多价氯毒素嵌合抗原受体

相关申请

本申请要求2021年1月20日递交的美国临时专利申请第63/139,709号和2021年4月8日递交的美国临时专利申请63/172,247号的优先权。上述申请的全部内容通过引证在此全部并入本文。

背景技术

嵌合抗原受体(CARs)由细胞外肿瘤识别/靶向结构域、细胞外接头/铰链结构域、跨膜结构域以及细胞内T细胞激活和共刺激信号结构域组成。大多数CAR肿瘤靶向结构域是来源于利用抗体与特定抗原结合的特异性的抗体序列的单链可变片段(scFv)。例如，抗CD19靶向CARs KYMRIAHTM和YESCARTATM分别是用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤的批准疗法，并且包含来源于鼠抗人CD19抗体的scFv(Guedan et al.(2019),Mol Ther Methods Clin Dev 12:145-156)。

WO2018107134和WO2017066481的内容通过引证在此并入本文，这两个申请描述了嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含氯毒素(CLTX)作为细胞外抗原结合结构域。CLTX是一种来源于蝎毒的小天然肽，特异性靶向多形性胶质母细胞瘤(GBM)上基质金属蛋白酶2(MMP2)和氯通道CLCN3表达的改变。CLTX还与黑色素瘤、小细胞肺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌症、肾脏癌症、肝癌、肺癌、卵巢癌症和髓母细胞瘤等结合。氯毒素的一级结构包括36个氨基酸，包括8个半胱氨酸，属于短链含二硫化物的肽。WO2018107134具体描述了被改造以表达氯毒素的γ-δ(γδ)T细胞。

γδT细胞是T淋巴细胞的一个重要亚群，这是由于它们可以在没有抗原引发或主要组织相容性复合体(MHC)分子存在的情况下识别广泛的抗原。它们可以通过细胞毒性活性直接靶向并杀死细胞，或通过激活其他免疫细胞类型间接靶向并杀害细胞。γδT细胞功能反应由多种因素诱导，包括应激抗原的识别，应激抗原促进细胞因子的产生并调节病原体清除、炎症和组织稳态以应对应激(例如化疗剂环境)。γδT细胞对肿瘤的细胞毒性可以通过在肿瘤细胞上表达细胞表面受体来诱导，包括天然杀伤群2D配体(NKG2DL)。

虽然免疫疗法的最新进展在治疗颅外肿瘤方面显示出了前景，但GBM仍然不受这些进展的影响，其持续的中位生存期不到15个月。本领域仍然需要针对GBM以及其他液体和固体癌症和肿瘤的额外治疗，特别是额外的CAR T细胞治疗。

发明内容

本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：与具有单个CLTX肽的对比细胞相比，用在细胞外抗原结合结构域中的包含两个CLTX多肽的CAR转导的γδT细胞表现出对胶质母细胞瘤(GBM)细胞的增加的持久性以及增加的细胞毒性。即使当细胞在内胚层内不包括细胞内信号结构域时，也观察到细胞毒性增加。此外，研究表明，用两种以上的CLTX肽(例如，三种或多种CLTX肽)转导T细胞并不能增强活化，并导致CAR不能正确或功能性地存在于细胞表面。此外，本发明至少部分基于令人惊讶的发现，用CAR转导的T细胞(dCLTX CAR细胞)在细胞外抗原结合域中包含两个CLTX肽，与在细胞外抗体结合域中包括单个CLTX肽的细胞(sCLTX CARγδT细胞)相比，在细胞外抗原结合域中包含两个CLTX肽的dCLTX CAR细胞显示大于2倍的CD69活性。虽然可能已经预测到两种CLTX肽的存在将是相加的，并且导致比单个CLTX肽更大(例如，两倍)的CD69活化作用，但是令人惊讶的是，在CAR中仅存在两种CLTX-肽会导致比具有单个CLTX肽的CAR活性大2倍以上。该数据表明，细胞外抗原结合结构域中多种CLTX肽(两种CLTX肽)的存在对T细胞活化具有协同作用，并且出乎意料地显示出对胶质母细胞瘤细胞更大的持久性和更大的细胞毒性。

本发明包括γδT细胞，所述γδT细胞表达多价CLTX-CAR(在细胞外抗原结合结构域中包含一种以上CTLX肽的CAR)并且还表达生存因子。其中所述生存因子是DNA、RNA或者多肽，所述生存因子赋予对化疗剂的耐受性，本发明还包括表达多价CLTX-CAR和生存因子的γδT细胞，包含多价CLTX-CARγδT细胞的药物组合物以及治疗受试者中的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给予有效量的多价CLTX-CARγδT细胞和共同给药化疗剂，例如生存因子赋予耐药性的化疗剂。多价CLTX-CAR优选在细胞外抗原结合结构域中包含两个CLTX肽。包括两个CLTX肽的CLTX-CAR在本文中可称为“二价CLTX-CAR”或“双CLTX-CAR-”或“dCLTX-CAR”(这些术语在本文中可互换使用)。在某些方面，多价CLTX-CAR(例如dCLTX-CAR)不包含细胞内信号传导结构域。

本发明包括工程化的γδT细胞，所述γδT细胞表达多价CLTX嵌合抗原受体(多价CLTX-CAR)和生存因子，其中，所述生存因子是DNA、RNA或者多肽，所述生存因子赋予对化疗剂的耐受性抗性，其中，γδT细胞包括单载体，所述单载体指导多价CLTX-CAR和生存因子的表达，并且其中：

a.所述多价CLTX-CAR包括：

i.细胞外抗原结合结构域，其包含以下肽中的至少两种：CLTX肽、CLTX样多肽和CLTX肽的功能变体(包括其组合)，

其中所述至少两种CLTX肽、CLTX样多肽、CLTX肽的功能性变体或其任何组合通过连接肽连接；任选地，所述连接肽的长度小于30个氨基酸或长度为15个氨基酸；

ii.跨膜结构域；

iii.一种可选的细胞外铰链结构域，将跨膜结构域连接到细胞外抗原结合结构域；

iv.任选地，细胞内信号传导结构域；和

v.任选地，共刺激结构域。在某些方面，多价CLTX-CAR包含选自CLTX肽、CLTX样多肽、CLTX肽的功能性变体及其组合的两种肽。.

在具体实施方案中，本发明涉及一种表达多价CLTX嵌合抗原受体(多价CLTX-CAR)和生存因子的γδT细胞，其中所述生存因子是赋予对化疗剂抗性的多肽，其中γδT细胞包含指导多价CLTX-CAR和生存因子表达的单个载体，并且其中：

a.所述多价CLTX-CAR包括：

i.包含至少两种CLTX肽的细胞外抗原结合结构域，其中所述至少两个CLTX肽通过连接肽连接；任选地，所述连接肽的长度小于30个氨基酸，或长度为15个氨基酸；

ii.跨膜结构域；

iii.一种可选的细胞外铰链结构域，将跨膜结构域连接到细胞外抗原结合结构域；

iv.任选地，细胞内信号传导结构域；和

v.任选地，共刺激结构域。

如这里所述，本发明还包括工程化的γδT细胞群体。在某些方面，多价CLTX-CAR在细胞外抗原结合结构域中包含两个CLTX肽。在某些方面，多价CLTX-CAR(例如dCLTX-CAR)不包含细胞内信号传导结构域。在某些附加方面，连接肽是Flag肽、myc肽或HA肽。

在另外的方面，本发明涉及一种工程化的γδ T细胞，所述γδT细胞可以表达二价CLTX嵌合抗原受体(或二价CLTX-CAR)和生存因子，其中所述生存因子是赋予对化疗剂抗性的多肽，其中γδT细胞包含指导二价CLTX-CAR和生存因子表达的单个载体，并且其中：

a.所述二价CLTX-CAR包括：

i.包含两个CLTX肽的细胞外抗原结合结构域，其中所述两个CLTX-肽通过连接肽连接；任选地，所述连接肽的长度小于30个氨基酸或长度为15个氨基酸；

ii.跨膜结构域；

iii.一种可选的细胞外铰链结构域，将跨膜结构域连接到细胞外抗原结合结构域；

iv.任选地，细胞内信号传导结构域；和

v.任选地，共刺激结构域。

如这里所述，本发明还包括工程化的γδ T细胞群体。在某些方面，二价CLTX-CAR包括共刺激结构域但不包括细胞内信号传导结构域。在进一步某些方面，二价CLTX-CAR不包含细胞内信号传导结构域并且不包括共刺激结构域。在某些附加方面，连接肽是Flag肽、myc肽或HA肽。

本发明还包括药物组合物，所述药物组合物包括如这里所述的多价CLTX-CARγδT细胞(或者多价CLTX-CARγδT细胞群体)。本发明还包括治疗需要的患者体内肿瘤或者癌症的方法，该方法包括向所述患者给药一种组合物，所述组合物包括如这里所述的多价CLTX-CARγδT细胞并且同时对所述患者共给药治疗有效量的化学治疗剂；例如，治疗有效量是指足够增加肿瘤或者癌症细胞上压力抗原表达的量。这里还包括包含如这里所述的二价CLTX-CARγδT细胞(或者二价CLTX-CARγδT细胞群体)的药物组合物，以及治疗需要的患者所患癌症或者肿瘤的方法，所述方法包括对该患者给药一种组合物，所述组合物包括如这里所述的二价CLTX-CARγδT细胞并且对该患者共给药治疗有效量的化学治疗剂，例如，治疗有效量是指足够增加肿瘤或者癌症细胞上压力抗原表达的量。

在某些方面，生存因子是一种赋予对化学治疗剂耐药性的多肽。赋予对化疗剂耐药性的多肽可以例如选自烷基鸟嘌呤转移酶(AGT)、O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)、P140K-MGMT(本文中也称为MGMTp140k)、L22Y-DHFR、胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶、多药耐药性-1蛋白(MDR1)、5’核苷酸酶II、，二氢叶酸还原酶和胸苷酸合成酶。例如，多肽可以指对任何化学治疗剂的耐药性，例如烷基化剂。在另外的方面，所述多肽赋予对化疗剂的耐药性，所述化疗剂选自由甲氨蝶呤、替莫唑胺、雷替曲塞、S-(4-硝基苄基)-6-硫肌苷、6-苯胍、亚硝脲、替莫司汀、胞苷和喜树碱组成的组。

多价CLTX-CAR或二价CLTX-CAR可以另外表达自杀基因。自杀基因的非限制性实例是胸苷激酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)。

多价CLTX-CAR可包含两个CLTX肽、三个CLTX多肽、四个CLTX肽类、或多于四个CLTX-肽。在某些方面，多价CLTX-CAR包含两种CLTX肽。在另外的方面中，多价CLTX-CAR包含两个CLTX肽、三个CLTX多肽或四个CLTX肽类，并且生存因子是MGMT或MGMTp140k。在进一步的方面中，多价CLTX-CAR包含两个CLTX肽，并且生存因子是MGMT。在某些方面，CLTX-CAR是dCLTX CAR，生存因子是MGMT或MGMTp140k，并且dCLTX CAR不包括细胞内信号结构域。在进一步的方面中，CLTX-CAR是dCLTX CAR，生存因子是MGMT或MGMTp140k，并且dCLTX CAR包括共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)并且不包括细胞内信号传导结构域。在另外的方面中，CLTX-CAR是dCLTX CAR，生存因子是MGMT或MGMTp140k，并且dCLTX CAR不包括细胞内信号传导结构域并且不包括共刺激结构域。

多价CLTX-CAR可包含跨膜结构域，所述跨膜结构体包含CD28跨膜结构区；和/或细胞内信号传导结构域包含CD3ζ(本文中也称为CD3z或CD3ζ信号域；和/或包含选自CD8、CD28和/或CD137的蛋白质的铰链区的铰链结构域。在某些方面，共刺激结构域存在并且包括CD28共刺激结构区和/或4-1BB共刺激结构。多价CLTX-CAR可以另外包含细胞外信号肽；例如，信号肽是选自CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137或其组合的蛋白质的信号肽。示例性的连接肽是c-myc、FLAG和(GSSS)

多价CLTX-CAR或二价CLTX-CAR可包含包含CD28跨膜结构域的跨膜结构；和/或包含选自CD8、CD28和/或CD137的蛋白质的铰链区的铰链结构域。多价或二价CLTX-CAR可以另外包含细胞外信号肽；例如，信号肽是选自CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137或其组合的蛋白质的信号肽。多价或二价CLTX CAR可以包括连接肽；示例性连接肽是c-myc、FLAG、HA和(GSSS)

在某些实施方案中，多价CLTX-CAR不包括或不包含细胞内信号传导结构域。在进一步的方面中，多价CLTX-CAR不包含或包括CD3ζ信号传导结构域。在另外的实施方案中，多价CLTX-CAR包括共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)，并且不包括CD3ζ信号传导。

还特别包含二价CLTX-CAR，其中所述内结构域不包含或包括细胞内信号传导结构域。在进一步的方面中，二价CLTX-CAR的内结构域不包含或包括CD3ζ信号传导结构域。在另外的实施方案中，二价CLTX-CAR确实包含共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)并且不包含CD3ζ信号传导。还包括不包含CD3ζ信号传导且不包含共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)的二价CLTX-CAR。

治疗方法可以例如用于治疗颅内肿瘤。例如，肿瘤可以是神经胶质瘤，如胶质母细胞瘤。在某些方面，多价CLTX-CARγδT细胞或其组合物在颅内给药。肿瘤细胞响应化疗剂而表达的应激抗原可以是例如NKG2DL(NKG2D配体)。NKG2DL的非限制性实例包括但不限于MIC-A、MIC-B、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-3和ULBP-4。多价CLTX-CARγδ T细胞，特别包括二价CLTX-CARγδ与可比较的sCLTX CARγ-ΔT细胞相比对肿瘤细胞具有提高的细胞毒性。在进一步的方面中，多价CLTX-CARγδT细胞，特别是二价CLTX-CARγδ与类似的sCLTX CAR相比，T细胞可以具有增强的持久性γδT细胞。“可比sCLTX CAR”与多价CLTX-CARγδ Τ细胞相同，除了其在抗原识别结构域中包含单个CLTX肽之外，将其与之进行比较的γδ T细胞。包含可比sCLTX CAR的组合物和与之相比较的多价CLTX-CARγδΤ细胞的组合物相同(例如，细胞数量相同；赋形剂相同，给药方式相同等)。

在某些方面，与类似的sCLTX CARγδT细胞或其组合物相比，多价CLTX-CARγδ T细胞或其组合物在化疗剂环境中(生存因子赋予其抗性)对肿瘤细胞具有增强的细胞毒性。在其他方面中，多价CLTX-CARγδT细胞或其组合物与比较的sCLTX CARγδ T细胞或其组合物相比具有增强的活化作用(例如CD69活化作用)。例如，与类似的sCLTX CARγδT细胞或其组合物相比，二价CLTX-CARγδ T细胞或其组合物在化疗剂环境中(生存因子赋予其抗性)对肿瘤细胞具有增强的细胞毒性。在其他方面中，二价CLTX-CARγδT细胞不包括细胞内信号域，或其组合物与类似的sCLTX CARγδ T细胞或其组合物相比具有增强的细胞毒性。在另一方面，二价CLTX-CARγδT细胞包含共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)，并且不包含细胞内信号传导结构域，所述二价CLTX-CARγδT细胞或其组合物，与可比较的sCLTX CARγδT细胞或其组合物相比具有增强的细胞毒性。在依旧另一方面，二价CLTX-CARγδ T细胞包含共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)，并且不包含细胞内信号传导结构域，所述二价CLTX-CARγδT细胞或其组合物，与可比较的sCLTX CARγδ T细胞或其组合物相比具有增强的细胞毒性。

在进一步的方面中，多价CLTX-CARγδT细胞或其组合物与可比较的sCLTX CARγδT细胞或其组合物相比，具有增强的持久性。例如，二价CLTX-CARγδ T细胞或其组合物与可比较的sCLTX CARγδT细胞或其组合物相比具有增强的持久性。在另一方面，二价CLTX-CARγδT细胞不包括细胞内信号结构域，并且与可比较的sCLTX CARγδT细胞或其组合物相比具有增强的持久性。在依旧另一方面，二价CLTX-CARγδT细胞不包括细胞内信号结构域，并且与可比较的、包括细胞内信号结构域的二价sCLTX CARγδ T细胞(例如，CD3z信号结构域)相比具有增强的持久性。在依旧另一方面，二价CLTX-CARγδT细胞包含共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)且不包括细胞内信号结构域，并且与可比较的、包括细胞内信号结构域的二价sCLTX CARγδ T细胞(例如，CD3z信号结构域)相比具有增强的持久性。在其他实施方案中，二价CLTX-CARγδT细胞不包含共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)且不包括细胞内信号结构域，并且与可比较的、包括细胞内信号结构域的二价sCLTX CARγδT细胞(例如，CD3z信号结构域)相比具有增强的持久性。

本发明还包括增强CLTX-CARγδT细胞对正在接受化学治疗剂治疗的患者体内肿瘤细胞的细胞毒性的方法，该方法包括对T细胞进行细胞工程化从而表达至少两种CLTX肽和本文所述的生存因子的γδT细胞，其中多价CLTX-CARγδT细胞(或其组合物)与可比较的sCLTX CARγδT细胞(或其组合物)具有增强的细胞毒性，并且本发明方法进一步包括对受试者的给药γδT细胞。在依旧另一个方面，本发明包括增强CLTX-CARγ-ΔT细胞对正在接受化疗剂治疗的受试者体内肿瘤细胞的活化作用(例如CD69活化)的方法，该方法包括工程化γ-ΔT-细胞以表达至少两种CLTX肽和生存因子，其中多价CLTX-CARγδT细胞(或其组合物)与可比较的sCLTX CARγδ T细胞(或其组合物)相比，显示出增强的活化作用，并且本发明方法进一步包括对受试者给药工程化的T细胞。在某些具体方面，该方法包括对γδT细胞进行工程化使其表达两种CLTX肽(二价CLTX-CAR)和本文所述的生存因子，其中所述二价CLTX-CARγδT细胞(或其组合物)与可比较的sCLTX CARγδT细胞(或其组合物)相比，具有增强的细胞毒性。在某些实施方案中，二价CLTX-CAR不包括细胞内信号传导结构域。在依旧另一方面，二价CLTX-CAR包含共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)且不包括细胞内信号结构域。在其他实施方案中，二价CLTX-CAR不包含共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)且不包括细胞内信号结构域。

