一株细长赖氨酸芽孢杆菌及其在海带降解制备海藻液肥中的应用

技术领域

本发明属于益生菌筛选技术领域，具体涉及一株用于降解海带制备海藻液肥的细长赖氨酸芽孢杆菌。

背景技术

长期以来传统农业使用的化学肥料会破坏土壤的理化性质，导致一系列土壤问题，例如土壤的酸化板结、肥力下降、土壤中微生物群落减少，不利于农作物的生长；而且过量施用化肥还会导致土壤中重金属元素含量提高，造成环境污染，破坏生态。农作物中的化学物的残留也进一步危害到人体健康。要解决这一问题的关键在于减少化肥的投入，使用绿色有机肥或新型植物营养调节剂，提高植物对肥料的吸收利用率。

有机肥料营养全面，污染小，能增加土壤中的有机质，提高土壤蓄水、保肥能力，还可以改善土壤理化性状和团粒结构，从而促进作物的生长，提高农产品的产量和品质。海藻肥就是一种天然的有机肥。海藻肥料是指以海洋藻类为原料，经一定加工手段制备而成的绿色有机生物肥料。海藻中含有大量的有机物、海藻酸、甘露醇、甜菜碱、植物生长调节剂、维生素和微量元素，以及从海洋中富集而来的钾、碘、镁、钙等丰富矿物元素。海藻肥营养丰富活性高易于被植物吸收利用，并且绿色有机无公害，是一种环保高效的新型生态肥料，市场潜力巨大。我国海洋面积辽阔，海藻资源丰富，研发优质海藻肥符合国家海洋经济发展战略，也可缓解化肥过度使用导致的土壤污染问题。

海藻肥料品质优劣的关键在于其加工方式，目前国内外主要采用物理和化学的方式来制备海藻肥。海藻中的活性物质主要存在于细胞中，有效的破壁处理才能使其营养成分释放，以便植物吸收利用。物理破壁的方式主要是采用高压低温或研磨，对设备的要求严格，提取率低又成本高。化学破壁的方式是使用酸碱或有机试剂，破壁效率高但对藻类有机活性物质破坏较大，影响产品肥效，化学试剂的残留也对环境造成了二次污染。最理想高效的破壁方式是生物发酵酶解法，该方法反应条件温和，产品安全无毒副作用，能最大限度地保留海藻中的有效活性物质和营养成分。但是目前国内外企业在以生物法生产海藻肥的同时大多会以酸碱进行预处理，尚存在环境问题和营养物质的破坏，需要找到更为有效的发酵菌株和加工处理方式。海藻细胞壁和细胞间质的主要成分是海藻酸，对海藻酸的降解可以有效破坏海藻细胞结构，释放有效内容物，同时海藻酸的降解产物海藻寡糖分子量小，水溶性好，更利于被植物吸收利用。因此本发明致力于寻找能够产海藻酸裂解酶的菌株来发酵海带制备海藻液肥。

发明内容

本发明的目的是提供一株细长赖氨酸芽孢杆菌及其在海带降解制备海藻液肥中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)HD-6，已于2023年2月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.26499，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所提供的细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6用于降解海藻来制备海藻液肥。

所述的海藻，作为本发明的一个实施例的具体记载，为海带。

本发明再一个方面提供一种制备海藻发酵液的方法，是使用上述的细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6参与到海藻肥料的制备过程；

所述的海藻发酵液的制备方法，是将海带匀浆后，加入处于生长对数期的细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6株的菌液，混合均匀，控制温度在30-40度进行发酵72h；菌株发酵结束后，在发酵的海带浆液中添加海带质量0.5-1％的酸性蛋白酶(10万U)，搅拌均匀，控制温度在40-60度，酶解3h；酶解结束后的海带浆液过滤除渣，获得上清液，即为海藻发酵液。

本发明所提供的海藻发酵液可以用于制备有机肥料。

本发明再一个方面提供一种海藻液有机肥料，是使用上述的海藻发酵液作为原料制备的。

本发明筛选的细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6具有海藻酸裂解酶活力，其生长迅速，可以海带为原料发酵生长，降解海藻酸获得具有生物活性的小分子海藻寡糖。海藻寡糖水溶性好，比海藻酸更易于被植物吸收利用，是良好的植物生长调节物质。海藻寡糖还能提高种子发芽率、促进根系生长、增强植物抗逆性和抗病虫害能力。应用本发明的菌株制备的海藻液肥，没有使用任何酸碱试剂和有机试剂，生产过程无排放无污染，产品环境友好绿色有机，可以有效减少田间化肥的施用量，符合环保政策，有良好的社会效益和经济效益。

附图说明

图1：细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6在LB培养基上的菌落形态图。

图2：细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6在显微镜下的菌体形态图。

图3：细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6的生长曲线。

图4：细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6生长过程中海藻酸裂解酶活力变化曲线图。

图5：不同方式制备的海藻液肥状态和颜色照片图。

具体实施方式

本发明的第一个目的是提供一种细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)HD-6，已于2023年2月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.26499，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所提供的细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6用于降解海藻来制备海藻液肥。

