一种可控孔径水凝胶海绵骨组织模型的构建

技术领域

本发明涉及的是一种可控孔径水凝胶海绵骨组织模型的构建，属于类器官模型技术领域，提供一种具有不同孔隙率的细胞支架，模拟骨细胞的三维体内微环境，具体涉及不同孔隙率水凝胶海绵支架制备和水凝胶海绵骨组织模型的构建。

背景技术

类器官模型构建近年来发展迅速，相比于传统的动物模型和孔板模型具有不可替代的优势，既可避免动物和人之间的种属差异性，又克服了孔板模型的细胞单一性，为细胞提供类似于体内的三维细胞微环境。人体骨组织是一种高度血管化且具有多孔结构的器官，是存储钙元素的重要器官，起到支撑的作用。目前骨相关疾病包括骨质疏松、关节炎、骨癌痛等，治疗药物有黄酮类、多甾体类药物等，而这些药物的筛选和毒理研究是一个巨大的工作量，因此，骨组织类器官模型的构建具有重要意义。

水凝胶具有良好的生物相容性，可以为细胞提供细胞粘附位点，并能够提供类似于体内的微环境，使细胞保持正常的自身形态和生命活动。常用的水凝胶材料有明胶、海藻酸钠、琼脂糖、胶原蛋白等，在构建细胞水凝胶支架的研究中发现，不同水凝胶材料交联之后具有更加优良的特性，如更优良的机械性能和耐热性。胶原蛋白广泛存在于动物组织中，最为常见的是Ⅰ型胶原，具有良好的生物相容性，广泛应用于生物医学领域。明胶是胶原蛋白的水解产物，具有较低的抗原性和较好的相容性，可以促进细胞的粘附和软骨形成。另外，明胶可以与MTG酶、戊二醛交联，使明胶水凝胶的机械强度得以提高。海藻酸钠是一种天然多糖，可以和各种阳离子形成多种海藻酸盐水凝胶。复合水凝胶比单一的水凝胶性能上可以得到提升，例如海藻酸钠/明胶水凝胶的机械性能相对于单组分材料得到了增强。而明胶/壳聚糖复合水凝胶在耐热性能上得到了提升，且根据这一性能制备了多种结构的细胞支架水凝胶。

作为骨组织的主要构成成分，羟基磷灰石(HA)是体外骨组织类器官的构建中必不可少的成分。结合微流控技术及水凝胶材料的优势，利用掺杂了羟基磷灰石的水凝胶制备的微流控芯片不仅有利于成骨细胞的增值，碱性磷酸酶(ALP)的表达也得以提高。因此，可将HA掺杂到水凝胶材料中，体外制备不同孔径的水凝胶海绵结构的骨组织模型。

本专利中，提供了一种可控孔径水凝胶海绵骨组织模型的构建以及其在骨组织疾病模拟的应用技术。首先根据不同质量分数的凝胶材料制备了具有可控孔径的水凝胶海绵，并使得HA在水凝胶海绵中分布均匀，得到为细胞提供良好细胞微环境的细胞支架。该方法制备过程简单，条件易于控制，无需经过冻干操作即可进行细胞三维培养。并且将水凝胶海绵和明胶通道结合构建出水凝胶海绵骨组织模型，在骨疾病病理模型和药物筛选模型的构建方面具有重要的生物学意义。

发明内容

本发明提供了一种简便可控孔径的水凝胶海绵骨组织模型的构建方法，用于模拟人体骨组织的多孔结构，并且为细胞三维培养提供良好的微环境，以便为构建骨疾病病理模型和药物筛选模型研究提供一定的理论依据。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

(1)不同孔隙率明胶海绵的制备：称取一定质量梯度的明胶于50mL的烧杯中；随后加入PBS缓冲液(pH＝7.2)，水浴加热至80℃成明胶溶液，使用磁力搅拌器搅拌3min后，移取10％(w/v)的mTG酶溶液于烧杯中，继续搅拌至温度37℃，得到气泡明胶溶液，冷却后形成明胶海绵支架。

