一种H7N9亚型禽流感重组毒株、疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及禽流感疫苗技术领域，更具体地，涉及一种H7N9亚型禽流感重组毒株、疫苗及其应用。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)流行至今，频繁爆发疫情，以高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)危害性更为严重，给世界养禽业造成了巨大的经济损失。其中H7N9亚型禽流感病毒于2013年首次在中国出现，并在2016年发现该病毒发生变异，从低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza，LPAI)中突变成了高致病性禽病毒(HPAI)，显著提高了对家禽的致病力，这给我国养殖业带来了严重的威胁。

历史上，在所有AIV亚型中，只有H5和H7具有在切割位点获得碱性氨基酸的HA，这种现象将这些病毒从低致病性转化为高致病性。在2016年下半年开始，新出现了在HA的切割位点具有多个基本基序的H7N9病毒，如PKRKRTA(R/G)，PKGKRTA(R/G)和PKGKRIA(R/G)。系统发育分析表明，这些HPAIV的HA和NA序列相似性较高，但内部基因已与H7N9或H9N2低致病性禽禽流感病毒进行了复杂的重组，并且多种基因型的重组病毒在家禽中循环传播。

疫苗免疫仍是目前防控流感的有效手段，由于禽流感病毒变异快、危害强，疫苗研制周期相对较长，因此加快疫苗研发速度，获得更加高效的疫苗意义重大。中国专利CN113025653A公开了一种H7N9禽流感重组病毒及疫苗，其是以高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株A/Chicken/Liaoning/19155/2019的改造后的ΔHA基因、NA基因与D7株的六个基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS一起拯救出重组病毒并制备灭活疫苗。然而由于禽流感病毒变异快、危害强，因此需要更多针对不同H7N9亚型禽流感毒株的疫苗。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种新的H7N9亚型禽流感重组毒株。

本发明的第二个目的在于提供一种新的H7N9亚型禽流感疫苗。

本发明的第三个目的在于提供所述H7N9亚型禽流感重组毒株或H7N9亚型禽流感疫苗的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种H7N9亚型禽流感重组毒株，是由高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株E2改造后的ΔHA基因与其内部的七个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS构成；所述改造后的ΔHA基因序列如SEQ ID NO：9所示，所述亲本株E2的七个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～3、5～8所示；所述高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株E2为A/Chicken/Northeast China/19854-6/2019。

本发明通过修饰高致病性H7N9亚型禽流感病毒E2株HA基因的裂解位点(由PEVPKRKRTTR/GLF改造为PEVPKGR/GLF)，随后利用反向遗传学技术，以高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株改造后的ΔHA基因与其七个内部基因共转染拯救出重组病毒株。

本发明还提供所述H7N9亚型禽流感重组毒株的制备方法，是将高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株E2改造后的ΔHA基因与其内部的七个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS一起拯救出重组病毒，即得。

进一步地，所述方法包括分别构建含H7N9亚型禽流感流行毒株E2七个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的七个重组质粒，构建含SEQ ID NO：9所述序列的改造后ΔHA基因的重组质粒，再将上述八种重组质粒混合，并与转染试剂加入到细胞中，培养后获得H7N9亚型禽流感重组毒株。

进一步地，所述方法具体包括如下步骤：

S1.分别构建表达H7N9亚型禽流感流行毒株E2七个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的重组质粒；所述七个内部基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的核苷酸序列依次如SEQID NO：1～3、5～8所示；

S2.构建表达SEQ ID NO：9所述序列的改造后ΔHA基因的重组质粒；

S3.将步骤S1中表达H7N9亚型禽流感流行毒株E2 PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的七个重组质粒与步骤S2中表达改造后ΔHA基因的重组质粒混合，并与转染试剂加入到细胞中，培养后获得H7N9亚型禽流感重组毒株。

进一步地，所述细胞为293T细胞。

进一步地，所述重组质粒为pHW2000-PB2，pHW2000-PB1，pHW2000-PA，pHW2000-ΔHA，pHW2000-NP，pHW2000-NA，pHW2000-M，pHW2000-NS。