所述的海藻，作为本发明的一个实施例的具体记载，为海带。

本发明再一个方面提供一种制备海藻液肥的方法，是使用上述的细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6参与到海藻肥料的制备过程，其一种具体的步骤如下：

(1)挑选新鲜海带过水清洗，去除其中沙粒及杂质；

(2)洗净后的海带剪切破碎，添加海带质量1-3倍的水然后研磨成浆，使粒度直径小于5mm；

(3)将海带浆液加入无菌发酵罐中，添加生长对数期的细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6(OD7-8)，混合均匀，控制温度在30-40度，发酵72h；

(4)发酵之后的海带浆液中添加海带质量0.5-1％的酸性蛋白酶(10万U)，搅拌均匀，控制温度在40-60度，酶解3h；

(5)酶解结束后的海带浆液过滤除渣，获得上清液，即为有机海藻液肥。

本发明的第二个目的是针对目前种植业中过度使用化肥造成的土壤污染、肥力下降及农作物农残等问题，提供一种环保高效的海藻液肥；所提供的海藻液肥，使用上述的细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6发酵海带制备而成。

海藻酸是海带细胞壁和细胞间质的主要成分，应用本发明的菌株发酵海带，可以有效降解海藻酸，破坏海带细胞结构，提高藻类细胞中营养物质的释放，并且工艺条件温和，避免了强碱和高温高压的破坏作用，最大限度地保留了海带中天然营养物质及植物激素等有效物质的活性。

本发明实施例中海藻酸裂解酶的测定条件如下：酶反应体系为1.8mL的1％海藻酸钠溶液(PB缓冲液，pH7.5)中加入0.2mL粗酶液，37度反应20min，加入3mL DNS试剂终止反应，沸水浴3min显色，迅速冷却后定容至25mL，540nm下测定吸光值。酶活力单位(U)定义为每分钟催化分解海藻酸钠生成1μg还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

海藻寡糖含量的测定：海藻酸裂解酶降解海藻酸形成的共轭不饱和双键在235nm下具有最大光吸收。

因此，将海带发酵液在8000rpm速度下离心10min，取1mL上清液适当稀释，在235nm处测定吸光值，以此值乘上稀释倍数表示1mL发酵液中海藻寡糖的含量。

植物生长激素的测定：吲哚乙酸、细胞分裂素、脱落酸的含量测定都用HPLC-MS/MS进行。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6的筛选

本发明所提供的细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6株的筛选检测方法如下：

1)菌种的筛选和分离纯化

海藻酸钠选择培养基配方如下：海藻酸钠5g/L，(NH4)

从腐烂的海带样品中筛选菌种，取1g样品，加入9mL无菌生理盐水中，振荡混匀5min，制成初始悬液，然后以生理盐水10倍递增逐级稀释样品。选择3-5个合适的稀释度，取100μL稀释液涂布于海藻酸钠选择培养基平板上，倒置于37度恒温培养箱内培养过夜。

挑选不同平板上生长状态良好、形态不同的菌落共8个，在海藻酸钠选择培养基平板上多次划线分离纯化得到纯培养物，并分别以HD-1～8进行命名。

2)菌株产海藻酸裂解酶活力测定

将筛选出的八株菌分别接种海藻酸钠选择培养基。取-20℃保存的菌种，以2％的接种量接种于液体海藻酸钠选择培养基中，37℃培养48h，各菌株培养12h之后每隔6h取样检测海藻酸裂解酶活力，结果如下表1所示。

表1：待筛选菌株的产海藻酸裂解酶活力数据表

由表1的结果可知，HD-1、HD-7、HD-5产酶速度较快，酶活在18h达到最高；HD-2、HD-4产酶最慢，酶活在42h达到最高；HD-3和HD-6产酶速度相仿，在24h时酶活力最高，HD-8的酶活力在30h达到最高。所有菌株中HD-6产海藻酸裂解酶活力最高，24h时可达102.12U/mL。

3)各菌株发酵海带的效果比较

将上述筛选所得八株菌分别接种液体海藻酸钠选择培养基，培养至对数生长期，然后以5％的接种量接种于海带浆液中，混合均匀，37℃发酵72h，检测发酵结束海藻液肥中的生物量和海藻寡糖的含量，结果如表2所示。

表2：待筛选菌株发酵海带效果数据表

由以上结果可知，发酵结束后菌株HD-6菌量最高，海藻寡糖含量也最高，表明该菌能最好地分解利用海带浆液，以海带为原料迅速繁殖，并产海藻酸裂解酶，降解海藻酸生成海藻寡糖。因此选择HD-6为最佳菌株，用于海带发酵制备海藻液肥的进一步研究。