(2)明胶海绵骨组织模型的制备：称取一定质量的明胶于PBS缓冲液中，水浴加热成明胶溶液后，加入10％(w/v)的mTG酶溶液，用移液枪移取明胶溶液于模具中冷却，形成凝胶；随后将(1)中的气泡明胶溶液与HA通过搅拌混合均匀，用移液枪移取于模具中冷却，形成明胶海绵；之后继续称取明胶于PBS缓冲液中，水浴加热成明胶溶液后，加入10％(w/v)的mTG酶溶液，温度降低至37℃，注入模具中将明胶海绵支架覆盖，最终形成水凝胶海绵骨组织模型。

本发明目的之一为提供一种可控孔径的水凝胶海绵制作方法：

(1)构建水凝胶海绵的凝胶材料：胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、琼脂糖、壳聚糖、粘多糖、糖蛋白、纤维蛋白原、蚕丝蛋白。

(2)通过控制凝胶材料的质量分数可以有效控制水凝胶海绵的孔径大小，通过优选，明胶材料的质量分数范围：0.5％-20.0％；琼脂糖的质量分数范围：1.0％-25.0％；明胶/海藻酸钠海绵构建过程中，明胶的质量分数范围为：0.5％-20.0％，海藻酸钠的质量分数范围：0.1％-5.0％。

(3)水凝胶海绵的固化方式：光固化、温度固化、化学交联、离子交联。

(4)水凝胶海绵的交联剂包括mTG酶、戊二醛、CaCl

(5)通过搅拌的方法，HA可在水凝胶中混合均匀，通过优选，水凝胶海绵中HA质量分数范围：0.1-0.5％。

(6)通过快速搅拌的方法，使得水凝胶溶液中充满空气，凝固后形成水凝胶海绵，通过优选，水凝胶溶液搅拌时间范围为5-25min，搅拌的转速范围为1000-3000r/min。

(7)水凝胶溶液的搅拌方式：磁力搅拌器或机械搅拌。

本发明目的之二为提供一种通道和水凝胶海绵的结合方法，使得模拟骨组织的明胶海绵与模拟血管的通道结合。

(1)通过优选，制作通道的凝胶材料可为胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、琼脂糖、壳聚糖、粘多糖、糖蛋白、纤维蛋白原；制作通道的凝胶材料可使用明胶等可光固化和温度固化的材料或者使用明胶与其他材料的复合材料，通过明胶温度固化的性能，使得复合溶液先形成凝胶，之后使用与明胶之外材料的交联剂进行胶粘，即可得到水凝胶通道模型。

(2)通过优选，通道直径范围为50μm-1000μm。

(3)通过优选，通道与水凝胶海绵的距离范围为50μm-2000μm。

(4)模型可在水凝胶海绵周围同时制作多个通道，多个通道保持在同一平面上，不同通道的间距范围为50μm-1500μm。

(5)可以通过控制气泡水凝胶溶液的量，来控制水凝胶海绵的厚度，通过优选最佳厚度为2mm-5mm。

本发明的优点和效果：

(1)通过上述方法，水凝胶海绵的孔径得到了很好的控制，进而可以控制水凝胶海绵的孔隙率，用于模拟人体中不同部位不同孔隙率的骨组织，且HA在水凝胶海绵中的均匀混合可以模拟骨组织的三维体内微环境。

(2)本发明中水凝胶海绵骨组织模型的构建方法采用三次浇筑法，可以通过改变第一次浇筑的体积有效的控制骨组织与通道之间的间距；且通过改变第二次浇筑气泡水凝胶的体积也可控制水凝胶海绵的厚度；最后通过第三次浇筑使得水凝胶海绵和通道模型结合在一起。