作为一种优选地实施方式，本发明还提供所述H7N9亚型禽流感重组病毒的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)重组病毒HA片段的扩增

根据H7N9亚型高致病性禽流感病毒E2株HA片段序列设计删除HA基因裂解位点的分段引物，分段扩增HA，并利用融合PCR方法对HA基因的连续碱性氨基酸进行删减，改造后的HA命名为ΔHA。ΔHA的基因序列如SEQ ID NO：9所示。

(2)目的质粒的构建

将扩增出的E2株的7个基因片段(PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS)及删除碱性裂解位点的ΔHA连接到反向遗传载体pHW2000，经测序验证，阳性质粒分别命名为pHW2000-PB2，pHW2000-PB1，pHW2000-PA，pHW2000-ΔHA，pHW2000-NP，pHW2000-NA，pHW2000-M，pHW2000-NS。

(3)重组病毒的拯救

将改造后ΔHA基因的质粒与E2株7个内部基因质粒混合，并与转染试剂一起加入到293T细胞中，收取转染细胞及其上清液，接种9～11日龄SPF鸡胚。60h后，收获有血凝活性的尿囊液，通过PCR以及测序鉴定确认获得的病毒。

本发明还提供所述H7N9亚型禽流感重组毒株在制备H7N9亚型禽流感疫苗中的应用。

本发明还提供一种H7N9亚型禽流感疫苗，包括免疫量的上述任一所述H7N9亚型禽流感重组毒株抗原。

本发明还提供所述H7N9亚型禽流感重组毒株、所述H7N9亚型禽流感疫苗在制备预防和治疗H7亚型禽流感病毒的药物中的应用。

进一步地，所述H7亚型禽流感病毒为H7N9亚型禽流感病毒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种H7N9亚型禽流感重组毒株，所述H7N9亚型禽流感重组毒株由高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株E2改造后的HA基因与其内部的七个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS构成；所述重组病毒株能在鸡胚上保持良好的复制能力。利用该重组病毒研制出抗原匹配性和安全性出色的疫苗E2-Δ可诱导家禽产生高水平的抗体和良好的保护效果，为防控禽流感提供了有效的工具。

附图说明

图1为本发明H7N9亚型禽流感灭活疫苗的构建及应用流程图。

图2为本发明质粒构建及病毒重组示意图。

图3为本发明中供体毒株HA基因PCR分段扩增结果图。泳道1为2000bp DNALadder，泳道2为供体毒株的HA的上段；泳道4为供体毒株的HA的下段；泳道3，5为阴性对照

图4为本发明中供体毒株HA-ΔPCR扩增结果图。

图5为本发明中修饰后的HA基因的裂解位点与原序列对比的氨基酸示意图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

D7病毒8质粒反向遗传系统由国家禽流感专业实验室(广州)构建并保存。

A/Chicken/Northeast China/19854-6/2019(H7N9，E2株)由国家禽流感专业实验室(广州)分离鉴定并保存。

本发明H7N9亚型禽流感灭活疫苗的构建及应用流程图如图1，具体包括如下实施方式。

实施例1H7N9亚型禽流感重组毒株的构建

1、病毒RNA的提取和反转录

参照飞捷试剂盒的操作说明书，在生物安全柜内提取病毒总RNA，标记RNA样品名称并测定RNA浓度。参照Takara公司提供的反转录酶(M-MLV)的使用说明，使用12-unit反转录引物进行反转录，引物序列为：AGCAAAAGCAGG(5’～3’)，进行反转录得到cDNA。

2、引物设计

根据E2-Δ株的HA序列设计改造HA基因裂解位点的分段引物，具体序列如下，其中带下划线处为限制性内切酶BsmBI的识别序列。

E2-HA-F：

5’-TGAGGTTCCAAAGGGAAGAGGCCTATTTGGTG-3’

E2-HA-R：

5’-CACCAAATAGGCCTCTTCCCTTTGGAACCTCA-3’

