一种检测同型半胱氨酸的比率型电化学适配体传感器的制备和应用

技术领域

本发明涉及一种检测同型半胱氨酸的比率型电化学适配体传感器的制备方法，同时涉及其作为电化学传感器用于检测溶液的同型半胱氨酸（Hcy），属于电化学检测技术领域。

背景技术

同型半胱氨酸（Hcy）是一种含硫氨基酸。正常情况下，Hcy在肝、肾内被分解代谢，浓度维持在较低水平。但当代谢途径受阻时，同型半胱氨酸便会在细胞内蓄积，进入血液循环，引起慢性病理损害。血液中的同型半胱氨酸含量是人体健康的重要指标，若高于15 μmol/L，则可诊断为高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸血症为心脏病、中风等独立危险因素之一，视为癌症、动脉粥样硬化、阿尔兹海默症等疾病的病因或结果。研究发现，它至少与50种以上的疾病相关联。因此，实现准确、快速、高选择性地检测Hcy，对生命科学研究以及临床诊断具有重要的现实意义。近年来，国内外学者开展了相关研究工作，报道了一些检测同型半胱氨酸的方法，如放射酶法、免疫法、色谱法、质谱法、毛细血管电泳法、荧光分析法以及电化学检测法等。电化学方法由于操作简单、分析速度快、易微型化的特点提供了对生物分子进行直接、在线检测的可能性。因此，电分析技术仍然是检测具有电活性的氧化物质通量的首选技术。

近些年，电化学适配体传感器（ECAS）以灵敏度高、选择性好、响应快和成本较低受到了广泛关注。适配体（Apt）是15-80个单核苷酸的单链DNA或RNA构成的，可由体外人工合成或SELEX筛选获得。Apt固定在传感器的界面充当识别的受体，之后Apt-靶标之间特异性反应可以经不同种类的转换作用转换成和靶标含量或活性有关的电响应。因此,基于响应的变化，可以对目标分子实现分析测定。ECAS能够检测目标蛋白质（例如酶，抗体，生长因子，细胞粘附分子等），小分子（例如氨基酸，金属离子，寡核苷酸，生物因子，肽，药物等），甚至可以完整结合病毒颗粒，细菌和细胞。因此，构建新型的Hcy电化学适配体传感器对快速、灵敏和高选择性检测Hcy提供了。

电极表面修饰导电性好的纳米材料对提高电化学适配体传感器的灵敏度起着至关重要的作用。MXene具有优异的导电性使其在能源存储与转换，传感器，多功能聚合物复合材料等领域受到广泛关注。然而，MXene材料片层的重新堆叠会导致材料比表面积的下降限制了其进一步发展。考虑还原氧化石墨烯（rGO）具有和MXene类似的二维层状结构，非常希望将MXene与rGO整合以制造具有多孔的导电气凝胶作为电极修饰材料。金纳米颗粒（AuNPs）具有如易制备、成本低﹑稳定性高、优良的生物相容性和电子特性等优异特性，还可以作为适配体的理想纳米载体，进一步提高传感器的传感性能。

对于具有单信号输出的传统传感器，信号强度难以测量，因为它很容易受到内在或外在因素的影响，例如传感器浓度、环境条件和仪器效率。使用比率双信号策略可以有效地克服这种限制。含有不同电活性物质的电化学比率传感器具有双信号输出，并且可以通过测量不同氧化还原电位下的双氧化电流峰值强度的比率来确定分析物，提高了电化学传感的准确度和灵敏度。因此，构建灵敏、便捷的Hcy比率型电化学适配体传感器就显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测同型半胱氨酸的比率型电化学适配体传感器的制备方法；