本发明还包括增强正在接受化疗剂治疗的受试者中CLTX-CARγδT细胞的持久性的方法，所述方法包括工程化γδT细胞使其表达至少两种CLTX肽和本文所述的生存因子，其中多价CLTX-CARγδT细胞(或其组合物)与可比较的sCLTX CARγδT细胞(或其组合物)相比，具有增强的持久性，并且所述方法进一步包括对受试者给药工程化的γδT细胞。在某些方面，多价CLTX-CARγδT-细胞包括信号传导结构域。在另一方面，多价CLTX-CARγδT-细胞不包括信号传导结构域。在其他方面，多价CLTX-CAR不包括CD3z信号传导结构域。在某些具体的方面，该方法包括对γδT细胞进行工程化使其表达两种CLTX肽(二价CLTX-CAR)和本文所述的生存因子，其中所述二价CLTX-CARγδT细胞(或其组合物)与可比较的sCLTX CARγδT细胞(或其组合物)相比，具有增强的持久性。在某些实施方案中，二价CLTX-CAR不包括细胞内信号传导结构域。在依旧另一方面，二价CLTX-CAR包含共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)且不包括细胞内信号结构域。在其他实施方案中，二价CLTX-CAR不包含共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)且不包括细胞内信号结构域。

本发明还包括编码如本文所述的多价CLTX-CAR或二价CLTX-CAR的核酸或载体。在某些方面，所述核酸或载体进一步编码存活因子。

附图简要说明

图1是一种示意图，显示了在表达MGMT的细胞中的双CLTX-CAR(dCLTX-CAR)。dCLTXCAR的两个CLTX肽通过c-myc(“Myc”)肽接头连接。还显示了铰链区、跨膜区、细胞内共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。

图2是示例性CLTX-CAR构建体的构造图。从左边开始，CLTX-CAR构建体可以任选地包含CD8前导序列(“CD8L”)、由Myc或Flag肽连接的一个或两个CLTX肽(例如，分别为CLTX和“Null”以及CLTX和CLTX)、CD8铰链区(“CD8H”)、CD28跨膜结构域(“CD28tm”)、CD 28共刺激结构域(“CD28co“)、CD3ζ信号结构域(“CD3ζ”或“Z”)或无信号结构域(“noZ”)、P2A肽和MGMT或EGFP。所描述的CLTX-CAR构建体包括以下dCLTX(双CLTX肽)构建体：

a.CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP；

b.CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；

c.CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT；

d.CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMT；

e.CLTX-Flag-CLTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP；

f.CLTX-Flag-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；

g.CLTX-Flag-CLTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT；和

h.CLTX-Flag-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMT。

所描述的CLTX-CAR构建体还包括以下sCLTX(单个CTLX肽)构建体：

a.CLTX-Myc-CD8H-CD28co-Z-EGFP；

b.CLTX-Myc-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；

c.CLTX-Myc-CD8H-CD28co-Z-MGMT；

d.CLTX-Myc-CD8H-CD28co-noZ-MGMT；

e.CLTX-Flag-CD8H-CD28co-Z-EGFP；

f.CLTX-Flag-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；

g.CLTX-Flag-CD8H-CD28co-Z-MGMT；和

h.CLTX-Flag-CD8H-CD28co-noZ-MGMT。

图3显示使用抗Myc单克隆抗体进行细胞表面染色后，进行流式细胞术分析，图3显示dCLTX CAR的CLTX细胞表面定位。还对细胞进行GFP门控，显示dCLTX CAR和标记基因的共表达。

图4是条形图，显示了与表达EGFP的sCLTX CAR Jurkat T细胞(“CTX-EGFP”)相比，表达EGFP(“CMC-EGFP”)和MGMT(“CMC-MGMT”)的dCLTX CARs Jurkat T-细胞显示出增强的CD69活性作用。dCLTX CAR细胞包括两个CTLX肽之间的Flag肽。

图5显示与U251GBM细胞共培养24小时并用抗CD69抗体染色的慢病毒转导的Jurkat T细胞的流式细胞术分析。

图6显示了CLTX-CAR转导的Jurkat细胞的百分比(左：1xCLTX-Myc，右：2xCLTX-Myc)随时间(天)的曲线图。

图7显示了与γδT细胞共培养的GBM细胞照片。左上图仅显示U25-GFP细胞。用1xCLTX-Flag-noZ和2xCLTX-Frag-noZ处理的GBM细胞分别显示在左下角和右下角。

图8显示了与U251-GFP或U87-GFP细胞以不同比例共培养24-48小时然后用膜联蛋白V和7-AAD染色的转染γδT细胞的流式细胞术分析。

图9显示了与U251GBM细胞共培养24小时并用抗CD69抗体染色的CLTX-CAR转导的Jurkat T细胞的流式细胞术分析。显示了对照细胞(NTC)、绿色荧光蛋白对照(GFP)、1xCLTX-Z-GFP(单个CLTX肽、CD3z信号结构域和不带标签的GFP)，1xCLTX-noZ-GFP(单个CLTX-肽、无CD3z信号域和无标签的GFP)，1xCLTX Flag-NoZ(单个CLTX肽、Flag肽和无CD3z信号结构域)、2xCLTX-Flag-Z(两个CLTX肽，一个Flag肽，和一个CD3z信号域)和2xCLTXFlag-NoZ的数据。图9(上图)显示了示意图，所述示意图描绘了具有Flag或Myc肽的1xCLTX构建体和具有连接两个CLTX肽的Flag或Myc肽的2xCLTX构建物。如图所示，用不具有CD3z信号结构域(noZ)的CLTX-CAR构建体转导的Jurkat T细胞在U251共培养时没有显示CD69活化。与未转导的细胞相比，用不带标签的1xCLTX CAR转导的Jurkat T细胞显示出CD69的中度活化。用1xCLTX CAR或具有Flag标签的2xCLTX CARs转导的Jurkat T细胞显示出更大幅度升高的CD69活化。

图10A-10D是CLTX CAR转导的Jurkat细胞的百分比随时间(天)变化的曲线图。图10A显示了1xCTX-Myc-Z-MGMT细胞(一个CLTX肽、Myc肽、CD3z信号结构域和MGMT)和1xCTX-Myc-noZ MGMT细胞的百分比随时间(天)的变化曲线。

图10B显示了2xCTX-Myc-Z-MGMT细胞(两个CLTX肽、Myc肽、CD3z信号结构域和MGMT)和2xCTX-Myc-noZ MGMT细胞的百分比随时间(天)的变化曲线。图10C显示了1xCTX-Flag-Z-MGMT细胞(一个CLTX肽、Flag肽、CD3z信号结构域和MGMT)和1xCTX-Flag-noZ-MGMT细胞(一个CLTX肽，Flag肽，无CD3z信号域和MGTT)的百分比随时间(天)的变化曲线。图10D显示了2xCTX-Flag-Z-MGMT细胞(两个CLTX肽、Flag肽、CD3z信号结构域和MGMT)和2xCTX-Flag-noZ-MGMT细胞(两个CLTX肽，Flag肽，无CD3z信号域和MGTT)的百分比随时间(天)的变化曲线。如图10A-10D所示，不具有信号结构域的细胞比具有CD3z信号结构域细胞具有更大的持久性，并且具有两个CD3z信号传导结构域的CLTX肽(双CLTX)的细胞比仅具有一个CLTX肽的可比细胞显示出更大的持久性。

图11A和11B显示了在第3、6、9、12、15和18天表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为内部报告基因的CLTX-CAR转导的Jurkat细胞的流式细胞术分析。这里显示了对照细胞(NTC)、1xCTX-Flag-Z-EGFP(一种CLTX肽、Flag肽、CD3z信号结构域和EGFP)和1xCTX-Flag-noZ-EGFP(一个CLTX肽，Flag肽，无信号结构域及EGFP)的数据。1xCTX-Flag-noZ-EGFP显示出比1xCTX-Flag-Z-EGFP细胞更大的持久性。具体而言，1xCLTX-Flag-Z-EGFP转导的JurkatT细胞显示，随着时间的推移，在细胞表面表达CLTX-CAR的细胞百分比下降，而EGFP仍然存在于这些细胞中。

图12A和12B显示了图11A和11B所示的流式细胞术分析的1xCLTX CAR转导的Jurkat细胞百分比随时间(天)的变化曲线。图12A显示了1xCTX-Flag-Z-EGFP细胞和单独用GFP转导的细胞(对照)的百分比随时间(天)的变化曲线。图12B是显示1xCTX-Flag-noZ-EGFP和用GFP转导的细胞随时间(天)的变化曲线。

图13示出了对照γδT细胞(γδT细胞NTC)的照片和与GBM细胞以效应物/靶点(E/T)为2:1和E/T为4:1的比例共培养的2xCLTX-CAR-noZ-γδT细胞的照片。最左边的图仅显示U87G-GBM细胞。2xCLTX-CAR-FLAG-noZ-γδT细胞对照T细胞相比显示出更强的与GBM细胞的结合能力。

图14显示了对照细胞(γδT NTC)，与U87-GFP胶质母细胞瘤细胞在E/T为2.1的条件下共培养4小时，然后用7-AAD染色的2xCLTX CAR noZ-γδT细胞(CAR-γδT)的流式细胞计分析。对细胞进行GFP和7-AAD分选。U87GFP-GBM细胞为GFP+，死亡细胞为7-AAD+。最左边的图仅显示U87G-GBM单元。图15显示了与对照组相比，2xCLTX CAR noZ-γδT细胞(没有CAR，甚至没有CD3z信号结构域)对U87胶质母细胞瘤细胞具有增强的细胞毒性。

图15显示了一系列延时电影的静止图像，该延时电影显示了通过2xCLTX CAR noZγδT细胞对U251MG GBM细胞的连续杀伤。图像中的绿色细胞(或者如灰度所示，较亮的细胞)就是肿瘤细胞。红色箭头表示随着时间的推移，γδT细胞结合并杀死不同的肿瘤细胞(参见图像中的T1、T2、T3、T4和T5以及Kill-1、Kill-2、Kill-3、Kill-4和Kill-5)。图像是随时间拍摄的(从左到右，如图像之间的箭头所示)。

图16是示意图，示出了细胞中的3xCLTX CAR和4xCLTXCAR。3xCLTX CAR中的三个CLTX肽与Flag肽和Myc肽连接，如图所示。4xCLTX CAR中的四个CLTX肽与HA、Flag肽和Myc肽连接，如图所示。这里还显示了铰链区、跨膜区、可选的细胞内共刺激结构域和可选的细胞间信号传导结构域。对于3xCLTX CAR构建物，所述构建物包括：

a.CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP；

b.CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；

c.CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT；和

d.CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMT对于4xCLTX-CAR构建物，所述构建物包括：

a.CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP；

b.CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；

c.CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT；和

d.CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMT。

图17A-17C显示了使用抗Myc单克隆抗体对参照细胞(NTC)、3xCLTX-Z-EGFP-Jurkat细胞和4xCLTX-Z-EGFP-Julkat细胞进行细胞表面染色的流式细胞术分析，并且还显示了在与U251GBM细胞共培养24小时并用抗CD69抗体染色后CD69的活化。这些细胞也被GFP门控。图17B和17C显示了未正常呈现在细胞表面上的3xCLTX和4xCLTX CAR(测量GFP+，但未测量Myc)。此外，在与肿瘤细胞共培养后，在3xCLTX或4xCLTX转导的Jurkat细胞中未观察到CD69活化。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。

如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指称，除非上下文另有明确规定。因此，例如，关于“一个细胞”的引用包括多个细胞。在本说明书和随后的权利要求中，除非明显有相反的意思表示，否则提及的若干术语将被定义为具有以下含义。

应该注意的是，比率、浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围形式表示。应该理解的是，为了方便和简洁起见使用这种范围形式，因此，应该以灵活的方式解释，不仅包括明确列举为范围限制的数值，而且还包括在该范围内涵盖的所有单个数值或子范围，就像明确列举了每个数值和子范围一样。举例说明，“约0.1％至约5％”的浓度范围应解释为不仅包括明确列举的约0.1wt％至约5wt％的浓度，而且还包括在指定范围内的各个浓度(例如1％，2％，3％和4％)和子范围(例如0.5％，1.1％，2.2％，3.3％和4.4％)。术语“约”可以包括±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％、或者±10％，或更多修改的数值。另外，“约‘x’到‘y’”的短语包括“约‘x’到约‘y’”。数字、比率、浓度、量、范围和其他数字数据可以被构建并用术语“约”来修饰，除非上下文另有说明。

术语“药物耐受性免疫疗法”或DRI是一种治疗癌症的策略，通过基因工程改造抗癌免疫细胞，优选γδT细胞，以抵抗化疗药物的毒性作用，从而实现化疗和免疫疗法的联合给药。化疗耐药性或获得化疗耐药性是癌症治疗领域中众所周知的现象。这种对化疗剂的耐药性可由影响耐药性基因的某些DNA、RNA或多肽的表达、传递耐药性的基因的表达、赋予对化疗剂耐药性的多肽的表达引起。本文描述的DRI策略使用化学耐受性来赋予免疫细胞耐受性，从而可用于癌症免疫疗法。例如，DRIγδT细胞包括经基因工程改造以表达如本文所述的生存因子的γδT细胞，包括但不限于赋予对化疗剂抗性的DNA、RNA或多肽。对化疗剂具有耐药性的多肽在本文中可称为“存活多肽”)。包含多价CLTX-CAR的DRIγδT细胞可称为多价CLTX-CAR DRIγδT细胞。

术语“生存因子”是指本领域中现在已知或后来发现的任何制剂，其赋予对化疗剂和/或化疗剂治疗方案的耐药性和/或允许包含生存因子的细胞在治疗环境(例如化疗治疗环境)中生存。短语“赋予耐药性”等包括获得对化疗剂的耐药性或对化疗剂耐药性的改善。“生存因子”包括一种试剂，该试剂在化疗剂通过γδT细胞时赋予细胞耐药性。因此，“生存因子”可以是DNA、RNA或者由γδT细胞(例如由耐药性基因编码)表达的多肽，所述生存因子能够赋予对化疗剂的耐药性。如本文所述γδT细胞可以被工程化以表达能够赋予对化疗药物的耐药性的DNA、RNA或多肽，其包括一种载体，这种载体可以表达基因、基因片段、DNA、siRNA或mRNA，该载体能够编码生存因子从而使其对化学治疗剂具有耐受性。在其他方面，生存因子是赋予对化疗剂耐药性的DNA。在进一步的方面中，生存因子是赋予对化疗剂抗性的RNA(例如，RNAi、siRNA、micoRNA或mRNA)。

在某些方面，生存因子是赋予对化疗剂抗性的多肽；例如，当多肽通过γδT细胞表达时赋予化疗剂耐药性，在某些实施方案中，生存因子是MGMT、多药耐药蛋白1(MDR1)或5'核苷酸酶II(NT5C2)。其他生存因子包括，例如，二氢叶酸还原酶(L22Y-DHFR)和胸苷酸合成酶的耐药性变体。在某些方面，生存因子是MGMT。根据治疗环境的性质(即，与本发明公开的细胞组合物组合给予患者的其他治疗方案是什么)，可以使用或表达其他赋予耐药性的多肽。MGMT通过从鸟嘌呤的O6位置去除突变加合物来修复DNA的烷基化损伤。这种突变加合物可由烷基化剂(包括但不限于替莫唑胺)引起。因此，MGMT是一种对烷基化剂如替莫唑胺具有耐药性的多肽。生存因子可以是对化疗剂产生耐药性的多肽，所述化疗剂包括但不限于本文所述的特异性化疗剂。

所谓“给药”是指将本发明的化合物、包括细胞群的生物材料或其组合，或包含任何上述化合物、生物材料(例如细胞群)或其组合的组合物引入人或动物受试者。化合物的一种优选给药途径是静脉注射。另一种优选的给药途径是胃肠外给药。“胃肠外给药”是指与注射相关的给药途径，包括眶内给药、输液、动脉内给药、囊内给药、心内给药、皮内给药、肌内给药、腹膜内给药、肺内给药、椎管内给药、胸骨内给药、鞘内给药、颅内给药、宫内给药、静脉内给药、蛛网膜下腔给药、囊下给药、皮下给药、透皮给药或经气管给药。化合物的其他示例性给药途径可以是腹膜内或胸膜内给药，或通过导管给药至大脑。然而，可以使用任何给药途径，如口服给药、局部给药、皮下给药、腹膜给药、动脉内给药、吸入给药、阴道给药、直肠给药、鼻腔给药、引入脑脊液给药、颅内给药或滴入体腔给药。也可以考虑直接注射到诸如实体瘤的目标组织部位中给药。例如，颅内给药γδT细胞可以用于治疗神经胶质瘤或其他颅内肿瘤。

本文中使用的术语“癌症”应具有其普通含义，作为一种疾病的通用术语，在所述疾病中异常细胞在没有控制的情况下分裂。癌症细胞可以侵入附近的组织，并通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。当正常细胞失去作为一个特定、受控和协调单位的能力时，肿瘤就形成了。一般来说，实体瘤是一种异常的组织块，通常不包含囊肿或液体区域(一些脑肿瘤确实有囊肿和充满液体的中央坏死区域)。一个肿瘤甚至可能有不同的细胞群，有不同的出错过程。实体瘤可以是良性(非癌性)，也可以是恶性(癌性)。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名。实体瘤的例子有肉瘤、腺瘤和淋巴瘤。白血病(血癌)通常不会形成实体瘤。腺瘤是癌症，起源于皮肤或排列或覆盖内脏的组织。胶质瘤是一种发生在支持性(“胶质”)脑组织部分的肿瘤，所述支持性(“胶质”)脑组织称为胶质细胞，有助于保持神经元的位置和功能良好。肉瘤是一种癌症，起源于骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持性组织。白血病是一种癌症，始于骨髓等成血组织，导致大量异常血细胞产生并进入血液。淋巴瘤是起源于免疫系统细胞的癌症。