Bm-PB2-1F：5’-TATT

Bm-PB2-2341R：5’-ATAT

Bm-PB1-1F：5’-TATT

Bm-PB1-2341R：5’-ATAT

Bm-PA-1F：5’-TATT

Bm-PA-2233R：5’-ATAT

Bm-HA-1F：5’-TATT

Bm-HA-1778R：

5’-ATAT

Bm-NP-1F：5’-TATT

Bm-NP-1565R：

5’-ATAT

Ba-NA-1F：5’-TATT

Ba-NA-1413R：

5’-ATAT

Bm-M-1F：5’-TATT

Bm-M-1027R：

5’-ATAT

Bm-NS-1F：5’-TATT

Bm-NS-890R：5’-ATAT

3、HA片段的修饰扩增及纯化

利用高保真DNA聚合酶，采用分段引物扩增的方式对E2株的HA片段进行分段PCR修饰扩增及融合PCR扩增；扩增完成后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳。将条带大小正确的胶块切下，使用Gel Extraction Kit(Omega)，参照说明书进行胶回收，扩增结果如图3所示，成功得到供体毒株的HA的上段和供体毒株的HA的下段。将胶回收产物用融合PCR扩增，扩增结果如图4所示，显示HA的上段和HA的下段连接成功。扩增产物送测序，使用Seqman对测序结果进行拼接，通过美国国家生物信息中心NCBI(National Center forBiotechnology Information)流感病毒数据库进行序列比对，并保存序列。经测序鉴定后与原序列比对，确定测序结果正确，结果如图5所示，HA基因的裂解位点由PEVPKRKRTTR/GLF改造为PEVPKGR/GLF，得到ΔHA基因。同时，利用高保真DNA聚合酶，对E2株的PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS 7个片段进行扩增，电泳，胶回收。

4、目的质粒的构建、筛选及纯化

如图2所示，将步骤3测序结果正确的胶回收产物分别与pHW2000双向表达载体分别使用限制性内切酶进行酶切，并将目的片段与载体的酶切产物用T4连接酶连接。转化DH5α感受态细胞。

1.5ml EP管内加入500μL含氨苄抗性的LB肉汤培养基，挑取单菌落加至EP管内，置于37℃摇床，200rpm/min，4h～6h。待浑浊后进行菌液PCR鉴定。将条带大小正确的菌液取100μL送测序。测序结果正确的菌液扩大培养，参照质粒小提中量试剂盒(天根)说明书提取质粒，测定DNA浓度，质粒置于-20℃保存。得到构建好的8个质粒。

5、重组病毒E2-Δ的拯救及鉴定

293T细胞扩大培养，接种于12孔板，待其生长至70％～80％后，进行转染。将构建好的8个质粒，以每个质粒300ng，共2.4μg质粒加到150μL Opti-MEM培养基中轻轻混匀，同时将4.8μL PEI加到150μL Opti-MEM培养基中，室温静置5min后，将两者混匀，室温静置20min。12孔板从培养箱中拿出，用适量无菌PBS洗涤细胞1次，缓慢加入混合液，置于37℃5％ CO2细胞培养箱孵育2h后换液。换液为1mL含有1％ BSA，0.05μg/mL TPCK的DMEM细胞培养基，放置37℃，5％ CO2细胞培养箱内培养48h培养48h后的细胞置于-80℃，反复冻融两次后，接种于9～11日龄SPF鸡胚中，每枚胚接种0.2ml，石蜡封孔，37℃培养，每隔12h照胚一次，直至72h。用HA血凝试验法测定鸡胚尿囊液血凝活性及效价，收取病毒液并在鸡胚中进行传代。取第二代有血凝活性的尿囊液提取RNA，反转录，通过PCR测序验证重组病毒拯救成功，得E2-ΔHA重组病毒株(E2-Δ)。