(3)本发明提供的骨组织模型构建方法简单快捷，重复性强，具有一定的实用性。

附图说明

(1)本发明中构建的不同孔径的明胶海绵在不同质量分数时，具有随着明胶质量分数的增大，呈现出孔径的减小、孔隙率下降的趋势，如图1所示。

图1是明胶海绵孔径大小分布(a-f质量分数逐渐增大)标尺：100mm

(2)罗丹明B在不同孔径的明胶海绵中的扩散具有如下现象，在相同的扩散时间下，呈现出随着明胶海绵孔径增大、孔隙率提高而扩散速度增大的趋势。

图2是罗丹明B在明胶海绵中的扩散(a-f质量分数逐渐增大)标尺：200mm

(3)图3为本发明水凝胶海绵骨组织模型示意图：1.通道；2.水凝胶海绵；3.明胶。

图3是水凝胶海绵骨组织模型。

具体实施方式

实施例1

琼脂糖海绵骨组织模型的制备：称取一定质量的明胶于PBS缓冲液中，水浴加热成明胶溶液后，加入10％(w/v)的mTG酶溶液，用移液枪移取明胶溶液于模具中冷却，形成凝胶；其次，称取一定质量的琼脂糖于50mL的烧杯中,加入PBS缓冲液，水浴加热至65℃，形成琼脂糖溶液，随后使用磁力搅拌器快速搅拌3min，加入一定质量的HA后，继续搅拌，直到温度降低到37℃，随后用移液枪移取气泡琼脂糖溶液于模型中凝固；最后，称取一定质量的明胶于PBS缓冲液中，水浴加热成明胶溶液后，加入10％(w/v)的mTG酶溶液，等待温度降低到37℃后，用移液枪将明胶溶液注入模具，将琼脂糖海绵支架覆盖，最终形成琼脂糖海绵骨组织模型。

实施例2

海藻酸钠/明胶海绵骨组织模型的制备：称取一定质量的明胶于PBS缓冲液中，水浴加热成明胶溶液后，加入10％(w/v)的mTG酶溶液，用移液枪移取明胶溶液于模具中冷却，形成凝胶；其次，称取一定质量的海藻酸钠和明胶于50mL的烧杯中,加入PBS缓冲液，水浴加热至65℃，形成海藻酸钠/明胶复合溶液，随后使用磁力搅拌器快速搅拌3min，加入一定质量的HA后，继续搅拌，直到温度降低到37℃，随后用移液枪移取气泡海藻酸钠/明胶溶液于模型中凝固，10min后，注入CaCl

实施例3

明胶海绵/成骨细胞骨组织模型的制备：称取一定质量的明胶于PBS缓冲液中，水浴加热成明胶溶液后，加入10％(w/v)的mTG酶溶液，用移液枪移取明胶溶液于模具中冷却，形成凝胶；其次，称取一定质量的明胶于50mL的烧杯中,加入PBS缓冲液，水浴加热至65℃，形成明胶溶液，随后使用磁力搅拌器快速搅拌3min，加入一定质量的HA后，继续搅拌，直到温度降低到37℃，随后用移液枪移取气泡明胶溶液与重悬后的成骨细胞混合均匀，于模型中凝固；最后，称取一定质量的明胶于PBS缓冲液中，水浴加热成明胶溶液后，加入10％(w/v)的mTG酶溶液，等待温度降低到37℃后，用移液枪将明胶溶液注入模具，将胶海绵支架覆盖，最终形成明胶海绵/成骨细胞骨组织模型。

实施案例4

(1)明胶海绵/成骨细胞骨组织模型的制备：称取一定质量的明胶于PBS缓冲液中，水浴加热成明胶溶液后，加入10％(w/v)的mTG酶溶液，用移液枪移取明胶溶液于模具中冷却，形成凝胶；其次，称取一定质量的明胶于50mL的烧杯中,加入PBS缓冲液，水浴加热至65℃，形成明胶溶液，随后使用磁力搅拌器快速搅拌3min，加入一定质量的HA后，继续搅拌，直到温度降低到37℃，随后用移液枪移取气泡明胶溶液与重悬后的成骨细胞混合均匀，于模型中凝固；最后，称取一定质量的明胶于PBS缓冲液中，水浴加热成明胶溶液后，加入10％(w/v)的mTG酶溶液，等待温度降低到37℃后，用移液枪将明胶溶液注入模具，将胶海绵支架覆盖，最终形成明胶海绵/成骨细胞骨组织模型。

(2)明胶海绵/成骨细胞/骨转移模型的制备：将(1)中模型放入培养基中2-3周后，将肺癌细胞A549重悬，取出上清液，将细胞吸入注射器中，向(1)中制备模型中的明胶海绵支架部分注入，细胞稳定后即可得到明胶海绵/成骨细胞/骨转移模型。