本发明治疗的癌症包括但不限于急性淋巴细胞白血病，成人期；急性淋巴细胞白血病，儿童期；急性髓系白血病，成人期；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，儿童期；艾滋病相关淋巴瘤；艾滋病相关恶性肿瘤；肛门癌；星形细胞瘤，儿童小脑；星形细胞瘤，儿童脑；肝外胆管癌；膀胱癌；膀胱癌，儿童期；骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；胶质母细胞瘤，儿童期；胶质母细胞瘤，成人期；脑干胶质瘤，儿童期；脑肿瘤，成人期；脑肿瘤，脑干胶质瘤，儿童期；脑肿瘤，小脑星形细胞瘤，儿童期；脑肿瘤，脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童期；脑肿瘤，室管膜瘤，儿童期；脑肿瘤，髓母细胞瘤，儿童期；脑肿瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童期；脑肿瘤，视觉通路和下丘脑胶质瘤，儿童期；脑肿瘤，儿童期(其他)；乳腺癌；乳腺癌和妊娠；乳腺癌，儿童期；乳腺癌，男性；支气管腺瘤/类癌，儿童期：类癌，儿童期；类癌，胃肠道；肾上腺皮质癌；癌，胰岛细胞；原发性不明癌；中枢神经系统淋巴瘤，原发性；小脑星形细胞瘤，儿童期；脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童期；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增生性疾病；腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；儿童结直肠癌；皮肤T细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；室管膜瘤，儿童期；上皮癌，卵巢；食管癌；食管癌，儿童期；尤因肿瘤家族；颅外生殖细胞肿瘤，儿童期；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼内黑色素瘤；眼癌、视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃癌；胃癌，儿童期；胃肠道类癌；生殖细胞瘤，颅外，儿童期；生殖细胞瘤，性腺外；生殖细胞瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；胶质瘤。儿童脑干；胶质瘤。儿童视觉通路与下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌，成人(原发性)；肝细胞(肝)癌，儿童期(原发性)；霍奇金淋巴瘤，成人期；霍奇金淋巴瘤，儿童期；妊娠期霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视觉通路胶质瘤，儿童期；眼内黑色素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤；肾癌；喉癌；喉癌，儿童期；白血病，急性淋巴细胞性，成人期；白血病，急性淋巴细胞性，儿童期；白血病，急性髓细胞性，成人期；白血病，急性髓细胞性，儿童期；白血病，慢性淋巴细胞性；白血病，慢性粒细胞性；白血病，毛细胞；唇、口腔癌；肝癌，成人期(原发性)；肝癌，儿童期(原发性)；肺癌，非小细胞肺癌；肺癌，小细胞；成人急性淋巴细胞白血病；淋巴细胞白血病，儿童急性；慢性淋巴细胞白血病；淋巴瘤，艾滋病相关；淋巴瘤；中枢神经系统(原发性)；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，霍奇金病，成人期；淋巴瘤，霍奇金病；儿童期；淋巴瘤，妊娠期霍奇金病；淋巴瘤，非霍奇金，成人期；淋巴瘤，非霍奇金，儿童期；淋巴瘤，妊娠期非霍奇金淋巴瘤；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症；男性乳腺癌；恶性间皮瘤，成人期；恶性间皮瘤，儿童期；恶性胸腺瘤；髓母细胞瘤，儿童期；黑色素瘤；黑色素瘤，眼内；梅克尔细胞癌；恶性间皮瘤；转移性颈鳞癌伴隐匿原发灶；多发性内分泌肿瘤综合征，儿童期；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿；骨髓增生异常综合征；慢性粒细胞白血病；儿童急性髓系白血病；骨髓瘤，多发性；骨髓增生性疾病，慢性；鼻腔鼻窦癌；鼻咽癌；鼻咽癌，儿童期；神经母细胞瘤；神经纤维瘤；非霍奇金淋巴瘤，成人期；非霍奇金淋巴瘤，儿童期；妊娠期非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；口腔癌，儿童期；口腔和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌，儿童期；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞瘤；卵巢低恶性潜能肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，儿童期，胰腺癌，胰岛细胞；鼻窦鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童期；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和霍奇金淋巴瘤；妊娠与非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；原发性肝癌，成人期；原发性肝癌，儿童期；前列腺癌；直肠癌；肾细胞癌；肾细胞癌，儿童期；肾盂输尿管移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤，儿童期；涎腺癌；涎腺癌，儿童期；肉瘤，尤因氏肿瘤家族；肉瘤，卡波西氏；骨肉瘤/恶性骨纤维组织细胞瘤；肉瘤，横纹肌肉瘤，儿童期；肉瘤，软组织，成人期；肉瘤，软组织，儿童期；塞扎里综合征；皮肤癌；皮肤癌，儿童期；皮肤癌(黑色素瘤)；皮肤癌，默克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤，成人期；软组织肉瘤，儿童期；颈鳞癌伴隐匿性原发性转移；胃癌；胃癌，儿童期；幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童期；皮肤T细胞淋巴瘤；睾丸癌；胸腺瘤，儿童期；胸腺瘤，恶性；甲状腺癌；甲状腺癌，儿童期；肾盂输尿管移行细胞癌；滋养细胞肿瘤，妊娠期；原发部位不明，癌症，儿童期；儿童时期罕见的癌症；输尿管肾盂移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；视觉通路与下丘脑胶质瘤，儿童期；外阴癌；瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症；还有威尔姆斯的肿瘤等等。

肿瘤可分为恶性的或良性的。在这两种情况下，细胞都存在异常的聚集和增殖。在恶性肿瘤的情况下，这些细胞表现得更积极，获得增加的侵袭性。最终，肿瘤细胞甚至可以具有摆脱它们起源的微观环境的能力，扩散到身体的另一个区域(环境非常不同，通常不利于它们的生长)，并在这个新的位置继续快速生长和分裂。这称为转移。一旦恶性细胞转移，实现治愈就更加困难。良性肿瘤具有较少的侵入倾向并且不太可能转移。

如本文所用，术语“融合蛋白”是指嵌合分子，其包含例如抗原识别结构域，例如包含至少两个CLTX肽，以及至少一个异源部分，例如，其在自然界中不与之天然连接的部分。氨基酸序列通常可以存在于融合多肽中结合在一起的单独蛋白质中，或者它们通常可以存在在同一蛋白质中，但在融合多肽中以新的排列放置。融合蛋白可以通过例如化学合成或通过产生和翻译其中肽区以所需关系编码的多核苷酸来产生。本文所述的多价CLTX CAR可以是包含至少两种CLTX肽的融合蛋白。

本文所述的治疗方法包括给药多价CLTX-CARγδT细胞和化学治疗剂以减少癌症或肿瘤。术语“减少癌症”、“抑制癌症”、“限制癌症”、“预防癌症复发”和类似术语在本文中可互换使用，并且指的是肿瘤块的大小或体积的减少、受试者中转移肿瘤数量的减少、癌症细胞的增殖状态(癌症细胞增殖的程度)的降低，预防先前肿瘤的复发或新转移的发展，等等。

本文所述的治疗方法包括给药多价CLTX-CARγδT细胞和化学治疗剂用于减少肿瘤。本文中使用的术语“减少肿瘤”是指肿瘤块的大小或体积的减少、受试者中转移肿瘤的数量的减少、癌症细胞的增殖状态(癌症细胞增殖的程度)的减少等。

本文中使用的术语“化学治疗剂”是指可以与癌症细胞相互作用，从而降低细胞的增殖状态和/或杀死细胞的化合物或其衍生物，例如，通过损害细胞分裂或DNA合成，或通过损伤DNA，有效靶向快速分裂细胞。化疗剂的实施例包括，但不限于，烷基化剂(例如环磷酰胺、异环磷酰胺、替莫唑胺)；代谢拮抗剂(例如，甲氨蝶呤(MTX)、5-氟尿嘧啶或其衍生物)；取代的核苷酸；取代的核苷；DNA去甲基剂(也称为抗代谢剂；例如，阿扎胞苷)；抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素、阿霉素)；植物来源的抗肿瘤药物(例如长春新碱、长春西碱、

本文中使用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指人工T细胞受体、T抗体、单链免疫受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，并包括将人工特异性(例如抗原识别结构域)移植到特定免疫效应细胞上的工程受体，例如，γδT细胞。在一些实施方案中，CAR包括细胞内活化结构域、跨膜结构域和长度可变的细胞外结构域，并且包括抗原识别结构域。同样如本文所述，CAR可能缺乏细胞内信号传导结构域。在多价CLTX CAR中，抗原识别结构域可以包含多于一种CLTX肽，例如两种、三种、四种、五种或多种CLTX肽。在其抗原识别结构域内包含CLTX肽的CAR在本文中称为CLTX-CAR。“多价CLTX-CAR”是指在抗原识别结构域中包含一种以上CLTX肽的CTLX-CAR；例如多于一个的CLTX肽可以通过一个或多个肽连接。这种连接肽在本文中被称为“连接肽”或“连接肽“。连接一对CLTX肽的连接肽可以与抗原识别结构域中连接不同对CLTX的肽相同或不同；例如，在包含三个CLTX肽的多价CLTX-CAR中，连接两个肽(例如第一肽和第二肽)的连接肽可以与连接(例如第二肽和第三肽)的连接肽相同或不同。术语“双CLTX-CAR”或“dCLTX CAR”或“二价CAR”或者“2xCLTX CAR”是指在抗原识别结构域中包含两个CLTX肽的CAR；两个CLTX肽可以通过连接肽连接。“单个CLTX-CAR”或“sCLTX CAR”或“1xCLTX CAR”是指在抗原识别结构域中仅包含一个CLTX肽的CAR。

如本文所用，术语“氯毒素”和“CLTX”或“CTX”可互换使用，并指蝎毒肽氯毒素，其包含36个氨基酸，其具有以下氨基酸序列：MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCL CR(SEQID NO:1)(UniProt Accession#P45639)。在不希望被理论束缚的情况下，CLTX肽结合结构域可以起到增强γδT细胞转运至实体瘤，所述实体瘤包括但不限于胶质瘤、肝癌、卵巢癌和其他表达靶点的肿瘤。CLTX肽还可以增强向黑色素瘤、小细胞肺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、肾脏癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和髓母细胞瘤的转运。

其他CAR设计的特异性可以来源于受体的配体(例如肽)。在某些情况下，抗原识别结构域的间隔可以被修改以减少活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，CAR的细胞内信号传导结构域包括用于其他共刺激信号传导的结构域，例如，但不限于FcR、CD27、CD28、CD 137、DAP 10和/或OX40以及CD3ζ。在一些情况下，分子可以与CAR共表达，所述分子包括共刺激分子、用于成像(例如，用于正电子发射断层扫描)的报告基因、允许表达CAR的宿主细胞在由其他的治疗处理产生的治疗环境中存活的基因产物，在添加前药、归巢受体、趋化因子、趋化细胞因子受体、细胞因子和细胞因子受体时有条件地消融表达CAR的宿主细胞的基因产物。

同样如本文所述，CLTX-CAR可以是不包括细胞内信号传导结构域的CLTX-CAR。

本发明还包括多价CAR，其包含CLTX肽的一种以上功能性变体，其中所述功能性变体可以是相同的或不同的。本发明还包括多价CAR，其包含一种以上的CLTX样肽，其中所述CLTX样多肽可以相同或不同。本发明还包含多价CAR，其包含以下中的至少一种(例如，两种)：CLTX肽、CLTX样多肽和细胞外抗原结合结构域中CLTX肽的功能变体。例如，二价CAR可包含两种CLTX肽，或两种CLTX-样多肽，或CLTX肽的两种功能性变体，或其组合(例如，一种CLTX多肽和一种CLTX-样多肽)。

CLTX肽的“功能性变体”是与氯毒素(CLTX)(例如SEQ ID NO:1)具有实质性或显著序列同一性或相似性的肽，其中所述功能性变体保留氯毒素肽的生物活性。例如，包含CLTX的功能性变体的CAR保留CLTX-CAR的至少一些生物活性；例如，以与亲本CLTX-CAR相似的程度、相同的程度或更高的程度保留识别靶细胞的能力。术语“CLTX的功能性变体”和“CLTX肽的功能性变体”在本文中可互换使用。CLTX肽的功能性变体可以是CLTX肽(例如SEQ ID NO:1)或可以与CLTX肽(例如SEQ ID NO:1)具有至少约65％同源性、至少约80％同源性、约90％同源性、约95％同源性或约99％同源性的氨基酸序列。例如，本文所述的多价CAR可利用细胞外抗原识别结构域内的CLTX的至少一种功能性变体(抗原识别部分可进一步包含CLTX肽、CLTX的另一种功能或CLTX样肽)，其中CLTX的这种功能性变体包含一种序列，所述序列与SEQ ID NO:1具有70％、80％、90％、95％或更高的同源性。

例如，功能性变体可以包括CLTX的氨基酸序列，如本领域普通技术人员所知，可以选择至少一种氨基酸修饰(例如但不限于缺失、插入和取代)来产生所需的CTX-CAR功能性变体。对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的保守修饰(以及对编码核苷酸的相应修饰)将产生具有类似于天然存在的CLTX的功能和化学特征的功能变体。

短语“保守氨基酸取代”或“保守突变”是指一种氨基酸被另一种具有共同性质的氨基酸取代。保守突变的实施例包括相同氨基酸亚群内氨基酸的氨基酸取代，例如，赖氨酸取代精氨酸，反之亦然，从而可以保持正电荷；谷氨酸代替天冬氨酸，反之亦然，从而可以保持负电荷；丝氨酸代替苏氨酸，从而可以保持游离-OH；谷氨酰胺用于天冬酰胺，从而可以保持游离的-NH2。“保守氨基酸取代”可能涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基，从而对该位置的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有影响。此外，多肽中的任何天然残基也可以被丙氨酸取代。保守的氨基酸取代也包括非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成来结合。这些包括肽模拟物和其他反向或倒置形式的氨基酸部分。本领域技术人员将理解，本文所述的核酸和多肽分子可以化学合成以及通过重组手段生产。基于常见的侧链性质，天然存在的残基可分为以下几类：1)疏水性残基：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie；2)中性亲水性残基：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性残基：Asp、Glu；4)碱性残基：His、Lys、Arg；5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和6)芳香族残基：Tip、Tyr、Phe。还考虑了非保守氨基酸取代，特别是当这种非保守氨基酸出现在具有类似活性的相关多肽中时。例如，非保守取代可能涉及一个氨基酸类的成员与另一类的成员的交换。这样的取代残基可以被引入到与相关CLTX多肽直链同源物同源的CLTX或CLTX样肽功能变体的区域中，或者引入到分子的非同源区域中。在做出这样的改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。根据其疏水性和电荷特性，每个氨基酸都被赋予了亲水性指数，这些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能方面的重要性在本领域中是众所周知的(Kyle et a！.,J.Mol.Biol.,157:105-131,1982).已知某些氨基酸可以取代具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸，并且仍然保持相似的生物活性。在基于亲水性指数进行改变时，可以使用亲水性指数在+/-2内的氨基酸的取代；在一个替代实施方案中，亲水指数为+/-1；在另一个替代实施方案中，亲水指数在+/-0.5内。本领域还应当理解，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代。多肽的最大局部平均亲水性由其相邻氨基酸的亲水性决定，与蛋白质的生物学特性相关。氨基酸残基的亲水性值如下：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+/-.1)；谷氨酸(+3.0+/-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5 1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，可以使用亲水性值在+/-2内的氨基酸的取代；在替代实施方案中，亲水性值为+/-1；在另一个替代实施方案中，亲水性值在+/-0.5范围内。

所需的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)可以由本领域技术人员在需要这样的取代时确定。例如，氨基酸取代可用于鉴定CLTX的重要残基，或增加或降低CLTX与特定结合靶标的亲和力，以增加或降低本申请的CLTX-CAR的活性(例如，效应子功能和/或免疫效应子功能)。

在一个实施方案中，CLTX的功能性变体是在对应于位置1、3、10、13、14、17、25和36的位置(参考SEQ ID NO:1的位置)包含一个或多个取代的变体。在这样的实施方案的一个方面中，在所指示的位置处对这样的CLTX功能变体的优选取代包括：位置1处的Met被取代为Arg；位置3处Met被取代为Lys或Ser；位置10处His被取代为Pro或Gln；位置13处的Ala被取代为Ser或Thr；14位Arg被取代为Lys；位置17处的Asp被取代为Ala或Tyr；位置25处Arg被取代为Lys；在位置36处Arg被取代为Ala。在这样的实施方案的某些方面中，CTX的功能性变体包含来自所指示位置的6个或更少的取代、来自所指示的位置的4个或更少个取代或来自所示的位置的2个或更少的取代。

在一个实施方案中，CLTX的功能性变体是在对应于位置9-11、14-15、17-18、25和29的位置上包含一个或多个取代的变体，在位置23和24(参考SEQ ID NO:1的位置)具有或不具有氨基酸缺失。在这样的实施方案的一个方面中，在所指示的位置对这样的CTX功能性变体的优选取代包括：在位置9的Asp被取代为Arg；位置10处的His被取代为Pro或Gln；位置11处的Gln被取代为Asn或者Asp；位置14处Arg被取代为赖氨酸、Gln或Asn；位置15处Lys被取代为Arg或Gln；位置17处Asp被取代为Asn、Ala、Arg或Tyr；位置18处的Asp被取代为Glu或者Ala；位置25处Arg被取代为Tyr、Lys、He、Gly或Asn；位置29处Tyr被取代为Phe；以及位置36处Arg被取代为Asn或Ala。在这样的实施方案的另一个方面中，在所指示的位置对CTX功能性变体的优选取代包括：在位置9的Asp被取代为Arg；在第10位的His被取代为Pro；位置11处的Gln被取代为Asn；位置14处Arg被取代为Lys或Gln；在位置15处的Lys被取代为Gln；位置17位的Asp被取代为Arg；位置18处Asp被取代为Ala；在位置25处的Arg被取代为Asn；位置29处Tyr被取代为Phe；而位置36处的Arg被取代为Asn。在这样的实施方案的某些方面中，CTX的功能性变体包含来自所指示位置的6个或更少的取代、来自所指示的位置的4个或更少个取代或来自所示的位置的2个或更少取代。

在一个实施方案中，CLTX的功能性变体是在对应于位置1、3、9-15、17-18、21、25-26、29-31和36的位置处包含取代的变体，其中在位置23和24(参考SEQ ID NO:1的位置)处具有或不具有氨基酸缺失。在这样的实施方案的一个方面中，在所指示的位置上对这样的CTX功能性变体的优选取代包括：在位置1处的Met被取代为Arg；位置3处Met被取代为赖氨酸、丝氨酸或甘氨酸；位置9处的Asp被取代为Arg；位置10处His被取代为Pro或Gln；位置11处的Gln被取代为Asn或Asp；在位置12处的Met被取代为Tyr；在位置13处Ala被取代为Glu、Ser、Thr或Glu；位置14处Arg被取代为赖氨酸、Gln或Asn；位置15处Lys被取代为Arg或Gln；位置17处Asp被取代为Asn、Ala、Arg或Tyr；位置18处的Asp被取代为Glu或Ala；位置21处的Gly被取代为Arg或Lys；位置25处Arg被取代为Tyr、Lys、Ile、Gly或Asn；位置27处Gly被取代为Lys；位置29处Tyr被取代为Phe；位置30处的Gly被取代为Phe；位置31处的Asp被取代为Gly或Tyr；以及位置36处Arg被取代为Asn或Ala。在这种实施方案的某些方面中，CLTX的功能性变体包含来自所指示位置的12个或更少的取代、来自所指示的位置的10个或更少个取代、来自指示位置的8个或更少取代、来自指定的位置的6个或更少替代，来自所指示位置的4个或更少的取代或来自所指示的位置的2个或更少取代。