本发明还涉及该同型半胱氨酸的比率型电化学适配体传感器在检测溶液中同型半胱氨酸的应用。

本发明首先基于MXene和还原氧化石墨烯（rGO）的杂化气凝胶MGA-40负载金纳米粒子（AuNPs）得到复合材料Au/MGA-40，并将其与亚甲基蓝（MB）复合后修饰于玻碳电极得到Au/MGA-40/MB/GCE。接下来，将适配体（Apt）利用金-硫键（Au-S）自组装到修饰电极表面，并用小牛血清白蛋白（BSA）作封闭剂，从而构建了同型半胱氨酸的比率型电化学适配体传感器。最后，将Apt-Au/MGA-40/MB/GCE作为传感平台，用差示脉冲伏安法进行扫描，在特定Hcy浓度范围内，Hcy的氧化峰电流（I

一、MXene和rGO杂化气凝胶（MGA-40）负载AuNPs和MB复合材料（Au/MGA-40/MB）的制备

本发明MXene和rGO杂化气凝胶（MGA-40）负载AuNPs和MB复合材料，是通过在MGA-40上负载AuNPs和MB得到的。具体包括以下步骤：

（1）AuNPs的制备：将HAuCl

（2）MGA-40的制备：将维生素C（VC）加入到氧化石墨烯（GO）的悬浮液中搅拌10 ~15分钟，再加入MXene的悬浮液继续搅拌30 ~ 40分钟，将得到的混合物超声处理30 ~ 40分钟后，密封到不锈钢高压反应釜中在95 ~ 100 ℃下水热处理4 ~ 5小时。将反应物用无水乙醇和超纯水洗涤三次后冷冻干燥得到MXene和还原氧化石墨烯（rGO）杂化气凝胶（MGA-40）。其中，MXene与GO的质量比为1:2.4 ~ 1:2.6；维生素C与氧化石墨烯的质量比为1.6:1~ 2.0:1。

（3）复合材料（Au/MGA-40/MB）的制备：将MGA-40加入AuNPs溶液中超声处理6 ~ 7小时后，离心干燥后得到复合材料Au/MGA-40。

随后，将Au/MGA-40分散于超纯水中得到Au/MGA-40分散液。将亚甲基蓝（MB）加入Au/MGA-40分散液中超声处理1 ~ 2小时后，得到复合材料Au/MGA-40/MB分散液。其中，MB与Au/MGA-40的质量比为1:14 ~ 1:18。

二、Au/MGA-40的结构表征

图1为GO、MXene、MGA-40、AuNPs和Au/MGA-40的形貌表征图，其中图1A、图1B和图1C分别为GO、MXene和MGA-40的扫描电镜图（SEM），图1D、图1E和图1F分别为MGA-40、AuNPs和Au/MGA-40的透射电镜图（TEM）。如图1A所示，GO展示出典型褶皱状结构。图1B展示了MXene类似于手风琴的二维片层状结构。如图1C所示，与GO和MXene的形貌明显不同，MGA-40气凝胶展示出多孔的网络状结构。从图1D的MGA-40的TEM图，可以分别观察到rGO和MXene层，这表明rGO和MXene的成功结合。如图1E所示，制备的AuNPs具有良好的分散性。由图1F可以观察到，AuNPs已经成功负载在MGA-40上。综合以上实验结果，MXene和rGO杂化气凝胶（MGA-40）上负载AuNPs复合材料（Au/MGA-40）已经成功制备。

图2为MGA-40和Au/MGA-40的X射线衍射光谱图（XRD）。如a曲线所示，观察到7.32°、33.6°和42.9°的衍射峰分别对应于MXene（Ti

图3A为MGA-40的氮气吸脱附图（BET）。MGA-40的BET表面积分别为287.5 m

三、Au/MGA-40作为比率型电化学适配体传感器的应用

1、Au/MGA-40/MB修饰电极（Au/MGA-40/MB/GCE）的制备

将上述制备的Au/MGA-40分散于水中，配成浓度为1.6 mg/mL的分散液。将亚甲基蓝（MB）加入Au/MGA-40分散液中超声处理1 ~ 2小时后，得到复合材料Au/MGA-40/MB分散液，并滴涂在经处理的裸玻碳电极上，室温干燥，制得修饰电极Au/MGA-40/MB/GCE，涂层的厚度为200 ~ 800 nm。