4)菌株的16SrDNA鉴定

将八株菌经平板培养后，分别挑取单菌落用作PCR扩增模板。PCR反应条件为：98℃预变性5min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环，72℃终延伸10min。PCR产物测序后结果与Genbank数据库中的已知序列进行同源性比对，可知HD-1、HD-7都为枯草芽孢杆菌B.subtilis，HD-2、HD-4为屎肠球菌E.Faecium，HD-3为地衣芽孢杆菌B.licheniformis，HD-5为贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis，HD-6为细长赖氨酸芽孢杆菌L.macroides，HD-8为特基拉芽孢杆菌B.tequilensis。其中HD-6的16SrDNA的序列为SEQ ID NO：1。

最终筛选获得的菌株为细长赖氨酸芽孢杆菌L.macroides HD-6，已于2023年2月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.26499，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

图1为细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6在LB培养基上的菌落形态图，菌落呈圆形，奶油色不透明，表面光滑。图2为该菌株在显微镜下的菌体形态图，LB培养基培养24h后菌体呈细长的杆状；培养48h后镜检可见菌体一头膨大，有芽孢生成，芽孢位于菌体顶端。该菌株培养24h后进入平衡期，此时酶活力也达到最高。

实施例2：利用HD-6株发酵海带制备发酵液

利用细长赖氨酸芽孢杆菌L.macroides HD-6发酵海带制备一种海藻液肥，具体步骤如下：

(1)挑选新鲜海带过水清洗，去除其中沙粒及杂质；

(2)洗净后的海带剪切破碎，添加海带质量1倍的水然后研磨成浆(粒度直径小于5mm)；

(3)将海带浆液加入无菌发酵罐中，添加生长对数期的细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6(OD7-8)，混合均匀，控制温度在37度，发酵72h；

(4)发酵结束后的海带浆液过滤除渣，获得上清液，即为有机海藻液肥。

实施例3：利用HD-6株发酵海带制备发酵液

利用细长赖氨酸芽孢杆菌L.macroides HD-6发酵海带并添加酸性蛋白酶(河南新仰韶生物科技有限公司，10万U)制备海藻液肥，具体步骤如下：

(1)挑选新鲜海带过水清洗，去除其中沙粒及杂质；

(2)洗净后的海带剪切破碎，添加海带质量1倍的水然后研磨成浆(粒度直径小于5mm)；

(3)将海带浆液加入无菌发酵罐中，添加生长对数期的细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6(OD7-8)，混合均匀，控制温度在37度，发酵72h；

(4)发酵之后的海带浆液中添加海带质量1％的酸性蛋白酶(10万U)，搅拌均匀，控制温度在55度，酶解3h；

(5)酶解结束后的海带浆液过滤除渣，获得上清液，即为有机海藻液肥。

对比实施例1：

用单纯碱解的方式消化海带生产海藻液肥，具体步骤如下：

(1)挑选新鲜海带过水清洗，去除其中沙粒及杂质；

(2)洗净后的海带剪切破碎，添加海带质量1倍的水然后研磨成浆(粒度直径小于5mm)；

(3)将海带浆液加入无菌罐中，按海带质量与强碱质量比5:1的量添加KOH，混合均匀，控制温度在55度，保温4h；

(4)碱解结束后的海带浆液过滤除渣，获得上清液，即为海藻液肥。

对两种不同发酵工艺制备的有机海藻液肥以及对比例中单纯碱解的海藻肥中有效成分进行检测，每个样品做三个平行，分析其中海藻寡糖、植物生长激素的含量，结果如下表3所示。

表3：三种方法制备的海藻酶解液中的海藻寡糖及生长激素含量

注：实施例2只添加了细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6，实施例3添加了细长赖氨酸芽孢杆菌HD-6和酸性蛋白酶。

由以上结果可知，用本发明的细长赖氨酸芽孢杆菌L.macroides HD-6发酵海带制备海藻肥，72h之内该菌可以大量繁殖迅速产酶，有效降解海带，破坏海藻细胞，生成海藻寡糖、释放植物生长激素。实施例2、实施例3的海藻寡糖和生长激素含量明显高于对比例1。当HD-6菌与酸性蛋白酶配合使用时所得海藻液肥中海藻寡糖、植物生长激素的含量比HD-6单纯发酵更高。

将实施例2、3及对比例1降解结束后过滤剩下的残渣(即未降解完全的海带)烘干，称重后比较海带降解情况。实施例2和3的残渣质量分别为12.7％和11.2％，而对比例的残渣质量是13.1％。这说明本专利菌株发酵海带获得的海藻肥比单纯碱解方式制备的海藻肥的水溶性物质含量更高，所以残渣更少。三种制备方法中HD-6菌与酸性蛋白酶配合使用降解效果最好。

实施例3和对比例1获得的海藻液肥状态和颜色如图5所示，这表明HD-6菌与酸性蛋白酶配合使用制备的海藻肥生产条件温和，产品颜色更接近原料天然状态，而单纯碱解方式的反应更剧烈，更容易对海藻中生物活性成分造成破坏，这也与上述不同方法制备的海藻肥中有效成分的检测结果相符合。

综上可知，本发明所筛选的菌株可对海带进行高效降解，且保留其中有效活性物质，而传统强碱处理对海带中有效活性物质的破坏较大，海藻寡糖和植物激素的含量都远低于本发明菌株发酵处理的结果。