在另一个实施方案中，CLTX的功能性变体是具有SEQ ID NO:1的氨基酸2-36序列的多肽。在这样的实施方案的一个方面中，CLTX变体可以具有针对氨基酸1、3、10、13、14、17、25和36所描述的氨基酸取代，针对以上氨基酸9-11、14-15、17-18、25和29所描述的氨酸取代，或者针对以上氨基酸1，3、9-15、17-18、21、25-26、29-31和36所述的氨基酸取代。

另一个实施方案中，CLTX的功能性变体是具有SEQ ID NO:1的氨基酸1-35序列的多肽。在本实施方案的一个方面中，CLTX变体可以具有针对氨基酸1、3、10、13、14、17、25和36所描述的氨基酸取代，针对以上氨基酸9-11、14-15、17-18、25和29所描述的氨酸取代，或者针对以上氨基酸1，3、9-15、17-18,21,25-26,29-31和36所述的氨基酸取代。在另一个实施方案中，CLTX的功能性变体是具有SEQ ID NO:1的氨基酸2-35序列的多肽。在这样的实施方案的一个方面中，CLTX变体可以具有针对氨基酸1、3、10、13、14、17、25和36所描述的氨基酸取代，针对氨基酸9-11、14-15、17-18、25和29所描述的氨基酸取代，或者针对第1、3，9-15，17-18、21、25-26、29-31和36位氨基酸进行的氨基酸取代。

“氯毒素样肽”是一种具有与CLTX类似的一级结构的肽，包括例如WO2018107134中所述的肽，其内容通过引证全部并入本文。这样的肽包括但不限于Bs8(Uniprot编号PI5229)、昆虫毒素-I4(Uniprot编号P60269)、Lqh 8/6(UniProt Acc No.P15220)；昆虫毒素-I3(UniProt Acc No P60268),昆虫毒素-I5A(UniProt Acc No PI 5222),MeuCITx(UniProt Acc No P86401),GaTxl(UniProt Acc No P85066),昆虫毒素-I5(UniProt AccNo P60270),昆虫毒素-Il(UniProt Acc No P15220)；Bml2-b(UniProt Acc No Q9BJW4)；BmK CT(UniProt Acc No Q9UAD0；尤其是氨基酸25-59；通过除去信号肽氨基酸1-24获得)；AaCtx(UniProt Acc No P86436),MeuCITx-1(UniProt Acc No P86402)；Bsl4(UniProtAcc No P59887)；AmmP2(UniProt Acc No P01498)；BtlTx3(UniProt Acc NoΡ81761，特别是氨基酸25-6；通过除去信号肽氨基酸残基1-24获得)和氨基酸25-62；通过除去信号肽氨基酸残基1-24和前肽氨基酸残基62得到。

术语“抗原识别结构域”、“抗原识别部分”、“抗体结合结构域”和“抗原结合部分”等在本文中可互换使用。类似地，术语“跨膜结构域”、“跨膜部分”、“跨膜区”等可互换使用；术语“铰链结构域”、“铰链部分”和“铰链区域”等可互换使用；术语“细胞内信号结构域”、“信号结构域、”信号部分“、”信号区域“等在本文中可互换使用。

在本发明上下文中，短语“治疗有效量”或“有效量”是指当向受试者给药试剂或者组合物时，能够对疾病、障碍或状况的任何症状、方面或特征产生任何可检测的积极影响的量；试剂或组合物可以单独给药或作为药物组合物的一部分给药，并且可以单剂量给药或一系列剂量的一部分给药。治疗有效量或有效量可以通过测量相关的生理作用来确定，并且可以结合给药方案和受试者状况的诊断分析等来调整。关于癌症或与不受调节的细胞分裂有关的病理学，治疗有效量或有效量可指具有以下效果的量：(1)减小肿瘤的大小(即肿瘤消退)，(2)抑制(即，在某种程度上减缓，优选停止)异常细胞分裂，例如癌症细胞分裂，(3)预防或减少癌症细胞的转移，(4)在一定程度上缓解(或优选消除)与病理学相关的一种或多种症状，所述病理学与包括例如癌症的未调节或异常细胞分裂相关或部分由其引起，(5)增加受试者的存活率或预期寿命，和/或(6)降低复发风险。“有效量”也指在给药本发明的治疗活性组合物时产生所需的PD和PK图谱以及所需的免疫细胞图谱的量。“有效量”也指达到所述效果或结果的量；例如，有效量的化疗剂，其单独或与另一种药剂组合时可以是减少肿瘤大小和/或增加肿瘤细胞上应激抗原表达和/或具有细胞毒性作用的量。

本文中使用的术语“治疗”或“治疗”疾病(或病症或病况)是指抑制疾病(减缓或阻止其发展)、缓解疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)、预防或延迟复发以及导致疾病消退。关于癌症，这些术语也意味着癌症患者的预期寿命可能会延长，或者一种或多种疾病症状会减少。关于癌症，“治疗”还包括增强或延长受试者的抗肿瘤反应。

如本文所用，任何形式的“联合”、“联合治疗”和/或“结合治疗方案”或“联合给药”或“共同给药”等的给药是指至少两种治疗活性药物或组合物的给药(例如γδT细胞和化学治疗剂，或其药物组合物)，同时或基本上同时以单独或组合的制剂，或按顺序在相隔分钟、小时、天、周或月的不同时间，但以某种方式共同作用以提供所需的治疗反应，例如，作为同一治疗方案的一部分。

本文中使用的术语“增强”、“增加”或“加强”等是指所提及的反应或结果的增加。例如，“增强细胞毒性”是指增加细胞毒性，“增强活化作用”是指提高活化作用。同样，增强持久性意味着增加的持久性。术语“增强”等还可以包括允许受试者或肿瘤细胞提高其对本文公开的治疗的反应能力。增强的反应可以包括至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更高的反应性(细胞毒性、活化和/或持久性)的增加。增强的反应性可以包括增强的对癌症或肿瘤的细胞毒性和/或增强的T细胞活化和/或提高的持久性。

多价CLTX-CARγδT细胞(或其组合物)，例如二价CLTX-CARγδT细胞(或其组合物)显示或表现出的增强的活化作用和/或增强的细胞毒性，与基于可比sCLTX CAR或其组合物的活化或细胞毒性预测的加成效应相比可以实现大于加成效应的效应或协同效应。如本文所定义，“协同效应”是一种大于加成效应的效应。加性效应被认为是确定协同作用的基线，它是在不存在协同作用的情况下，基于组合理论上预期或预测的效应(Roell et al.(2017),Front.Pharmacol.8(158)；

https://doi.org/10.3389/fphar.2017.00158；其内容通过引证全部并入本文)。例如，当多价CLTX-CARγδT细胞(或其组合物)在细胞外抗原结合结构域中仅包含两种CLTX肽时，对细胞毒性或活化的协同效应或大于加成作用比可比较的sCLTX CAR或其组合物的细胞毒性或活化作用大两倍。在某些实施方案中，dCLTX CAR或其组合物的大于加成作用或协同效应大2倍。在某些特定实施方案中，dCLTX CAR或其组合物的大于加成作用或者协同效应为至少约2.5倍(或至少约2.5倍)、至少约3倍(或约3倍)、至少约3.5倍(或至少将3.5倍)，并且比可比较的sCLTX CAR或其组合物大至少约4.5倍(或至少约4.5倍)。

本文中使用的术语“受试者”和“患者”包括人类、哺乳动物(例如猫、狗、马等)、活细胞和其他活生物体。生物体可以是哺乳动物。典型的患者是哺乳动物，尤其是灵长类动物，尤其是人类。对于兽医应用，各种各样的受试者将是合适的，例如，牲畜，比方说牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；家禽，如鸡、鸭、鹅、火鸡等；以及驯养的动物，尤其是宠物，如狗和猫。对于诊断或研究应用，各种各样的哺乳动物将是合适的对象，包括啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔子、灵长类动物和猪，例如近交系猪等。优选地，系统包括样本和受试者。“活宿主”一词是指上面提到的活的和没有死的宿主或生物体。术语“活宿主”是指整个宿主或生物体，而不仅仅是从活宿主上切除的一部分(如肝脏或其他器官)。在优选的方面中，受试者或患者是人类受试者或者患者。

本文中使用的术语“γδT细胞”或“γΔT细胞”是指在其表面表达不同T细胞受体(TCR)的T细胞亚群。大多数T细胞的TCR由两条糖蛋白链组成，称为α-和β-TCR链。相反，在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链组成。这组T细胞通常比αβT细胞不常见。γδT细胞在T细胞类型中是独特的，因为它们不需要抗原处理和肽表位的MHC呈递。此外，γδT细胞被认为在识别脂质抗原、对应激相关抗原如MIC-a和MIC-B以及NKG2D受体的其他配体具有显著作用。

人类γδT细胞也可以表现出抗原呈递能力。与树突状细胞(DC)类似，血液中的Vγ9Vδ2T细胞能够对来自微生物和肿瘤的信号做出反应，并启动CD4+和CD8+T细胞。γδT-APC被认为直接与CD8+T细胞交叉呈递抗原。与单核细胞衍生的DC相比，γδT细胞的细胞内蛋白质降解和内体酸化显著延迟。抗原通过IRAP(胰岛素调节的氨基肽酶)阳性的早期和晚期内体运输，其处理包括出口到胞质溶胶中，由蛋白酶体降解，然后进口到MHC-I装载室。活化的γδT细胞能够在C/EBPα(CCAAT/增强子结合蛋白α)依赖性机制中通过清除剂受体CD36吞噬肿瘤抗原和凋亡或活癌症细胞，并产生肿瘤抗原特异性CD8+T细胞反应。γδT细胞也可以通过产生TNF-α来诱导DC成熟。总体而言，γδT细胞可以处理多种抗原进行呈递并刺激其他免疫细胞。因此，γδT细胞对感染或癌症的反应可能被用来设计新的策略，以改善基于γδT淋巴细胞的免疫疗法的临床反应。

肿瘤免疫原性增加(例如，NKG2D受体配体的上调节作用增加)，例如，由化疗剂或DDR抑制引起，独特地有利于γδT细胞介导的肿瘤免疫监测，并最终通过γΔT细胞杀死肿瘤细胞。

细胞组合物或细胞群可以富集γδT细胞或工程化的γΔT细胞。如本文所用，术语“富集”是指增加样品中存在的一种或多种细胞毒性免疫细胞类型(例如γδT细胞和/或NK细胞)的总百分比，相对于富集前相同的一种或者多种细胞类型的总百分比。例如，对一种或多种类型的细胞毒性免疫细胞“富集”的样品可以在样品中包含约10％至100％的一种或几种细胞毒性免疫细胞类型，而在富集之前样品中一种或更多种细胞毒性免疫细胞类型的总百分比例如在0％至10％之间。优选地，富集的样品包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的一种或多种类型的细胞毒性免疫细胞。可以使用标准技术，例如流式细胞术技术，对样品进行一种或多种细胞类型的富集。本文中使用的术语“高度富集”是指增加样品中一种或多种细胞毒性免疫细胞类型的总百分比，使得该一种或更多种细胞毒性免疫免疫细胞类型可占样品中细胞毒性免疫电池类型的至少约70％至约100％，例如在0％和10％之间。优选地，高富集样品包含至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多种一种或多种类型的细胞毒性免疫细胞。使用标准技术，例如流式细胞术技术，样品可以高度富集一种或多种细胞类型。

细胞组合物或群体可以包括扩增的γδT细胞群体或工程化的γδT-细胞，或其任何亚群。本文中所用的术语“扩增”是指样品中一种或多种细胞毒性免疫细胞的数量增加，例如增加至少2倍，优选约5倍，优选至少10倍，优选大约至少50倍或更多。细胞毒性免疫细胞群的扩增可以通过本领域已知的任何方法来实现。例如，在饲养淋巴细胞和白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介蛋白-15(IL-15)存在的情况下，可以使用非特异性T细胞受体刺激来快速扩增T细胞，其中IL-2是优选的。非特异性T细胞受体刺激物可包括约30ng/ml的OKT3，这是一种小鼠单克隆抗CD3抗体(可从新泽西州Raritan的

γδT细胞也可以来源于人类诱导多能干细胞(hiPSC)。多能干细胞(例如)可以从患有癌症的患者中分离。在其他方面，多能干细胞可以从癌症患者以外的来源分离。包含γδT细胞的任选富集和/或任选扩增的组合物还可包含自然杀伤(NK)细胞，并任选进一步包含其他免疫活性细胞，包括但不限于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。从被诱导的多能干细胞产生γδT细胞的方法已被描述，例如，在Watanabe et al.2017,Stem Cells TranslMed 7(1):34-44和Zeng et al.(2019),PLoS One 14(5):

e0216815中；其每一个的内容通过引用被明确地并入本文。

本文使用的术语“分离的”和“分离的细胞群”是指从受试者体内发现的组织或状态中去除的一个或多个细胞。术语可以进一步包括已经根据某些参数分离的细胞，所述参数例如但不限于细胞表面标记物、报告标记物例如染料或标记物的参数。

本文所用的术语“表达”是指从基因转录以产生RNA核酸分子，所述RNA核酸分子与基因的两条核酸链之一的至少部分区域是互补的。本文所用的术语“表达”还指从所述RNA核酸分子翻译得到蛋白质、多肽或其部分或片段。

本文使用的术语“载体”是指由单链、双链、环状或超螺旋DNA或RNA组成的多核苷酸。典型的载体可以由以下元素组成，这些元素以适当的距离可操作地连接以允许功能性基因表达；复制起源、启动子、增强子、5'信使核糖核酸前导序列、核糖体结合位点、核酸盒、终止子和多腺苷酸化位点以及选择性标记序列。在特定应用中可以省略这些元件中的一个或多个。载体还可以包含核酸盒，其可以包括用于插入待表达的核酸序列的限制性位点。在功能载体中，核酸盒包含待表达的核酸序列，包括翻译起始和终止位点。构建向量使得特定编码序列(例如本申请的多价CLTX-CAR的编码序列)位于具有适当控制序列的向量中，编码序列相对于控制序列的定位和定向使得编码序列可操作地连接和/或在控制序列的“控制下”转录。编码感兴趣的特定蛋白质的序列的修饰可能是实现这一目的所需要的。例如，在一些情况下，可能需要修改序列，使得它可以以适当的定向可操作地连接到控制序列，或者保持阅读框。控制序列和/或其他调控序列可以在插入载体之前与编码序列连接。或者，编码序列可以直接克隆到表达载体中，该表达载体已经包含对照序列和与对照序列在阅读框中并在对照序列的调控下的适当限制性位点。

本文使用的术语“启动子”是指确定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列。“启动子近端元素”可能是转录起始位点约200个碱基对内的调控序列。

术语“重组细胞”是指具有在自然界中彼此不共价连接的核酸片段的新组合的细胞。可以使用本领域技术人员可获得的广泛的核酸操作技术将核酸片段的新组合引入生物体。重组细胞可以是单个真核细胞、单个原核细胞或哺乳动物细胞。重组细胞可能携带一种基因组外的载体。基因组外核酸载体不插入细胞的基因组。重组细胞可以进一步携带基因组内的载体或其一部分。术语“基因组内”定义了整合在重组细胞基因组中的核酸构建体。

本文使用的术语“重组核酸”和“重组DNA”是指在真核细胞或原核细胞中未天然发现的至少两种核酸序列的组合。核酸序列包括但不限于核酸载体、基因表达调控元素、复制起源、当表达时赋予抗生素抗性的合适基因序列、蛋白质编码序列等。术语“重组多肽”包括通过重组DNA技术产生的多肽，使得其在位置、纯度或结构上与天然存在的多肽不同。通常，这样的重组多肽将以不同于在自然界中正常观察到的量存在于细胞中。

此处使用的术语“可操作地”或“可操作连接的”是指编码和控制序列的构造，以便执行所需功能。因此，可操作地连接到编码序列的控制序列能够影响编码序列的表达。当DNA聚合酶结合启动子序列并将编码序列转录成可翻译成编码蛋白的mRNA时，编码序列可操作地连接到细胞中的转录调控区或在其控制下。控制序列不需要与编码序列连续，只要它们起到指导其表达的作用即可。因此，例如，插入的未翻译但转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，并且启动子序列仍然可以被认为与编码序列“可操作地连接”。

术语“异源”和“外源”涉及核酸序列，如编码序列和控制序列，表示通常与重组构建体的区域或特定染色体位点不相关和/或通常与特定细胞不相关的序列。因此，核酸构建体的“异源”区域是在另一个核酸分子内或连接到另一个分子的核酸的可识别片段，该片段在自然界中没有与另一分子结合。例如，构建体的异源区可以包括编码序列，该编码序列两侧是在自然界中未发现的与该编码序列相关的序列。异源编码序列的另一个例子是在自然界中没有发现编码序列本身的构建体(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，用通常不存在于宿主细胞中的构建体转化的宿主细胞将被认为是异源的。

优选地，启动子将通过添加或缺失序列来修饰，或用替代序列来取代，所述替代序列包括天然序列和合成序列，也可以是合成序列和天然序列的组合的序列。许多真核启动子包含两种类型的识别序列：TATA盒和上游启动子元件。前者位于转录起始位点的上游，参与引导RNA聚合酶在正确的位点启动转录，而后者似乎决定了转录速率，位于TATA盒的上游。增强子元素也可以刺激连接启动子的转录，但许多仅在特定的细胞类型中发挥作用。衍生自病毒的许多增强子/启动子元素，例如SV40、劳斯肉瘤病毒(RSV)和CMV启动子在广泛的细胞类型中具有活性，并被称为“构成性的”或“无处不在的”。插入克隆位点的核酸序列可以具有编码感兴趣多肽的任何开放阅读框，条件是，当编码序列编码感兴趣的多肽时，它应该缺乏能够阻断适当信使核糖核酸分子产生和/或产生异常剪接或异常信使核糖核酸的隐蔽剪接位点。