2、比率型Hcy电化学适配体传感器（Apt-Au/MGA-40/MB/GCE）的制备

取修饰电极Au/MGA-40/MB/GCE，将适配体（Apt）利用金-硫键（Au-S）自组装到修饰电极表面，并用小牛血清白蛋白（BSA）占据未封闭的结合位点，得到同型半胱氨酸的比率型电化学适配体传感器（Apt-Au/MGA-40/MB/GCE）。

图4为不同修饰电极的电化学阻抗图谱（EIS）。如曲线a所示，Au/MGA-40/MB/GCE的电阻（34 Ω）最小，表明该修饰电极具有优异的导电性。如曲线b所示，当Apt自组装到Au/MGA-40/MB/GCE后，修饰电极的电阻变大为（268 Ω），这表明Apt已经成功自组装在修饰电极表面。用小牛血清白蛋白（BSA）占据未封闭的结合位点后，如曲线c所示修饰电极的电阻增大至（332 Ω），表明修饰电极上其它未封闭的位点已经被BSA占据，这可以进一步提高传感器的选择性。以上结果表明，比率型电化学适配体传感器（Apt-Au/MGA-40/MB/GCE）的成功制备。

3、比率型电化学适配体传感器检测Hcy

以修饰电极Apt-Au/MGA-40/MB/GCE为工作电极、铂柱作为对电极、饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，以0.2 M pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液作为电解液。修饰电极Apt-Au/MGA-40/MB/GCE在含有Hcy溶液中孵化后，在工作电位为-0.4 ~ 0.8 V下，用差示脉冲伏安法进行扫描。

图5为不同修饰电极的差示脉冲伏安图。a曲线和b曲线分别为修饰电极Apt-Au/MGA-40/GCE和Apt-Au/MGA-40/MB/GCE在0.2 M PBS（pH = 7.4）中的差示脉冲伏安曲线，c曲线为Apt-Au/MGA-40/MB/GCE在含有100 μM的Hcy的0.2 M PBS（pH = 7.4）中的差示脉冲伏安曲线。如a曲线所示，Apt-Au/MGA-40/MB/GCE在空白的PBS中没有任何电化学信号。而b曲线在-0.25 V处出现了一个氧化峰，这对应于电极上MB的氧化电流信号，这进一步证实了修饰电极中MB的存在。c曲线不仅在0.246 V处出现了MB的氧化峰，还在0.505 V出现了Hcy的氧化峰，这表明该比率型电化学适配体传感器对Hcy具有优异的电化学响应，能够更灵敏的检测Hcy。而且，Hcy和MB氧化信号的同时出现，这为构建比率型电化学传感器奠定了基础。

图6A为比率型电化学适配体传感器在含有不同浓度Hcy的0.2 M PBS（pH = 7.0）中的差示脉冲伏安图，插图为对应Hcy浓度为2.14×10

由图6B插图可知，当Hcy浓度为2.14×10

在0.2 M PBS溶液（pH = 7.4）加入Hcy，使用比率型电化学适配体传感器在Hcy溶液中孵化后，在工作电位为-0.4 ~0.8 V下，用差示脉冲伏安法进行扫描。得到I

综上所述，本发明相比现有技术具有以下优点：

1、本发明利用MXene和rGO杂化气凝胶（MGA-40）负载AuNPs和MB复合材料（Au/MGA-40/MB）构建了一种比率型Hcy电化学适配体传感器。相比于其它Hcy电化学传感器，该适体传感器由于适配体和Hcy间的特异性，具有很好的选择性好。此外，其制备工艺简单，成本低廉，易操作，可长期使用。

2、本发明制备的比率型电化学适配体传感器对Hcy有灵敏的电化学响应，检测限低至0.713×10

3、本发明制备的比率型电化学适配体传感器用于溶液中Hcy的电化学检测中，检测准确，表明该比率型电化学适配体传感器具有很好的应用前景。

附图说明

图1为GO、MXene、MGA-40、AuNPs和Au/MGA-40的形貌表征图，其中图1A、图1B和图1C分别为GO、MXene和MGA-40的扫描电镜图（SEM），图1D、图1E和图1F分别为MGA-40、AuNPs和Au/MGA-40的透射电镜图（TEM）。

