加实施例148.

附加实施例149.

附加实施例150.

附加实施例151.

附加实施例152.

附加实施例153.

附加实施例154.

附加实施例155.

附加实施例156.

附加实施例157.

附加实施例158.

附加实施例159.

附加实施例160.

附加实施例161.

附加实施例162.

附加实施例163.

附加实施例164.

附加实施例165.

附加实施例166.

附加实施例167.

附加实施例168.

附加实施例169.

附加实施例170.

附加实施例171.

附加实施例172.

附加实施例173.

附加实施例174.

附加实施例175.

(i)使所述生物学样品与对所述第一形态学标志物具有特异性的第一一抗接触；

(ii)使所述生物学样品与对所述第一一抗具有特异性的第一二抗接触，其中所述第一二抗与酶缀合；

(iv)使生物学样品与对第二形态学标志物具有特异性的第二一抗接触；

(v)使所述生物学样品与对所述第二一抗具有特异性的第二二抗接触，其中所述第二二抗与酶缀合；以及

(vi)使所述生物学样品与第二可检测缀合物接触，所述第二可检测缀合物包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(b)所述第二可检测部分。

在一些实施例中，第一和第二形态学标志物具有相同形态学特征的特性。如此，在一些实施例中，可以通过以下来用两种或更多种不同可检测部分来标记相同形态学特征：针对各自具有相同形态学特征的特性的至少两种不同形态学标志物的存在进行染色。举例来说，第一形态学特征可以为细胞核，并且第一和第二形态学特征可以为DNA和组蛋白。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少三种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少四种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少五种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少六种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少七种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少八种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少九种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少十种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。在一些实施例中，具有相同形态学特征的特性的至少十一种不同形态学标志物用不同可检测部分(包括本文描述的任何可检测部分)来染色。

附加实施例176.

附加实施例177.

附加实施例178.

附加实施例179.

附加实施例180.

附加实施例181.

附加实施例182.

附加实施例183.

附加实施例184.

附加实施例185.

附加实施例186.

附加实施例187.

附加实施例188.

附加实施例189.

附加实施例190.

附加实施例191.

附加实施例192.

附加实施例193.

附加实施例194.

附加实施例195.

附加实施例196.

其中所述生物学样品通过以下来制备：

(i)使所述生物学样品与对所述第一形态学标志物具有特异性的第一一抗接触；

(ii)使所述生物学样品与对所述第一一抗具有特异性的第一二抗接触，其中所述第一二抗与酶缀合；

(iv)使所述生物学样品与第一可检测缀合物接触，所述第一可检测缀合物包含：(a)所述第一可检测部分；以及(b)第二反应性官能团；

(v)使所述生物学样品与对所述第二形态学标志物具有特异性的第二一抗接触；

(vi)使所述生物学样品与对所述第二一抗具有特异性的第二二抗接触，其中所述第二二抗与酶缀合；

(vii)使所述生物学样品与第二组织反应性部分接触，所述第二组织反应性部分包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物前体部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物前体部分的衍生物或类似物；以及(b)能够参与点击化学反应的第一反应性官能团；

(viii)使所述生物学样品与第二可检测缀合物接触，所述第二可检测缀合物包含：(a)所述第二可检测部分；以及(b)第二反应性官能团。

附加实施例197.

附加实施例198.

附加实施例199.

附加实施例200.

附加实施例201.

附加实施例202.

附加实施例203.

附加实施例204.

附加实施例205.

附加实施例206.

附加实施例207.

附加实施例208.

附加实施例209.

附加实施例210.

附加实施例211.

附加实施例212.

附加实施例213.

附加实施例214.

附加实施例215.

附加实施例216.

本说明书中提到的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请以及非专利公开通过引用以其整体并入本文。如有必要，可对实施例的各个方面进行修改，从而采用各类专利、应用和公开的概念来提供其他进一步的实施例。

尽管本文已参考具体实施方案描述本公开，但应当理解，这些实施例仅说明性地表示本公开的原理和应用。因此，应当理解，可以对说明性实施例进行许多修改，并且可以在不脱离所附权利要求所限定本公开的精神和范围的情况下设计其他布置方式。

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该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：
专利申请人：文塔纳医疗系统公司;

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