主要采用的终止区域将是方便的，因为终止区域看起来是相对可互换的。终止区域可以是目标核酸序列所固有的，或者可以衍生自另一来源。

本文使用的术语“靶向治疗”是指靶向免疫系统任何方面的任何治疗分子。

术语“转化”和“转导”都表示将多核苷酸引入一个或多个受体细胞。

本发明提供了一种工程化的γδT细胞，所述T细胞能够表达多价CLTX嵌合抗原受体(CLTX-CAR)并表达生存因子，其中所述生存因子是赋予对化疗剂抗性的DNA、RNA或多肽。本发明还提供了一种工程化的γδT细胞，所述T细胞能够表达多价CLTX嵌合抗原受体(CLTX-CAR)和赋予对化疗剂抗性的多肽的T细胞，其中γδT细胞包含指导CLTX-CAR表达和赋予多肽对化疗剂抗性的单个载体。如上所述，多价CLTX-CAR的抗原结合结构域包含至少两种CLTX肽，其中所述至少两种CLTX肽通过连接肽连接；任选地，所述连接肽的长度为1-30个氨基酸，或者所述连接多肽的长度小于15个氨基酸。在某些方面，多价CLTX-CAR包含两个CLTX肽(或换言之，“仅两个CLTX-肽”)、三个CLTX肽类(或换而言之，“仅有三个CLTX-肽”)或四个CLTX-肽(或换句话说，“仅有四个CLTX肽”)。在这种情况下，“仅两个CLTX肽”等意味着抗原识别结构域不包含多于两个的CLTX肽，而是可以包含额外的氨基酸、肽、连接肽等，只要抗原识别结构中的CLTX多肽的数量是两个即可。这样的CLTX-CAR可以进一步包括细胞外结构域中的其他部分或结构域。本文所述的多价CLTX CAR可进一步包含跨膜结构域、铰链结构域和任选的至少一个细胞内信号传导结构域，以及共刺激结构域。在某些方面，多价CLTX CAR包括跨膜结构域、铰链结构域、至少一个细胞内信号传导结构域以及至少一个共刺激结构域。在进一步的方面中，多价或二价CLTX CAR包括跨膜结构域、铰链结构域，并且不包括细胞内信号传导结构域。根据本发明的多价CLTX-CAR可以具有以下结构：i)包含抗原识别结构域/部分的胞外结构域(本文也称为“胞外结构区”)，所述抗原识别结构区/部分包含至少两种CLTX肽(或以下至少两种：CLTX肽、CLTX肽的功能变体或CLTX样肽)，ii)铰链结构域；iii)跨膜结构域和iii)细胞内信号传导结构域(细胞内信号转导结构域是受体的“内胚层”或功能末端的一部分)。某些多价CLTX CAR可包含以下：i)包含抗原识别结构域/部分的胞外结构域(本文中也称为“胞外域”)，所述抗原识别结构区/部分包含至少两种CLTX肽(或以下至少两种：CLTX肽、CLTX肽的功能性变体或CLTX样肽)，ii)铰链结构域；iii)跨膜结构域和iv)不包括信号结构域的内胚层。此外，本文中的某些二价CLTX CAR可包含i)胞外结构域(本文中也称为“胞外域”)，其包含抗原识别结构域/部分，其中仅包含两种CLTX肽(或以下两种：CLTX肽、CLTX肽的功能变体或CLTX样肽)，ii)铰链结构域；iii)跨膜结构域和iv)不包括信号结构域的内胚层。在进一步的方面中，本文中的某些二价CLTX CAR可包含i)胞外结构域(本文中也称为“胞外域”)，其包含抗原识别结构域/部分，其中仅包含两种CLTX肽(或以下两种：CLTX肽、CLTX肽的功能变体或CLTX样肽)，ii)铰链结构域；iii)跨膜结构域和iv)包括共刺激结构域但不包括信号结构域的内胚层。

在某些实施方案中，由1至30个氨基酸组成的肽接头可以存在于CLTX-CAR中以分离CAR的各种结构域。在其他方面，肽连接体的长度小于15个氨基酸。例如，肽接头可以存在于抗原识别结构域/部分和其他结构域之间，这些结构域可以存在于细胞外结构域中，在抗原识别结构畴/细胞外结构畴和铰链结构域之间、铰链结构域和跨膜结构域之间或跨膜结构畴和细胞内信号传导结构域之间。肽接头可以存在于所有结构域之间或仅存在于结构域/部分的一部分之间。此外，当细胞内信号传导结构域包含一种以上的元素时，连接肽可以存在于内皮结构域中的一些或全部单个元素之间。多价CLTX-CAR中的每个连接肽可以是相同的，也可以是不同的。可以连接两个CLTX肽(或以下至少两个：CLTX肽、CLTX肽的功能变体或CLTX样肽)或位于两个CLTX肽之间的示例性连接肽的长度可以是30个氨基酸或更少、20个氨基酸或更短、或15个氨基酸或更小。这种连接肽的非限制性实例是FLAG、流感病毒血凝素(HA)、c-myc、polyHis；Strep标记物、Strep II标记物、FLAG标记物、谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记物、绿色荧光蛋白(GFP)标记物、血凝素A(HA)标记物、组氨酸(His)标记物、萤光素酶标记物、麦芽糖结合蛋白(MBP)标记物，c-Myc标记物、蛋白A标记物、蛋白G标记物、人血清白蛋白(HSA)或流感病毒血凝素。在某些方面，肽连接体是c-myc(例如，具有EQKLISEEDL(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列)或FLAG(例如，具有DYKDDDDK(SEQ ID NO：3)的氨基酸顺序)。连接肽的另一个例子是(GSSS)n，其中n是从1到10的整数。在另一个实施方案中，连接肽是HA，例如，具有GLFGAIAGFIENG(SEQ ID NO:14)或EGMIDGWYG(SEQ ID NO:15)的氨基序列。

本发明的CLTX-CAR的细胞内信号传导结构域负责激活含有CLTX-CAR的宿主细胞的至少一种正常效应子功能。“效应子功能”是指分化细胞的一种特殊功能。当宿主细胞是免疫效应细胞时，本发明的CLTX-CAR的细胞内信号结构域负责激活至少一种正常免疫效应功能。例如，T细胞的免疫效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括但不限于细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指CLTX-CAR的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能(例如，效应子功能和/或免疫效应器功能)。虽然通常会使用整个细胞内信号结构域，但在许多情况下，没有必要使用整个细胞外信号结构域。在细胞内信号传导结构域的截短部分可以被使用的范围内，这种截短部分可以用来代替完整的信号传导结构区，只要这种截短部分仍然转导效应子功能/免疫效应子功能信号即可。因此，术语“细胞内信号传导结构域”意指包括足以转导效应子功能/免疫效应子功能信号的细胞内信号转导结构域的任何截短部分。细胞内信号结构域的实施例包括但不限于来自T细胞受体的ζ链的信号结构域(CD3ζ；CD247)或其任何同源物(例如，η、Δ、γ或ε)、MB1链、B29、FcRIII、FcRI，以及信号和/或共刺激分子的组合，例如CD3 zeta链和CD28、CD27、4-IBB、DAP-10、OX40及其组合，以及其他类似的分子和片段以及前述的突变，例如修饰基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在某些实施方案中，信号传导结构域包含CD3ζ序列，其可由以下序列表示：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP

QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR(SEQ IDNO:4).可以使用激活蛋白家族的其他成员的细胞内信号部分，例如FcyRIII和FcRI。本领域技术人员将能够确定相应的信号传导域。此外，任何信号传导结构域序列都可以包含1-5个氨基酸修饰，其可以如本文所述进行选择。

在某些方面，内胚层不包括细胞内信号传导结构域。

在某些方面，CLTX-CAR的细胞内信号传导结构域或内结构域包括编码共刺激信号传导结构区的序列。例如，细胞内信号结构域或内结构域可以包括编码初级信号结构域的序列和编码共刺激信号结构域。在某些实施方案中，共刺激结构域是来自41BB、OX40和/或CD28的功能性信号传导结构域。来自OX40的共刺激结构域可以具有以下序列：ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO:5).来自CD28的共刺激结构域可以具有该序列。RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:6).来自4IBB的共刺激结构域可以具有该序列。KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:7).优选地，编码的共刺激信号结构域包含蛋白质的功能信号结构域，所述蛋白质选自以下一种或者多种：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3与CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8ct、CD8fi、IL2Rp、IL2Ry、IL7Ra、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDIId、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl8、LFA-1、ITGAM、CD1 lb、ITGAX、CD1 lc、1TGB I、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RA KL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD 244.2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD 160(BY55)、PSGL1、CD 100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A,Lyl08)、SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46或者NKG2D特异性接合的配体。本领域技术人员能够从这些多肽中确定相应的跨膜区域。此外，任何共刺激结构域序列都可以包含1-5个氨基酸修饰，其可以如本文所述进行选择。在某些实施方案中，所述信号传导结构域包含CD3ζa-CD28-OX40、CD3 zeta-4IBB或CD28-41BB和CD3zeta-CD248-41BB。

包含抗原识别结构域的细胞外结构域可以通过细胞外间隔区(本文也称为细胞外铰链结构域)和/或跨膜结构域与细胞内信号传导结构域连接。细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域可以通过细胞外铰链结构域或细胞外间隔区序列连接。优选地，细胞外间隔区或细胞外铰链结构域序列包含人免疫球蛋白的铰链区和/或免疫球蛋白重链恒定区(其可包含CH1、连接区、CH2和/或CH3结构域)或其任何组合中的一个或多个，所述人免疫球蛋白例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在某些实施方案中，细胞外间隔区或铰链结构域包含人IgD的铰链区的全部或一部分。在某些实施方案中，细胞外间隔物或铰链包含人IgG1的铰链区的全部或一部分。在某些实施方案中，细胞外间隔物或铰链包括人IgD的铰链区的全部或一部分以及人IgGl的铰链区全部或一部分。在某些实施方案中，细胞外间隔物或铰链包含人IgD的铰链区的全部或一部分以及人IgG1的重链恒定区的CH2和CH3结构域的全部或部分。在某些实施方案中，细胞外间隔区或铰链区包含人IgD的铰链区的全部或一部分、人IgG1的铰链区全部或一部分以及人IgG1重链恒定区的CH2和CH3结构域的全部或部分。在某些实施方案中，细胞外间隔区或铰链区包含人IgG1的铰链区的全部或一部分以及人IgG1重链恒定区的CH2和CH3结构域的全部或一部分。在某些实施方案中，细胞外间隔区或铰链区包含人IgD的全部铰链区、人IgG1的全部或一部分铰链区，并且重链恒定区包含人IgG1 CH2和CH3结构域的全部或部分。优选地，所述铰链区氨基酸序列包括来自免疫球蛋白的铰链区氨基酸顺序，所述免疫球蛋白例如来自IgD或IgG1，其中所述氨基酸序列包括1-5个氨基酸修饰，所述氨基酸修饰可如本文所述选择。优选地，重链恒定区的CH2和CH3结构域包含来自免疫球蛋白(例如来自IgG1)的CH2或CH3结构区免疫球蛋白重链恒定区域氨基加成序列，其中所述氨基酸序列包含1-5个氨基酸修饰，其可如本文所述选择。在其他方面，细胞外间隔区或细胞外铰链结构域包含选自CD8a、CD28、CD137或其组合的蛋白质的铰链区。在某些方面，细胞外间隔物或细胞外铰链结构域包括CD8a的铰链区。在任何前述中，细胞外间隔物可进一步包含连接体，例如具有Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:8)或Ser-GlyGly-Gly-Gly(SEQ ID NO：9)序列的连接体，其可存在具有1-10个拷贝，将细胞外间隔体连接到细胞外抗原结合结构域。

在某些实施方案中，抗原识别结构域通过柔性连接体连接到跨膜结构域。柔性连接体可以存在于细胞外间隔物之外或代替本文所述的细胞外空间。在某些实施方案中，细胞外结构域/抗原识别结构域通过柔性连接体连接到细胞外间隔物。优选地，柔性连接体包括例如甘氨酸和丝氨酸。优选地，柔性连接体由具有SEQ ID NO:10(Ser-Gly-Gly-Gly)n或SEQ ID NO:8(SerGly-Gly-Gly)序列的多肽组成，其中n是1-10的整数。优选地，每个柔性连接体是包含约1-25个氨基酸、优选约1-15个氨基酸，优选约1-10个氨基酸、更优选约4-24个氨基酸、更好约5-20个氨基酸、最好约5-15个氨基酸和优选约5-12个氨基酸的多肽。优选地，所述连接体是(Ser-Gly-Gly-Gly)n，其中n为3。

本发明的CLTX-CAR可包含跨膜结构域，所述跨膜结构域与本领域已知的任何分子的跨膜结构域相对应或衍生或获得的。例如，所述跨膜结构域可与CD8分子或CD28分子的跨壁结构域对应。CD8是一种跨膜糖蛋白，作为T细胞受体(TCR)的共受体，主要在细胞毒性T细胞表面表达。最常见的CD8形式是由CD8和CD8β组成的二聚体。CD28在T细胞上表达，并提供T细胞活化所需的共刺激信号。来自CD8多肽的跨膜结构域可以具有序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:11)，特别是SEQ ID NO:13的氨基酸1-21、1-23或1-24)。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的受体。CD28的跨膜结构域可以包括序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:12).优选地，CD8和CD28是人。本发明的CLTX CAR的优选跨膜结构域包括但不限于选自以下的多肽：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDIIa,CD18)、ICOS(CD278)、4-IBB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CDI9、IL2Rβ、1L2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDIId、ITGAE、CD 103、ITGAL、CD1 la、LFA-1、ITGAM、CDllb、ITGAX、CD1 lc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD 160(BY55)、PSGLI、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A,Lyl08)、SLAM(SLAMF1,CD 150,IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD 162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。本领域技术人员将能够从这些多肽中确定相应的跨膜区域。

多价CLTX-CAR可以包含任何一个前述跨膜结构域和任何一个或多个(例如，1、2、3或4)前述细胞内T细胞信号传导结构域的任何组合，以及任何前述铰链结构域和任意前述共刺激结构域。例如，CLTX-CAR可以包含CD28跨膜结构域以及CD28和CD3zeta的细胞内T细胞信号结构域。此外，任何跨膜结构域序列都可以包含1-5个氨基酸修饰，其可以如本文所述进行选择。

本发明的示例性CLTX-CAR可包含抗原识别结构域，其包含至少两种CLTX肽(或以下至少两种：CLTX肽、CLTX肽的功能变体或CLTX样肽)。另一个示例性CLTX CAR包含抗原识别，其包含两个CLTX肽。CLTX-CAR可进一步包含以下中的一种或多种：连接抗原识别结构域和铰链结构域的任选连接体；铰链结构域，其包含CD8a、CD28或CD137的铰链区的全部或一部分；优选CD8a的铰链区；来自CD28的跨膜区；和/或任选的包含至少一个信号传导结构域的细胞内信号传导区(或内结构域)；优选CD3zeta，和本文所述的任选的共刺激信号传导结构域；优选CD28和/或4-1BB共刺激结构域。在进一步的方面中，多价CLTX-CAR可以包含细胞外信号肽。例如，信号肽可以是选自CD8a、CD28、GM-CSF、CD4、CD137或其组合的蛋白质的信号肽。在某些方面，CLTX-CAR在抗原结合结构域中仅包含两个CLTX肽或仅包含三个CLTX多肽。

在某些方面，多价CLTX-CAR(例如，二价CLTX-CAR)不包含或包括细胞内信号传导结构域。这种多价CLTX-CAR可包含胞外结构域(本文中也称为“胞外域”)，其包含抗原识别结构域/部分，所述抗原识别结构区/部分包含至少两种CLTX肽(或以下至少两种：CLTX肽、CLTX肽的功能性变体或CLTX样肽)。在某些方面，细胞外结构域包含两种CLTX肽。在依旧进一步的非限制性实施例中，多价CLTX-CAR可进一步包含铰链结构域和跨膜结构域。在另外的实施方案中，多价CLTX-CAR不包含或包括CD3ζ(本文中也称为CD3z或CD3ζ)信号传导域。在不希望受理论约束的情况下，CLTX-CARγδ-Τ细胞中不存在信号结构域可以减轻激活诱导的细胞死亡(AICD)，这增加了CLTX-CARγδ-Τ细胞的持久性，从而延长其作用。不包括或不包含细胞内信号传导结构域的多价CLTX-CAR可以包括或可以不包括共刺激结构域。在不希望被理论束缚的情况下，共刺激结构域(例如，CD28共刺激结构区)可以充当细胞内锚定物，以稳定细胞膜内的构建体和/或增强或延长细胞表面表达。

本发明还包括核酸或载体，所述核酸或载体包含本文所述的多价CLTX-CAR或二价CTLX-CAR。核酸或载体可以包括：

i.细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含至少两种CLTX肽并且其中所述至少两个CLTX肽通过连接肽连接；任选地，所述连接肽的长度为30个氨基酸或更少，或者其中所述连接多肽的长度小于15个氨基酸；

ii.跨膜结构域

iii.将所述跨膜结构域连接到所述细胞外抗原结合结构域的细胞外铰链结构域；

iv.任选的，细胞内信号传导结构域；和

v.任选的，共刺激结构域。

在某些方面，核酸或载体进一步编码DNA、RNA或多肽，所述DNA、RNA或多肽赋予对本文所述的化疗剂的耐药性。在另外的方面中，核酸或载体编码多肽，所述多肽赋予对化疗剂耐药性。在进一步的方面中，核酸或载体编码多价CLTX-CAR和多肽之间的自裂解肽。自裂解肽的实施例包括，例如，猪捷申病毒属-12A(P2A)序列、阿西尼亚病毒2A(T2A)、马鼻炎A病毒2A(E2A)、细胞质多角体病毒(BmCPV 2A)和家蚕的扁平病毒(Bm IFV 2A)。在某些方面，核酸或载体编码多价CLTX-CAR和存活多肽如MGMT之间的P2A序列。

特异性多价CLTX CAR包括，例如，包括两个由连接体肽分开的CLTX肽的抗原结合结构域、CD8a铰链结构域、CD28共刺激结构域、CD3ζ信号传导域和MGMT。在依旧进一步的实施方案中，多价CLTX CAR包括例如抗原结合结构域，其包含由连接肽分离的两个CLTX肽、CD8a铰链结构域、CD28共刺激结构域、无信号结构域和MGMT。特异性多价CLTX CAR包括例如抗原结合结构域、CD8a铰链结构域、CD28共刺激结构域、CD3ζ信号传导域和MGMT。在依旧进一步的实施方案中，多价CLTX CAR包括例如抗原结合结构域，其包含由c-myc或Flag肽分离的两个CLTX肽、CD8a铰链结构域、CD28共刺激结构域、无信号结构域和MGMT。细胞外c-myc或Flag肽或其他蛋白质标记物可用于CAR-T检测和/或富集。