图2为MGA-40和Au/MGA-40的X射线衍射光谱图（XRD）。

图3为MGA-40的氮气吸脱附图（图3A）及其孔径分布图（图3B）。

图4为不同修饰电极的电化学阻抗图，其中a曲线为Au/MGA-40/MB/GCE，曲线b为Apt-Au/MGA-40/MB/GCE，曲线c为用BSA封装后的Apt-Au/MGA-40/MB/GCE修饰电极。

图5为不同修饰电极的差示脉冲伏安图，其中a曲线和b曲线分别为修饰电极Apt-Au/MGA-40/GCE和Apt-Au/MGA-40/MB/GCE在0.2 M PBS（pH = 7.4）中的差示脉冲伏安曲线，c曲线为Apt-Au/MGA-40/MB/GCE在含有100 μM的Hcy的0.2 M PBS（pH = 7.4）中的差示脉冲伏安曲线。

图6为比率型电化学适配体传感器（Apt-Au/MGA-40/MB/GCE）对不同浓度的Hcy检测的差示脉冲伏安图线（图6A）及Hcy的响应电流（I

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明比率型电化学适配体传感器制备，以及该比率型电化学适配体传感器的应用作进一步说明。

实施例1、MXene和rGO杂化气凝胶负载AuNPs和MB复合材料（Au/MGA-40/MB）的制备

（1）AuNPs的制备：将150 mL HAuCl

（2）MGA-40的制备：将180 mg维生素C（VC）加入到50 mL氧化石墨烯（GO，2.0 mg/mL）的悬浮液中搅拌10分钟，再将8 mL MXene（5.0 mg/mL）的悬浮液加入到上述悬浮液中继续搅拌30分钟。此后，将混合物超声处理30分钟后，密封到不锈钢高压反应釜中在95 ℃下水热处理4小时。将反应物用无水乙醇和超纯水洗涤三次后冷冻干燥得到MXene和还原氧化石墨烯（rGO）杂化气凝胶（MGA-40）。

（3）复合材料（Au/MGA-40/MB）的制备：将10 mg MGA-40加入步骤（1）制得的50mLAuNPs溶液中超声处理6小时后，离心干燥后得到复合材料Au/MGA-40，将3.2 mg Au/MGA-40分散于2 mL超纯水中得到1.6 mg/mL的分散液。然后，将0.2 mg亚甲基蓝（MB）加入2.0 mL（Au/MGA-40）分散液（1.6 mg/mL）中超声处理1小时后，得到复合材料Au/MGA-40/MB分散液。

实施例2、比率型电化学适配体传感器（Apt-Au/MGA-40/MB）制备

（1）玻碳电极的预处理：将玻碳电极依次用0.30 μm、0.05 μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95 %的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；然后以玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系，在含有1.0 mM铁氰化钾探针分子的0.1 M氯化钾电解质溶液中，进行循环伏安扫描（扫速为50 mV/s），最后将电极取出并用二次蒸馏水冲洗并吹干。

（2）比率型电化学适配体传感器（Apt-Au/MGA-40/MB/GCE）制备：取实施例1制备的MXene和rGO杂化气凝胶负载AuNPs和MB复合材料（Au/MGA-40/MB）分散液，并将分散液滴涂在上述经处理的裸玻碳电极上，室温干燥，制得修饰电极Au/MGA-40/MB/GCE。将6 μL适配体（Apt, 10 μM）滴涂在上述修饰电极表面，并在4 ℃孵化150分钟利用金-硫键（Au-S）自组装到修饰电极表面。接下来继续将该修饰电极置于0.5 mM小牛血清白蛋白（BSA）溶液1小时占据未封闭的结合位点后，用0.2 M PBS（pH = 7.4）的磷酸盐缓冲溶液冲洗修饰电极表面，得到同型半胱氨酸的比率型电化学适配体传感器（Apt-Au/MGA-40/MB/GCE）。

实施例3、比率型电化学适配体传感器检测溶液中Hcy浓度

首先，配置浓度分别为2.0×10