另外，按照上述方法再分别制备另外两种重组病毒E2-WT及D7-E2，以比较不同的载体骨架得到的疫苗的免疫保护效果差异。其中，E2-WT由高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株(E2株)HA基因和亲本株的七个内部基因PB2、PB1、PA、NA、NP、M和NS构成。D7-E2由高致病性H7N9亚型禽流感流行毒株(E2株)改造后的HA基因和NA基因及D7的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS构成。所述改造后的HA基因序列如SEQ ID NO：9所示；所述的亲本毒株八个内部基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～8所示；所述的D7八个内部基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的核苷酸序列参见中国专利CN113025653A。

实施例2重组病毒制备疫苗

(1)抗原灭活

将重组病毒E2-Δ、E2-WT及D7-E2用无菌PBS倍比稀释10

(2)灭活检验

将灭活24h后的尿囊液接种11日龄鸡胚，每枚鸡胚各接种0.2mL，置于37℃恒温培养箱中培养，定时照胚，观察鸡胚死亡情况。37℃恒温培养72h后，用HA实验测定尿囊液效价。

(3)疫苗制备

灭活抗原中加入终浓度为3.5％的吐温80(5mL抗原+700μL吐温80)，涡旋混匀。配置油相，取Marcol-52白矿油94份，加入6份司本-80，充分混匀，高压灭菌后备用。取10mL油相10000rpm/min乳化5min，将抗原吐温混合物加入油相中，17000rpm/min～20000rpm/min乳化7min，当混合液乳化至呈均匀乳白色，对其进行剂型检验，取少量样品悬空滴加于水中，呈不分散的油包水样说明乳化完全，制备得到E2-WT、E2-Δ及D7-E2疫苗。

实施例3疫苗攻毒保护及血清交叉血凝抑制试验

(1)攻毒保护实验

为了验证E2-WT、E2-Δ及D7-E2疫苗的保护效力，将30只21～28日龄SPF鸡随机分成3组，每组各10只鸡，其中2组实验组，1组对照组，疫苗组颈部皮下注射0.3mL灭活疫苗，对照组颈部皮下注射0.3mL无菌PBS，在免疫后的第3周，分别对疫苗组和PBS对照组的鸡进行翅静脉采血，分离血清，用血凝抑制实验检测抗体水平。制备4个红细胞凝集单位的抗原并且经复核滴定后，用于HI试验。标记“V”型96孔微量板，具体操作步骤参照国家流感中心标准操作规程的禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测进行HI试验，观察红细胞凝集现象进行结果判定并记录。免疫21天后，进行攻毒保护试验，攻毒方式为滴鼻点眼，毒株为A/Chicken/Northeast China/19854-6/2019。每只鸡的攻毒剂量为200μL 10

表1攻毒保护情况

攻毒保护试验结果如表1所示，显示E2-Δ组疫苗对21～28日龄的SPF鸡具有最好的免疫效果，HI效价达到能够提供有效保护的抗体滴度。免疫鸡均存活，且精神状态、食欲皆良好，无死亡，对照组鸡出现精神沉郁、食欲不振、脚鳞出血，鸡冠肿大发紫、肿头肿脸等症状，并在攻毒后天第3天开始死亡，至第5天全部死亡。免疫组在第5天采集的免疫组SPF鸡的咽拭子和泄殖腔拭子中的病毒分离率为阴性。

(2)血清交叉血凝抑制试验(HI试验)

将免疫灭活疫苗21d后的鸡阳性血清，分别以下H7N9毒株进行血清交叉实验：A/Chicken/East China/H7SD12/2019(以下简称SD12)、A/Chicken/East China/G285/2019(以下简称G285)、A/Chicken/Northeast China/19376-E5/2019(以下简称E5)。实验结果表明，灭活疫苗免疫的鸡血清与SD12、G285、E5三株H7N9病毒反应的效价均在9log2。根据中国兽药典所示，禽流感疫苗的HI效价≥4log2，证明该疫苗可以诱导机体产生有保护效果的抗体。

表2HI交叉试验结果

综合表1和表2结果可知，显示E2-Δ组疫苗的疫苗效果最好，可使机体产生足够的抗体以抵抗高致病性H7N9亚型禽流感流行株的感染，用于防控H7亚型禽流感。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。