根据本发明的多价CLTX-CAR可以通过本领域已知的任何方式生产，尽管优选使用重组DNA技术生产。编码多价CLTX-CAR的几个区域的核酸序列可以通过分子克隆的标准技术(基因组文库筛选、PCR、引物辅助连接、定点诱变等)制备并组装成完整的编码序列。优选将得到的编码区插入表达载体中，并用于转化合适的表达宿主细胞系，例如免疫效应细胞，优选T淋巴细胞细胞系，最优选γδT细胞(γδ-T细胞)和分化为这些细胞的干细胞。优选使用γδ-T细胞作为宿主细胞系。如本文所用，“核酸构建体”或“核酸序列”是指核酸分子，如DNA分子，其可以转化或引入表达宿主细胞系，如但不限于T细胞，并被表达以产生产物(如嵌合受体)。因此，本发明进一步提供了编码本发明多价CLTX CAR的分离或纯化的核酸序列。“核酸序列”旨在涵盖DNA或RNA的聚合物，即多核苷酸，其可以是单链或双链的，并且可以包含非天然或改变的核苷酸。本文中使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)。这些术语指的是分子的一级结构，因此包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。同样的，该术语包括由核苷酸类似物和修饰的多核苷酸制成的RNA或DNA的类似物，例如，但不限于甲基化和/或封端的多核苷酸。在本发明中使用的核酸构建体中，启动子与编码本发明的CLTX-CAR的核酸序列可操作地连接，即，它们被定位以促进信使RNA从编码嵌合受体的DNA的转录。启动子可以是基因组来源的或合成产生的。用于T细胞的各种启动子在本领域中是众所周知的。启动子可以是组成型或诱导型的，其中诱导与特定的细胞类型或特定的成熟水平有关。或者，许多众所周知的病毒启动子也是合适的。感兴趣的启动子包括β-肌动蛋白启动子、SV40早期和晚期启动子、免疫球蛋白启动子、人巨细胞病毒启动子、逆转录病毒启动子和Friend脾脏焦点形成病毒启动子。启动子可以与增强子缔合，也可以不与增强子关联，其中增强子可以与不同的促进剂关联的特定启动子自然缔合。

本发明还涉及一种工程化的γδT细胞，其表达单个CLTX嵌合抗原受体(或sCLTXCAR或1xCLTX CAR)和生存因子的T细胞，其中所述生存因子是赋予对化疗剂抗性的多肽，其中γδT细胞包含指导所述单个CLTX-CAR和所述生存因子的表达的单个载体，并且进一步其中：

a.CLTX-CAR包括：

i.细胞外抗原接合结构域，其包括一个CLTX肽，

ii.细胞外连接肽，其中所述连接肽的长度小于30个氨基酸，或长度为15个氨基酸，其中所说连接肽位于CTLX肽和跨膜结构域之间或位于CLTX肽和细胞外铰链结构域之间；

iii.跨膜结构域；

iv.任选的细胞外铰链结构域，其将跨膜结构域连接到细胞外抗原结合结构域；

v.任选的，细胞内信号传导结构域；和

vi.任选的，共刺激结构域。

本发明还包括本文所述的工程化的γδT细胞群体。在某些方面，存在细胞内信号传导结构域。在另外的方面，连接肽直接或间接连接CTLX肽与跨膜结构域。在进一步的方面中，连接肽直接或间接连接CLTX肽和细胞外铰链结构域。在进一步的方面中，连接肽的长度为15个氨基酸。在某些方面，连接肽是Flag肽、myc肽或HA肽。在某些实施方案中，单个CLTX-CAR包含信号结构域，并且与没有连接肽的其它相同的单个CLTX-CAR相比，连接肽具有增强的活化作用。本发明还包括药物组合物，所述药物组合物包含表达单一CLTX-CAR的γδ-T细胞，此外，本发明还包括如本文所述的治疗癌症或肿瘤的方法。

本发明还包括工程化的T细胞，所述γδ-T细胞表达单个CLTX嵌合抗原受体(或sCLTX CAR或1xCLTX CAR)和生存因子，其中所述生存因子是赋予对化疗剂抗性的多肽，其中γδ-T细胞包含指导所述单个CLTX-CAR和所述生存因子的表达的单个载体，并且进一步其中：

a.CLTX-CAR包括：

i.细胞外抗原接合结构域，其包括一个CLTX肽，

ii.跨膜结构域；

iii.任选的细胞外铰链结构域，所述铰链结构域将跨膜结构域附着在细胞外抗原接合结构域上；

iv.任选的，共刺激结构域；

其中所述单个CLTX-CAR不包括细胞内信号传导结构域。本发明还包括本文所述的工程化的γδ-T细胞。本发明还包括单一CTLX-CAR，其包含共刺激结构域(例如CD28共刺激结构区)且不包含细胞内信号传导结构域。本发明还包括药物组合物，其包含表达单一CLTX-CAR的γδ-T细胞，另外，本发明还包括如本文所述的治疗癌症或肿瘤的方法。

制备本发明的CLTX-CAR(例如多价CTLX CAR、二价CLTX-CARs或sCLTX-CARs)的各种操作可以在体外进行，并且可以使用标准转化或转染方法将CLTX-CAR嵌合构建体引入载体中用于在合适的宿主细胞中克隆和表达。因此，在每次操作之后，从DNA序列的连接得到的构建体被克隆，载体被分离，并且序列被筛选以确保序列编码所需的嵌合受体。该序列可以通过限制性分析、测序等进行筛选。因此，本发明包括编码本文所述的多价CLTX-CAR或其功能等价物的载体。

如本领域技术人员所熟知的，可以很方便的使用各种方法从受试者体内分离和扩增这些细胞。例如，使用细胞表面标记表达或使用市售试剂盒。可以设想，嵌合构建体可以作为裸DNA或被包含在合适的载体中被引入受试者自身的T细胞中。使用裸DNA通过电穿孔稳定转染T细胞的方法是本领域已知的。裸DNA通常是指以合适的表达方向包含在质粒表达载体中的编码本发明嵌合受体的DNA。有利地，裸DNA的使用减少了产生表达本发明嵌合受体的T细胞所需的时间。

因此，本发明包含一种宿主细胞，所述宿主细胞含有(即用其转化或转导)编码本发明的多价CTX-CAR、二价CLTX-CAR和sCLTX-CAR的载体及其功能变体。优选宿主细胞是免疫效应细胞，优选T细胞，T淋巴细胞细胞系，最优选自体T淋巴细胞细胞系，第三方衍生的T细胞系/克隆株，转化的体液或异种免疫效应细胞系，用于表达CLTX-CAR。自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、记忆性T细胞、调节因子}-T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、gamma delta T-细胞(γδ-Τ细胞)以及可以分化为这些细胞的干细胞，优选的，使用γδ-Τ细胞作为宿主细胞系。一旦确定转染或转导的T细胞能够以期望的调节和期望的水平将嵌合受体表达为表面膜蛋白，就可以确定嵌合受体在宿主细胞中是否具有提供期望的信号诱导的功能。随后，将转导的T细胞重新引入或对受试者给药，以激活受试者的抗肿瘤反应。

在一个实施方案中，本发明包括宿主细胞，例如，γδ-Τ细胞，其包含(即，用其转化或转导)一种载体，所述载体编码(即，指导表达)这里所公开的多价CLTX-CAR、二价CLTX-CAR或sCLTX-CAR和生存因子，所述生存因子例如对本文公开的化疗剂具有抗性的多肽。可以使用本发明公开的任何CLTX-CAR。这个γδ-Τ细胞可以自然表达应激诱导抗原的受体(例如但不限于NKG2D)；优选地，通过施用化学治疗剂来增加应激诱导抗原(应激诱导抗原受体与之结合)的表达。例如，γδ-Τ细胞可以自然表达NKG2D，并且因此可以用于包括施用化学治疗剂的治疗方法中，其中施用所述化学治疗剂增加肿瘤或癌症细胞上的NKG2DL表达。在依旧其他方面，γδ-Τ细胞可包含一种载体(编码CLTX-CAR的相同载体或不同载体)，所述载体编码(即，指导表达)应激诱导的抗原受体(例如但不限于NKG2D)。

如上所述，γδ-Τ细胞表达CLTX CAR，例如多价CLTX-CAR，并且进一步表达生存因子和/或已经用生存因子处理，其中所述生存因子是赋予对化疗剂的抗性的DNA、RNA或多肽。在某些方面，细胞表达生存因子，并且所述生存因子是一种多肽，所述多肽能够赋予(γδ-Τ细胞)对化疗剂的耐药性，从而使γδ-Τ细胞在由化疗剂产生的治疗环境中存活和/或允许γδ-T细胞在包含化疗剂的肿瘤环境中存活。在优选的方面，单个载体编码多价CLTX-CAR和能够赋予对化疗剂耐药性的多肽。在某些特定实施方案中，单个载体编码多价CLTX-CAR和生存多肽，所述生存多肽选自烷基鸟嘌呤转移酶(AGT)、P140K-MGMT、O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)、L22Y-DHFR、胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶、多药耐药-1蛋白(MDR1)，和胸苷酸合成酶。在另外的方面中，单个载体编码多价CLTX-CAR和MGMT。在进一步的方面中，所述单个载体编码多价CLTX-CAR和MGMT，其中所述多价CLTX-CAR在抗原识别结构域中包含两个CLTX肽。在某些实施方案中，宿主细胞是分离或纯化的γδ-T细胞，其中包含一种载体，该载体指导多价CLTX-CAR和生存因子(以及任选的应激诱导的抗原受体)的表达。如本文所述，宿主细胞可以被工程化以表达存活多肽，该存活多肽允许宿主细胞，例如γδ-T细胞，在化学治疗剂造成的治疗环境中存活。这种表达存活多肽的细胞在本文中称为耐药性(DR)细胞，并且它们在治疗中的用途在本文中被称为“耐药性免疫疗法”(DRI)。在WO2011/053750中描述了DR细胞和DRI，其教导通过引用全部并入到本申请中。存活多肽可以是本领域已知的任何多肽，其提供对包含化疗剂的治疗方案的抗性，和/或允许包含存活多肽和本文所述的多价CLTX-CAR的细胞在由化疗剂产生的治疗环境中存活。

示例性的化疗剂是核苷类似物化疗药物、烷化剂、抗代谢剂、抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、分化剂或激素治疗剂，并且生存因子提供对化疗剂的耐药性。在另外的方面，化学治疗剂是烷基化剂。在某些实施方案中，存活多肽是MGMT、多药耐药蛋白1(MDRI)或5'核苷酸酶II(NT5C2)。在进一步的方面中，存活多肽是MGMT，并且化疗剂是烷化剂，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司丁(CCNU)和替莫唑胺。在某些方面，化疗剂是替莫唑胺(TMZ)。在另外的方面，存活多肽是MDR1，化疗剂是蒽环类、长春花生物碱、表鬼臼毒素、喜树碱、甲氨蝶呤(MTX)、沙奎那韦和米托蒽醌(MX)(Sodani et all.(2011).Multidrugresistance associated proteins in multidrug resistance.Chin J Cancer 31(2):58-72)。NT5C2是本领域已知的对硫嘌呤化疗提供耐药性的多肽(Tzoneva等人(2013)，NT5C2核苷酸酶基因的激活突变驱动复发性ALL的化疗耐药性，Nat Med.19(3):368-371)。其他存活多肽包括，例如，二氢叶酸还原酶(L22Y-DHFR)和胸苷酸合成酶的耐药性变体。在某些方面，存活多肽是MGMT。然而，根据共同给药的化疗剂、治疗环境的性质(即，与本发明公开的细胞组合物组合给药患者的其他治疗方案)，可以使用其他生存因子。

在另外的方面中，化学治疗剂是烷基化剂；代谢拮抗剂；DNA去甲基化剂；取代的核苷酸；取代的核苷；抗肿瘤抗生素；植物来源的抗肿瘤剂或亚硝基脲。优选地，所述化学治疗剂选自顺铂；卡铂；依托泊苷；甲氨蝶呤(MTX)；甲氨蝶呤(TMTX)；替莫唑胺；达卡巴嗪(DTIC)，雷替曲塞；S-(4-硝基苄基)-6-硫代肌苷(NBMPR)；6-苯胍(6-BG)；亚硝脲(阿拉伯糖基-N-甲基-N-亚硝基脲(Aranose)、卡莫司汀(BCNU、BiCNU)、氯佐菌素、乙基亚硝脲(ENU)；福莫司汀、洛莫司汀(CCNU)、尼莫司汀、1-亚硝基-1-甲基脲(NMU)、雷莫司汀(MCNU)、司莫司汀和链脲菌素(Streptozotocin)；阿糖胞苷；和喜树碱；或其任何一种的治疗衍生物。优选地，γδ-T细胞已被基因修饰以编码烷基鸟嘌呤转移酶(AGT)、P140KMGMT、O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)、L22Y-DHFR、胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶或多药耐药-1蛋白(MDR1)。优选地，γδ-T细胞已被遗传修饰以对至少两种化疗剂具有抗性，所述化疗剂选自：烷基化剂；代谢拮抗剂；DNA去甲基化剂；取代的核苷酸；取代的核苷；抗肿瘤抗生素；一种植物来源的抗肿瘤剂和亚硝基脲。优选地，γδ-T细胞经过基因修饰，对选自以下的至少两种滑雪治疗剂具有耐药性：顺铂；卡铂；依托泊苷；甲氨蝶呤(MTX)；甲氨蝶呤(TMTX)；替莫唑胺；达卡巴嗪(DTIC)，雷替曲塞；S-(4-硝基苄基)-6-硫代肌苷(NBMPR)；6-苯胍(6-BG)；亚硝脲(阿拉伯糖基-N-甲基-N-亚硝基脲(Aranose)、卡莫司汀(BCNU、BiCNU)、氯佐菌素、乙基亚硝脲(ENU)；福莫司汀、洛莫司汀(CCNU)、尼莫司汀、1-亚硝基-1-甲基脲(NMU)、雷莫司汀(MCNU)、司莫司汀和链脲菌素(Streptozotocin)；阿糖胞苷；和喜树碱；或其任何一种的治疗衍生物。优选地，化疗剂是TMZ、甲氨蝶呤、DTIC、BCNU、CCNU、MCNU、NMU或ENU。

生存因子，包括例如赋予对化学治疗剂(例如给药受试者的化疗剂)的抗性的多肽，可以促进表达它的宿主细胞在由化疗剂产生的治疗环境中的生存，或当宿主细胞在环境或肿瘤微环境中存在毒性时在化疗剂存在下存活，所述毒性是作为治疗的一部分施用化疗剂引起的。用于DRI的化学治疗剂(以及表达对化疗剂产生耐药性的多肽的γδT细胞)包括但不限于：烷基化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑)；代谢拮抗剂(例如，甲氨蝶呤(MTX)、5-氟尿嘧啶或其衍生物)；DNA脱甲基剂(也称为抗代谢剂；例如，阿扎胞苷)；取代的核苷酸；取代的核苷；抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素、阿霉素)；植物来源的抗肿瘤药物(例如长春新碱、长春西碱、

本文所述的工程化γδ-T细胞可以进一步表达自杀基因。本文所用的“自杀基因”是指一种机制，通过该机制，本文所述的表达CLTX-CAR的细胞可以从施用细胞或其组合物的受试者中被根除，例如，以防止级联炎症反应或脱靶细胞毒性。自杀基因系统可以是(例如)单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/甘西洛韦(GCV)自杀基因系统、诱导型半胱氨酸蛋白酶自杀基因系统(Budde等人，PLoS One 2013 8(12):82742)、密码子优化的CD20(Marin等人，Hum.gene Ther.Meth.2012 23(6)376-86)、CD34、截短的EGFR(Wang X，Chang W-C，Wong CW等人。一种转基因编码的细胞表面多肽，用于工程细胞的选择、体内跟踪和消融。Blood,2011年；118(5):1255-1263.doi:10.1182/blood-2011-02-337360)、截短的CD19或多肽RQR8(Philip等人和WO2013153391A，其通过引用并入本文)。自杀基因的另一个例子是τ-逆转录病毒SFG.i级联9.2A.DeltaCD19，它由通过2A样序列连接到作为选择性标记的截短的人CD19的iC9组成。AP1903诱导的级联9自杀基因的激活是通过表达嵌合蛋白(iC9)实现的，该嵌合蛋白与来源于人FK506结合蛋白(FKBP)的药物结合结构域融合。iC9在细胞内静止，直到暴露于API 903，其交叉连接FKBP结构域，启动iCasp9信号传导，并诱导基因修饰细胞的凋亡。该基因和API 903可从Bellicum Pharmaceuticals(休斯顿，德克萨斯州)获得。

通过引入一种核酸构建物来生产能够表达本发明的CLTX-CAR或多价CLTX-CAR的DRγδ-T细胞，其中，所述核酸构建物能够编码或者能够表达这里所述的CLTX-CAR，并且，任选的，DRγδ-T细胞可以进一步表达能够赋予对某种多肽耐药性的DNA、RNA或者多肽，或者任选的其他元素(例如自杀基因和/或应激诱导抗原的受体)。在某些实施方案中，单个核酸构建体编码多价CLTX-CAR和赋予对化疗剂的抗性的多肽，以及附加的任选元素(例如自杀基因和/或应激诱导抗原的受体)。在某些实施方案中，分离的核酸构建物分别编码多价CLTX-CAR和赋予对化疗剂抗性的多肽，以及任选的其他元素(例如自杀基因和/或应激诱导抗原的受体)。在某些实施方案中，单个核酸构建物编码多价CLTX-CAR和能够赋予对化疗剂抗性的多肽，一个或多个核酸构建物则编码其他的任选元素(例如自杀基因和/或应激诱导抗原的受体)。

表达CLTX-CAR(例如多价CLTX-CAR)的γδ-T细胞，可以进一步表达应激诱导抗原的受体。在某些方面γδ-T细胞自然表达应激诱导的抗原，例如NKGD2。在其他方面γδ-T细胞被改造以表达应激诱导的抗原。在某些实施方案中，表达本发明的CLTX-CAR或多价CTX-CAR的宿主细胞进一步包含编码应激诱导的抗原受体的基因，例如NKGD2。在某些实施方案中，应激诱导的抗原受体(包括但不限于NKGD2受体)在γδ-T细胞上已增加的水平被诱导。

宿主细胞，例如表达CTLX-CAR或多价CLTX-CAR的γδ-T细胞，例如，表达多价CTLX-CAR和能够赋予对化学治疗剂耐受性的DNA、RNA或者多肽的γδ-T细胞，被作为组合物的一部分被给药。该组合物可以包括工程化的γδ-τ细胞和额外的免疫系统细胞。例如，所述组合物可包含表达本文所述多价CLTX-CAR的γδ-T细胞，并且可进一步包含NK细胞和/或αβ-T细胞。在某些方面中，所述组合物包含表达本文所述多价CLTX-CAR的工程化γδT细胞和额外的免疫系统细胞，其中，例如，通过流式细胞术测定，所述γδ-T细胞以大于或等于总细胞群的50％、60％或70％的量存在。在进一步的方面中，γδT细胞以大于或等于总活细胞群的50％、60％或70％的量存在，例如，通过流式细胞术测定。在某些实施方案中，所述组合物包含工程化的γδ-T细胞和NK细胞，其中所述γδ-T细胞以大于或等于总细胞群或总活细胞群的50％、60％或70％的量存在，并且所述NK细胞以小于或等于25％存在(例如，通过流式细胞术测定)。在某些实施方案中，所述组合物包含工程化的γδ-T细胞和αβ-T细胞，其中，例如，通过流式细胞术测定，所述γδ-T细胞以大于或等于总细胞群或总活细胞群的50％、60％或70％存在。在另外的方面，所述组合物包含小于或等于总细胞群或总活细胞群的5％的αβ-T细胞，例如，通过流式细胞术测定。在某些实施方案中，所述组合物包含工程化的γδ-T细胞、αβ-T细胞和NK细胞，其中γδ-T细胞以大于或等于总细胞群或总活细胞群的50％、60％或70％的量存在，例如通过流式细胞术测定。在某些实施方案中，如通过流式细胞术测定的，αβ-T细胞以小于或等于总细胞群或总活细胞群的5％的比例存在，并且NK细胞以小于或者等于总细胞群体或者总活细胞群体的25％的比例存在。

优选地，用于给药于患者的治疗组合物包含任选富集和/或任选扩增的γδ-T细胞群，其包含约5x10

Lamb L.S.在美国专利第7078034号中描述了分离γδT-细胞的方法，或者从被治疗的患者体内分离，或者从其他来源分离，其全部内容通过引用并入本文。

如上所述，使用生存因子，包括例如赋予对化疗剂抗性的多肽(例如MGMT多肽)，使得组合物能够包含本发明公开的工程化的γδT细胞(包括DRγδT细胞)在肿瘤受到应激时在由化疗剂产生的治疗环境中生存。在某些实施方案中，对肿瘤的应激作用(例如，通过化疗剂)增加了应激抗原的表达，其被γδ-T细胞上的受体(例如NKG2D受体)识别。化疗诱导应激抗原并减少调节性T细胞的双重作用比任何一种单独的方案都显著提高了肿瘤的减少。如本文所述的基因修饰(表达存活多肽)和/或如本发明所述的用存活因子治疗能够使本申请的组合物免受化疗方案(例如TMZ)的淋巴消耗作用，并且允许本发明的细胞组合物通过TAA进入肿瘤，在恶性细胞受到化疗的最大压力时与未受损的T细胞细胞毒性功能联合。根据本发明，DRI与CLTX-CAR或多价CLTX-CAR联合使用在本文中被称为“DRI-CLTX-CR”疗法，与单独化疗(例如TMZ)治疗或γδ-T细胞灌注相比，被认为显著延长生存期并减少肿瘤负担和复发时间，例如，并且这样做没有显著的不良系统或神经后果。

本文所述的组合物可以作为药物组合物递送，或配合合适的载体或稀释剂制成适合于体内给药的植入物，其还可以是药学上可接受的。制造这种组合物或植入物的方法已经在本领域中进行了描述。本文所述的γδ-T细胞可按其各自合适的给药途径的常用方式配制成半固体或液体形式的制剂，如胶囊、溶液、注射液、吸入剂或气雾剂。本领域已知的方法可用于防止或最小化组合物的释放和吸收，直到其到达目标组织或器官，或确保组合物的定时释放。然而，理想的情况是，使用不会使表达CLTX-CAR的细胞无效的药学上可接受的形式。因此，理想的是，表达本文所述多价CLTX-CAR的细胞可以制成含有平衡盐溶液的药物组合物，例如Hanks平衡盐溶液或生理盐水。因此，本发明包括药物组合物，其包含表达本申请申请的多价CLTX-CAR的γδ-T细胞，并且具体地包括表达多价CLTX-CAR并表达赋予多肽抗性的多肽的γδ-T细胞。

药物组合物可以被单独使用或与其他公认的可用于治疗癌症的药物组合使用，例如本文所述的化学治疗剂。无论是单独递送还是与其他药剂组合递送，本发明的药物组合物都可以通过各种途径递送到哺乳动物，特别是人类体内的各种位点，以达到特定的效果。本领域技术人员将认识到，尽管不止一种途径可以用于给药，但是特定途径可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。例如，皮内递送给药比吸入给药可以有利地用于治疗黑色素瘤＝。局部或全身给药可通过将制剂施用或滴入体腔、吸入或吹入气雾剂，或通过胃肠外给药，包括肌内给药、静脉内给药、门内给药、肝内给药、腹膜内给药、皮下给药或皮内给药来实现。

该组合物可以单位剂量形式提供，其中每个剂量单位，例如注射剂，含有预定量的组合物，单独或与油性活性剂适当组合。本文使用的术语单位剂量形式是指适合作为人类和动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的本发明组合物，单独或与其他活性剂组合，以足以产生所需效果的量计算，在适当的情况下与药学上可接受的稀释剂、载体或载体结合。本发明的新型单位剂量形式的规格取决于与特定受试者中的药物组合物相关的特定药效学。优选地，治疗有效量或足够数量的γδ-T细胞被单独给药或与治疗剂联合给药引入受试者中，从而建立长期、特异性的反应。在一个实施方案中，所述反应包括抑制癌症。在一个实施方案中，所述反应是肿瘤大小的减小或肿瘤生长或再生的消除或转移的减少，其程度大于不使用工程化的γδ-T细胞或其组合物。在某些方面，与不存在工程化CLTX-CAR的情况相比，治疗有效量导致肿瘤大小减少至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％。因此，治疗有效量考虑了给药途径，并且给药的工程化细胞的数量应为足够的数量，以便实现所需的治疗反应。此外表达本申请的CLTX-CAR的γδ-T细胞或包含在本文所述组合物中的其他细胞(例如，每个待接触细胞的量或每特定体重的量)在不同的应用中可以变化。在某些非限制性实施例中，细胞的浓度足够在被治疗的受试者中提供至少约1xl0

这些量提供了一般指导，以供从业者在优化本发明的方法用于实践本发明时使用。本文对这些范围的阐述决不排除使用在特定应用中可能保证的更高或更低量的组分。例如，实际剂量和时间表可以根据组合物是否与其他药物组合物联合给药，或者根据药代动力学、药物处置和代谢的个体间差异而变化。本领域技术人员可以根据特定情况的紧急情况随时进行任何必要的调整。治疗效果的合适剂量为每剂量约10

待治疗的癌症可能是神经外胚层起源的。在某些方面，癌症是恶性神经胶质瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤或小细胞肺癌。注入的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，表达CLTX-CAR的宿主细胞能够在体内复制，从而产生长期持久性，从而实现持续的肿瘤控制。本发明还包括一种细胞治疗，其中γδ-T细胞被修饰以瞬时表达本发明的CLTX-CAR和生存多肽，其中将细胞输注至需要的受体。注入的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，给予患者的γδ-T细胞在给予患者后存在不到一个月，例如三周、两周、一周。在某些方面，给予患者或其后代的细胞在患者体内持续给患者施用宿主细胞后至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。

在进一步的方面，γδ-T细胞可以是一种用于哺乳动物的离体免疫和/或体内治疗的疫苗。在一个方面，哺乳动物是人类。关于离体免疫，在对哺乳动物给药宿主细胞或者组合物(包括药物组合物，所述药物组合物包括所述宿主细胞)之前，在体外发生以下至少一种：i)宿主细胞扩增，ii)将编码多价CLTX-CAR和存活多肽的核酸引入宿主细胞和/或iii)冷冻保存表达或能够表达CLTX-CAR的细胞。体外过程在本领域中是众所周知的。简言之，从患者(例如，人)体分离细胞并进行基因修饰以表达本发明的CLTX-CAR(即，用表达本文公开的CLTX-CAR的载体体外转导或转染)。CLTX-CAR修饰的宿主细胞可以给予患者以提供治疗益处。患者优选是人，并且CLTX-CAR修饰的宿主细胞可以是相对于患者的自体。或者，宿主细胞可以是相对于患者的同种异体、同基因或异种。

工程化的γδ-T细胞和化学治疗剂(例如，生存因子赋予对其的耐药性的化疗剂)可以共同给药。这种共同给药可以包括“同时”或“同时给药”，例如在相同或不同的组合物中。在其他方面，共同给药包括单独给药，但作为相同治疗方案的一部分。在某些方面，化疗剂在给药工程化的γδ-T细胞之前或者同时给药。在其他方面，所述工程化的γδ-T细胞与化学治疗剂共同给药，其中化学治疗剂导致应激配体(例如NKG2DL)在肿瘤或癌症细胞上的表达增加；例如，化学治疗剂以导致应激配体表达增加的量和方式/方案给药。在某些方面，联合给药可能比单独给药更有效。两种治疗的效果可以是部分加成的、完全加成的或大于加成作用。例如，联合给药可以包括在给药化疗剂约8小时至约72小时后给药γδT细胞。在某些方面，工程化的γδT细胞在给药化疗剂后约12小时至约36小时给药；例如，在给药化学治疗剂后约24小时给药工程化的γδT细胞。在进一步的方面中，联合给药包括与化疗剂同时或基本上同时给药工程化的γδT细胞。如本文所用，“基本上相同的时间“可以包括在相同的治疗疗程内给药。

工程化的γδT细胞和化学治疗剂可以在活动性疾病期间、或在病情缓解或活动性较低的期间给药。

在进一步的方面中，除了γδT细胞和化疗剂之外还可以给药其他治疗剂。当联合用药时γδT细胞和化学治疗剂，以及任选的附加治疗剂，前述一种或全部的量或剂量，可以以高于、低于或等于单独使用的每种药剂的量或用量的量或量施用，例如，作为单一疗法。在某些实施方案中，前述一种或全部的量或剂量低于(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)单独使用的每种药剂的量或用量，例如，作为单一疗法。在其他实施方案中，导致期望效果(例如，癌症的抑制)的前述一种或全部的量或剂量低于(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)实现相同治疗效果所需的单独使用的每种药剂(例如，作为单一疗法)的量或用量。

工程化的γδT细胞和化学治疗剂可以与另一种治疗剂疗法联合给药，例如但不限于手术、化学治疗(例如，与DR细胞具有耐药性的化学治疗剂不同的其他的化学治疗剂)、检查点抑制剂、PARP抑制剂、辐射、免疫抑制剂，例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消融剂如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇和细胞因子。在另外的方面中，所述其他的治疗剂是检查点抑制剂，例如WO2018/035413中所述，其内容通过引用明确并入本文。在进一步的方面中，所述其他的治疗剂是DDR抑制剂，包括但不限于例如WO 2020/097306中所述的PARP抑制剂，其内容通过引用明确并入本文。

本发明还包括一种在化疗剂环境中增强氯毒素(CLTX)-CARγδ T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的方法，所述方法包括将工程化的γδT细胞表达至少两种CLTX肽，并任选地表达生存因子，例如，如本文所述的赋予对化疗剂抗性的多肽。与可比的sCLTX CARγδT细胞或其组合物相比，多价CLTX-CAR T细胞或其组合物在化疗剂环境中对肿瘤细胞具有增强的细胞毒性(存活多肽赋予耐药性)。本发明还包括一种在化疗剂环境中增强氯毒素(CLTX)-CAR T细胞对肿瘤细胞的激活作用(例如CD69激活作用)的方法，所述方法包括将γδT细胞进行工程化以表达至少两种CLTX肽和如本文所述的存活多肽。与可比的sCLTX CARγδT细胞或其组合物相比，多价CLTX-CARγδT细胞或其组合物具有增加的激活作用。

本文公开的联合疗法可以通过多种途径给予患者，包括例如口服给药或非肠道给药，并且可以包括但不限于静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、眶内给药、囊内给药、腹膜内给药、直肠内给药、颅内给药、肿瘤内给药、血管内给药、皮内给药，阴道内给药(例如阴道栓剂)，或局部给药(例如粉末、软膏透皮贴剂)，或者分别使用例如皮肤贴剂或透皮离子电渗法通过皮肤被动或促进吸收。

优选地，在实施本发明的方法中要给药的药剂的总量可以以单剂量的形式给药于受试者，可以是单次给药，也可以是在相对较短的时间内通过输注给药，或者可以使用分级治疗方案给药，其中在较长的时间内给药多剂量。本领域技术人员将知道，用于治疗受试者病理状况的组合物的量取决于许多因素，包括受试者的年龄和总体健康以及给药途径和要给药的治疗次数。鉴于这些因素，本领域技术人员将根据需要调整特定剂量。

本发明的药物组合物可以配制成与预期的给药方法或途径相容；本文阐述了示例性的给药途径。此外，药物组合物可与本文所述的其他治疗活性剂或化合物组合使用，以治疗或预防本申请所设想的疾病、病症和病况。

药物组合物通常包含治疗有效量的一种或多种用于本发明的联合疗法的制剂和一种或更多种药学和生理学上可接受的制剂。合适的药学上可接受或生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括但不限于抗氧化剂(例如抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、乙基或正丙基)、乳化剂、悬浮剂、分散剂、溶剂、填料、填充剂、洗涤剂、缓冲剂、载体、稀释剂和/或佐剂。例如，合适的载体可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，可能补充有用于胃肠外给药的药物组合物中常见的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是进一步的示例性载体。本领域技术人员将容易地认识到可用于本文所设想的药物组合物和剂型中的各种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。例如，缓冲液组分可以是水溶性材料，例如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸及其盐。可接受的缓冲剂包括，例如，Tris缓冲剂、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)和N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。

药物组合物配制完成后，可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。这种制剂可以以即用型、使用前需要重构的冻干型、使用后需要稀释的液体型或其他可接受的形式储存。优选地，在一次性容器(例如，一次性小瓶、安瓿、注射器或自动注射器(类似于例如

药物组合物可以是无菌可注射的水性悬浮液或含油悬浮液。该悬浮液可以根据已知技术使用本文提及的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水、林格溶液、等渗氯化钠溶液、Cremophor EL

药物组合物可以是适合口服的形式，例如片剂、胶囊、锭剂、含片、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬胶囊或软胶囊、或糖浆、溶液、微珠或药丸。用于口服的药物组合物可以根据本领域已知的任何制备药物组合物的方法来制备，并且这样的组合物可以含有一种或多种试剂，例如甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便提供药学上简洁的并适口的制剂。片剂、胶囊等含有与适用于片剂制造的无毒药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是，例如，稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒和崩解剂，例如玉米淀粉或褐藻酸；结合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶，以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

适合口服给药的片剂、胶囊等可以通过已知技术进行包衣或去包衣化，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供持续作用。例如，可以使用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油丙酯。它们也可以通过本领域已知的技术进行包衣以形成用于控制释放的渗透治疗片。另外的试剂包括可生物降解或生物相容性颗粒或聚合物物质，例如聚酯、多胺酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚酸酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、鱼精蛋白硫酸酯或丙交酯/乙交酯共聚物、或乙酸乙烯酯共聚物，以控制给药组合物的递送。例如，通过分别使用羟甲基纤维素或明胶微胶囊或聚(甲基甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，可以将口服试剂包埋在通过凝聚技术或通过界面聚合技术制备的微胶囊中，或包埋在胶体药物递送系统中。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、微珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。制备上述制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。

口服制剂也可作为硬明胶胶囊的形式存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙、高岭土或微晶纤维素混合，或作为软明胶胶囊的形式存在，其活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

含水悬浮液含有与适用于其制造的赋形剂混合的活性材料。这种赋形剂可以是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芷胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，或氧化烯与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧化乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂族醇(例如，对于十七烷氧基十六醇)的缩合产物，或环氧乙烷和衍生自脂肪酸和己醇的部分酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己醇酐的部分酯(例如聚乙烯山梨醇单油酸酯)的缩合产物。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂。

油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或矿物油(例如液体石蜡)中来配制。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂，例如上文所述的甜味剂和调味剂，以提供可口的口服制剂。

适用于通过加水制备水悬浮液的分散粉末和颗粒提供了与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。本文举例说明了合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂。

药物组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或者矿物油，例如液体石蜡，或者它们的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄芷胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂和衍生自脂肪酸的酯或部分酯；己醇酸酐，例如山梨醇单油酸酯；以及部分酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯。

制剂还可以包括保护组合物免受快速降解或从体内消除的载体，例如控释制剂，包括植入物、脂质体、水凝胶、前体药物和微胶囊递送系统。例如，可以单独使用或与蜡组合使用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸酯甘油酯。

栓剂可以通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放药物。此类材料包括但不限于可可脂和聚乙二醇。

适合根据本发明使用的药物组合物可以是目前已知或将来开发的任何形式(例如用于鼻腔或吸入用途的喷雾剂)。

本文所述的治疗方法特别适合于治疗癌症。癌症细胞可以侵入附近的组织，并通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。癌症有几种主要类型，例如，癌症是始于皮肤或排列或覆盖内脏的组织的癌症。肉瘤是一种癌症，起源于骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持性组织。白血病是一种癌症，始于骨髓等成血组织，导致大量异常血细胞产生并进入血液。淋巴瘤是起源于免疫系统细胞的癌症。

正在治疗的癌症肿瘤可以是颅内肿瘤。颅内肿瘤包括但不限于神经胶质瘤、脑膜瘤、听神经瘤、垂体腺瘤、髓母细胞瘤、生殖细胞瘤和颅咽管瘤。

在一些方面，根据本发明治疗的癌症是CNS肿瘤，包括但不限于颅内和脊髓室管膜瘤(不包括室管膜下瘤)；低级别浸润性幕上星形细胞瘤/少突胶质瘤、髓母细胞瘤、间变性胶质瘤、胶质母细胞瘤，中枢神经系统转移性病变和原发性中枢神经系统淋巴瘤。

在某些方面，正在治疗的癌症是黑色素瘤。优选的，治疗的癌症是葡萄膜黑色素瘤。

在某些方面，正在治疗的癌症是神经内分泌或肾上腺肿瘤。实施例包括但不限于支气管肺病、胃肠道、肺或胸腺、胰腺、副神经节瘤或嗜铬细胞瘤。

在某些方面，正在治疗的癌症是非霍奇金淋巴瘤，包括但不限于蕈样真菌病和Sezary综合征。

在某些方面，正在治疗的癌症是一种软组织肉瘤。实施例包括血管肉瘤、不可切除或进行性腹膜后/腹腔内软组织肉瘤、横纹肌肉瘤、四肢/浅干和/或头颈癌症或孤立性纤维瘤/血管外皮细胞瘤。

在某些方面，正在治疗的癌症是骨癌。骨癌的包括尤因肉瘤和间充质软骨肉瘤。

在某些方面，正在治疗的癌症是子宫肉瘤、小细胞肺癌癌症(SCLC)或左林格尔-埃利森综合征。

在一些方面，根据本发明治疗的癌症是妇科癌症(例如，女性生殖系统癌症)，包括但不限于卵巢癌症、输卵管癌、腹膜癌和乳腺癌。优选地，根据本发明治疗的癌症是卵巢癌。

在一些方面，根据本发明治疗的癌症是胶质母细胞瘤。

脑肿瘤在脑内广泛扩散，但通常不会转移到脑外。胶质瘤在大脑内部具有很强的侵袭性，甚至可以跨越大脑半球。然而，它们确实以一种不受控制的方式分裂。根据它们的位置，它们可能和恶性病变一样具有生命危险。一个例子是大脑中的良性肿瘤，它可以生长并占据头骨内的空间，导致大脑压力增加。

还提供了包含药物组合物的试剂盒，所述药物组合物通常包含治疗有效量的用于本文所述的本发明的联合疗法的一种或多种药剂。试剂盒通常包括一个标签，标明试剂盒内容物的预期用途和使用说明。

本文所述的任何组合物或组合物的组合都可以包含在试剂盒中。在非限制性实施例中，嵌合受体表达构建体、一种或多种用于产生嵌合受体表达结构体的试剂、用于转染表达构建体的细胞，和/或获得用于转染表达构建体的自体细胞的一种或多种仪器(这样的仪器可以是注射器、移液管、钳子和/或任何这样的医学批准的仪器)。试剂盒可以包括一种或多种适当等分的本发明组合物或生成本发明组合物的试剂。试剂盒的成分可包装在水性介质中或冻干形式中。试剂盒的容器装置可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，可将成分放入其中，最好适当等分。如果试剂盒中有一个以上的组件，试剂盒通常还将包含第二个、第三个或其他附加容器，附加组件可以单独放置在该容器中。然而，在小瓶中可以包括各种组分的组合。本发明的试剂盒通常还将包括用于容纳嵌合受体构建体的装置和用于商业销售的封闭的任何其他试剂容器。这样的容器可以包括注射或吹塑的塑料容器，例如，期望的小瓶被保持在该塑料容器中。

试剂盒通常是容纳各种部件的物理结构的形式，如下所述，并且例如可以用于实践上述方法。试剂盒可以包括包含在例如一个或多个无菌容器中的组合物，所述组合物提供了一种或多种用于本发明的联合治疗的治疗剂(例如工程化的γδ细胞)，所述无菌容器可以是任何适合给药于受试者的药物组合物的形式。药物组合物可以以可供使用的形式提供，或者以需要的形式，例如在给药前重构或稀释的形式提供。当组合物处于需要由使用者重构的形式时，试剂盒还可以包括缓冲液、药学上可接受的赋形剂等，与治疗剂一起包装或单独包装。当考虑联合治疗时，试剂盒可以单独包含几种药剂，或者它们可以已经组合在试剂盒中。

本发明的试剂盒可以被设计成用于适当地保持容纳在其中的部件所必需的条件(例如，制冷或冷冻)。试剂盒可以包含标签或包装插入物，包括其中成分的识别信息和使用说明书(例如，给药参数、活性成分的临床药理学，包括作用机制、药代动力学和药效学、不良反应、禁忌症等)。

试剂盒的每个组件都可以封装在一个单独的容器中，所有不同的容器都可以在一个包装中。标签或插入物可以包括制造商信息，例如批号和有效期。标签或包装插入物可以例如集成到容纳部件的物理结构中，单独包含在物理结构内，或者固定到试剂盒的部件(例如安瓿、注射器或小瓶)。

标签或插入物还可以包括或被结合到计算机可读介质中，例如磁盘(例如硬盘、卡、存储盘)、光盘(例如CD或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带)或电存储介质(例如RAM和ROM)或这些介质的混合体(例如磁/光存储介质、FLASH介质或存储型卡)。在一些实施方案中，实际指令不存在于试剂盒中，但是提供了用于从远程源(例如经由互联网站点)获得指令的装置。

实施例

以下实施例是以说明的方式提供的，不应被解释为以任何方式限制本发明。

实施例1:用于T细胞耐药性免疫疗法的dCLTX-CAR-MGMT载体的研制

我们开发了一种治疗原发性GBM的新方法，将基因修饰的γδT细胞和标准替莫唑胺(TMZ)维持化疗剂同时颅内给药。这些γδT细胞用O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)转导，传递对烷基化化疗剂的耐药性，从而在肿瘤NKG2DL表达显著升高时，在TMZ的治疗浓度下发挥效应器功能。我们用表达具有氯毒素结合结构域(CLTX-CAR)的嵌合抗原受体(CAR)的慢载体构建体修饰γδT细胞，以提高GBM的靶向性。MGMTp140k在相同的CLTX-CAR载体中共表达，以赋予CAR-T细胞对TMZ的耐受性(抗性)。CLTX-CAR载体包含CD8α信号肽、单或双CLTX结合结构域、Myc-Tag肽、CD8α铰链结构域、CD28跨膜结构域和共刺激结构域，然后是CD3ζ激活结构域。我们使用P2A肽与CAR共表达MGMTp140k。最初，我们证明了在Jurkat T细胞中用双CLTX构建体作为结合结构域(dCLTX-CAR)有效转导CLTX-CAR。通过流式细胞术验证dCLTX CAR的细胞表面定位。与单CLTX CARs(sCLTX CARs)转导的Jurkat细胞相比，dCLTX CAR表现出CD69激活增加(MFI＝4873vs 1078)。期望的是，与sCLTX CARs转导γδT细胞相比，dCLTX CAR转导的γδT细胞在体外(包括TMZ暴露下)对肿瘤细胞显示更强的细胞毒性。由于γδT细胞通过NKG2DL应激抗原识别作用识别并杀死肿瘤，我们假设没有激活信号的CLTX-CAR可能足以增强γδT淋巴细胞对肿瘤细胞的识别和细胞毒性，并减轻CAR-T激活诱导的细胞死亡。然后，我们开发了不含CD3ζ结构域的dCLTX-CAR构建体(dCLTX-noZ-CARs)。正如预期的那样，当与GBM细胞共培养时，与全长dCLTX CAR相比，dCLTX-noZ-CAR慢病毒转导的Jurkat细胞表现出增强的细胞-细胞结合，但是没有CD69表达。总体而言，我们能够产生对TMZ具有耐药性的dCLTX-CAR-T细胞，并在TMZ暴露下显示出对GBM细胞的活化改善。我们将dCLTX CAR和TMZ耐药性相结合的方法将在动物模型实验中得到进一步验证，并可能成为GBM临床开发的潜在候选者。

为了构建dCLTX CAR构建体，通过IDT DNA合成gblock双链DNA，所述gblock双链DNA编码人类密码子优化的CLTX、c-Myc-Tag、P2A-EGFP、P2A-MGMTp140k和其他CAR结构域，并通过Gibson组装克隆试剂盒(New England Biolabs)克隆到转移质粒pDL171中。

图3显示了在Jurkat细胞中dCLTX-CAR和标记基因与慢病毒载体的共表达的流式细胞术分析。c-Myc标记物用作CLTX的替代标记物，并证明dCLTX CAR的表达和细胞表面定位。EGFP是通过P2A自切割肽与CLTX-CAR共表达的标记基因。

图4显示在与U251MG细胞共培养后，在慢病毒dCLTX CAR转导的Jurkat细胞中CD69的活化作用。用编码EGFP、CLTX-EGFP、dCLTX-EGFP和dCLTX-MGMT的慢病毒载体转导的Jurkat细胞，并与U251MG细胞共培养24小时，并通过流式细胞术测量CD69的活化作用。图4显示出，在细胞外抗原结合结构域中包含两个CLTX肽的CAR转导(dCLTX-CAR细胞)的T细胞表现出的CD69活化作用比在细胞外抗原结合结构域只包含一个CLTX肽的细胞(sCLTX CARγδT细胞)转染的T细胞所表现出的CD69活化作用高4.5倍。虽然可能已经预测到两个CLTX肽的存在将是相加的，并且导致比单个CLTX肽更大的CD69活化，例如，两倍大的活化，但是令人惊讶的是，在CAR中仅两个CLTX-肽的存在导致比具有单个CLTX肽类的可比CAR大4倍以上的活化。该数据表明，细胞外抗原结合结构域中的多种CLTX肽对T细胞活化具有协同作用，出乎意料地显示出更大的持久性，并显示出对胶质母细胞瘤细胞更大的细胞毒性。dCLTX CAR中的两个CLTX肽由短肽，特别是Flag肽分离。如以下图9所示，当制备包含Flag或myc肽的1xCLTX构建体时，1xCLTX CAR表现出比不含肽/标签的CLTX-CAR更高的CD69活化。该数据(图9；下面将更详细地讨论)表明，CD69活化的增加可能至少部分是由于肽连接体(例如FLAG/myc标签)的添加。

实施例2:双氯毒素CAR(dCLTX CAR/2xCLTX CAR)和MGMTγδ-T细胞用于多型胶质

按如下所述方法进行流式细胞朮分析：

·活化

-慢病毒转导的Jurkat T细胞与U251 GBM细胞共培养24小时然后用抗-CD69抗体染色

·持久性

-CLTX-CAR-转导的Jurkat细胞被活化并培养3周，测量％CAR+T细胞

·细胞毒性试验

-高效(>60％)转导的γδT细胞与U251-GFP或U87-GFP细胞以不同比例共培养24-48小时，然后用膜联蛋白V和7-AAD染色

CLTX-CAR构建体包含单个CLTX(1xCLTX)或多个CLTX结合结构域(例如2xCLTXCAR/dCLTX CAR)，用于潜在增强肿瘤靶向作用。制备了某些构建体，包括用于CAR-T检测/富集的Myc标签或Flag标签(如所示)。制备了包含CD3ζ信号传导结构域的CLTX-CAR构建体。此外，还制备了不含CD3ζ信号传导结构域的CLTX-CAR构建体(“noZ”或“无CD3z”)，用于减轻活化诱导的细胞死亡(AICD)和紧张性信号传导。O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(p140K-MGMT)的共表达赋予替莫唑胺(TMZ)耐药性(DeltEx耐药性免疫治疗(DRI))。图5至图8中所示的数据表示单个实验，并且随后的实验显示出类似的结果。

CLTX CARs有效激活Jurkat T细胞：用具有细胞外myc或flag标记物的1x和2xCLTX CAR慢病毒载体转导Jurkat T细胞。还包括GFP对照和没有标签的1xCLTX CAR。图5显示在Jurkat T细胞中优化和测试了CLTX-CAR构建体，并且2xCLTX-CARs有效地激活了Jurkat T细胞。具体而言，CD69在转导的CAR-T细胞中被激活，但在GFP对照转导的T细胞或未转导的T淋巴细胞中未被激活。此外，根据观察，具有细胞外标签(myc或flag)的CLTX-CAR显示出比没有标签的CLTX-CAR更高水平的T细胞活化。图9显示与U251胶质母细胞瘤细胞的共培养激活了的1xCLTX CAR和2xCLTX Jurkat T细胞，并且进一步显示用不具有CD3z信号结构域(noZ)的1xCLTX-CAR或2xCLTX-CRA构建体转导的Jurkat T细胞在U251共培养时未显示CD69激活。与未转导的细胞相比，用不带标签的1xCLTX-CAR转导的Jurkat T细胞显示CD69的中度活化。用1xCLTX-CAR或具有Flag标签的2xCLTX-CARs转导的Jurkat T细胞在与肿瘤细胞共培养时显示出更显著升高的CD69活化。

具有较长CAR-T细胞持久性的CLTX-CAR构建体：Jurkat T细胞用含有或不含有CD3z的1x和2xCLTX-CAR转导，活化并监测CAR-T百分比约3周。图6显示了两种CLTX-CAR构建体对Jurkat T细胞持久性的影响。没有CD3z的CLTX-CAR-T细胞比具有CD3z的CLTX-CAR-T细胞具有更高的持久性。此外，与1xCLTX-CAR相比，2xCLTX-CARs中的T细胞持久性得到改善。图10显示了2xCLTX以及信号传导结构域的缺失对Jurkat T细胞持久性的影响。不具有信号传导结构域的细胞比具有CD3z信号传导结构域的可比细胞具有更大的持久性，并且具有两种CLTX肽(双CLTX)的细胞比仅具有一种CLTX肽类的可比细胞显示出更大的持久性。此外，图11和12显示缺乏信号传导结构域的1xCLTX细胞比具有CD3z信号传导结构域的可比细胞具有更大的持久性；具体地说，1xCTX-Flag-noZ-EGFP显示出比1xCTX-Flag-Z-EGFP细胞更大的持久性。

CLTX-CARs增强γδT细胞对GBM细胞的杀伤作用：在与CLTX-CAR-γδT细胞共培养48小时后，U251-GFP GBM细胞用膜联蛋白V和7-AAD染色，用于流式细胞术分析细胞毒性。如图8所示，当与CLTX-CAR-γδT细胞共培养时，超过80％的GBM细胞正在经历凋亡或被杀死，相比之下，当与未转导的γδT共培养时有42.6％的GBM细胞凋亡。总之，这些结果表明在γδT细胞中CLTX-CARs的有效转导和表达，并进一步表明CLTX-CARs增强了γδT细胞对GBM细胞的细胞毒性，即使在缺乏CD3z共刺激结构域的情况下也是如此。

实施例3:慢病毒转导γδT细胞和CLTX-CAR-γδT细胞的细胞毒性

从健康供体单采产品(Hemacare)中扩增，并在补充有FBS(Cytiva HyClone)、HEPES(Thermo Scientific)、MEM NEAA(Cytiva-HyClone)，丙酮酸钠(Gibco)和人rIL-12的RPMI培养基(CytivaHyClone)中培养具有高于50％的γδT的γδT细胞。用表达CLTX-CAR的慢病毒载体转导扩增的γδT细胞，并在转导效率分析和细胞毒性测定之前维持至少2天。γδTCR阳性和Flag阳性群体的流式细胞术检测CLTX-γδT细胞的转导效率。对于细胞毒性测定，对照(γδT细胞NTC)和2xCLTX CAR noZ-γδT淋巴细胞与U251或U87 GBM细胞在悬浮液中以效应物与靶点(E/T)的比例2:1或4:1共培养4小时，然后用7-AAD染色和流式细胞术分析。

图13显示用结合GBM细胞的慢病毒载体转导的对照γδT细胞(γδT细胞NTC)和2xCLTX-CAR-noZ-γδT细胞的照片，所述2xCLTX-CAR-noZ-γδT细胞被慢病毒载体转导，在与效应因子以2：1或者E/T4：1的情况下共培养时所述慢病毒载体结合GBM细胞。CTLX-CARγδT细胞能够结合GBM细胞，特别是2xCLTX-CAR-FLAG-noZ-γδT细胞显示出比对照γΔT细胞更强的GBM细胞的结合作用。图14显示，2xCLTX-CAR-noZ-γδT对U87胶质母细胞瘤细胞显示出比对照γδT细胞(没有CAR)增强的细胞毒性，即使没有CD3z信号结构域。

实施例4:用2xCLTX-CAR-noZγδT细胞连续杀伤U251-GFP吡GBM细胞

从用表达GFP的慢病毒载体转导的U251MG GBM细胞系建立U251-GFP细胞。慢病毒转导的2xCLTX-CAR-noZ-γδT细胞与U251-GFP GBM细胞在24孔板中共培养，并使用带有EVOS台上培养箱(Thermo Scientific)的EVOS M5000成像系统每1分钟拍摄一次延时照片，持续15小时。

图15示出了来自延时电影的一系列静止图像，并且示出了通过2xCLTX CAR noZγδT细胞对U251MG GBM细胞的连续杀伤作用。图像中的绿色细胞(或者如灰度所示，越亮的细胞)就是肿瘤细胞。红色箭头表示随着时间的推移，γδT细胞结合并杀死不同的肿瘤细胞(参见图像中的T1、T2、T3、T4和T5以及Kill-1、Kill-2、Kill-3、Kill-4和Kill-5)。图像是随时间拍摄的(从左到右，如图像之间的箭头所示)。研究表明，单个2xCLTX CAR noZ修饰的γδT细胞能够在数小时内结合、分离并最终杀死5个以上的靶GBM细胞。

实施例5:具有三个或者四个CLTX肽的CARs通常不存在与细胞表面

将具有3个串联CLTX肽(3xCLTX-Z-EGFP)或4个串联CLTX-肽(4xCLTX-Z-EGFP)的CLTX-CAR-EGFP构建体包装到慢病毒载体中并转导到Jurkat T细胞中(参见例如图16)。将3xCLTX-Z-EGFP或4xCLTX-Z-EGFP-Jurkat T细胞与U251GBM细胞共培养24小时，并通过流式细胞术进行分析。

图17A-17C显示了使用抗Myc单克隆抗体对对照(NTC)细胞、3xCLTX-Z-EGFP-Jurkat细胞和4xCLTX-Z-EGFP-Julkat细胞的细胞表面染色的流式细胞术分析，并且还显示了在与U251GBM细胞共培养后的任何CD69活化。细胞也被GFP门控。图17B和17C显示用具有高GFP+群体的3x和4x CLTX-CAR慢载体有效转导3xCLTX和4xCLTX CAR，但CLTX CARs不正常存在于细胞表面(GFP+是但不是Myc+)。此外，那些转导的Jurkat细胞(GFP+)的CD69激活状态没有变化，表明细胞表面没有功能性CAR表达。

尽管本发明已经参考以下内容被特别地示出和描述本领域技术人员将理解在不脱离所附权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中进行形式和细节的改变。