一种Pfu DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和酶工程领域。更具体地，涉及一种Pfu DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

Pfu DNA聚合酶来自于激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，其编码基因全长2328bp，蛋白质分子量为90kDa。Pfu DNA聚合酶包含两个功能：一是5’→3’的核酸聚合活性，能以DNA单链为模板，以dNTP为底物合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链；二是具有3’→5’的外切酶活性，能纠正PCR过程中错误掺入的核苷酸，即具有高保真性。Pfu DNA聚合酶主要应用于高保真扩增DNA、长片段PCR扩增以及复杂模板扩增，在分子诊断以及法医学鉴定等领域发挥着重要的作用。但是野生型Pfu DNA聚合酶具有延伸速率慢、延伸能力差、抗抑制能力弱等缺陷。

因此，需要对野生型Pfu DNA聚合酶进行改造得到一种Pfu DNA聚合酶突变体，以解决上述问题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种能快速扩增、长片段PCR持续扩增、抗抑制能力和热稳定能力强的Pfu DNA聚合酶突变体。

本发明的另一个目的在于提供上述Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明首先提供了一种Pfu DNA聚合酶突变体，所述Pfu DNA聚合酶突变体在野生型Pfu DNA聚合酶的羧基端融合一个dsDNA结合蛋白Sto7和引入多个点突变，所述点突变用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：M247R、A408S和I478K。

进一步，所述野生型Pfu DNA聚合酶为由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

进一步，所述Pfu DNA聚合酶突变体为由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

编码上述Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内。

进一步，所述编码上述Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

包含上述核苷酸序列的重组表达质粒或重组细胞也在本发明的保护范围之内。

在本发明具体的实施方式中，所述重组表达质粒为pET28a-PfuMut。具体的，所述pET28a-PfuMut是在pET28a的NdeI和BamHI之间插入如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，且保持pET28a其他序列不变获得的。

进一步，所述重组细胞的宿主细胞是改造过的BL21大肠杆菌。在本发明具体的实施方式中，所述宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞。

本发明进一步公开了上述Pfu DNA聚合酶突变体，上述核苷酸序列，或，上述重组表达质粒或重组细胞在如下任一中的应用：

b1)在生物技术领域中的应用；

b2)在DNA重组技术领域中的应用；

b3)在PCR领域中的应用。

进一步，所述应用可以为各类DNA重组技术中的PCR扩增、DNA测序、DNA建库以及样本直扩PCR中。

本发明进一步还公开了上述Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

c1)构建包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的重组表达质粒；

c2)将蛋白表达质粒转化进入宿主细胞，诱导表达，获得菌体；

c3)破碎菌体，离心后获得上清，蛋白质沉淀，获得粗蛋白液；

c4)将粗蛋白液纯化、透析后获得Pfu DNA聚合酶突变体。

进一步，所述蛋白质沉淀包括PEI沉淀、硫酸铵沉淀；所述纯化包括Ni柱、Q柱和SP柱纯化。

本发明的有益效果如下：

本发明Pfu DNA聚合酶突变体与野生型的Pfu DNA聚合酶相比，在羧基端融合一个dsDNA结合蛋白Sto7和引入了多个点突变(M247R、A408S和I478K)，该突变体可以在原核宿主进行过表达并通过亲和层析以及离子交换层析纯化获得大量蛋白。本发明Pfu DNA聚合酶突变体具有快速扩增能力、长片段PCR持续扩增能力、抗抑制能力以及热稳定能力强的优势，可以应用于各类DNA重组技术领域中的PCR扩增、DNA测序、DNA建库以及样本直扩PCR中。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明Pfu DNA聚合酶突变体SDS-PAGE胶图。

图2为本发明Pfu DNA聚合酶突变体(Pfu Mut)和野生型Pfu DNA聚合酶(Pfu WT)的快速扩增能力检测电泳图。

图3为本发明Pfu DNA聚合酶突变体(Pfu Mut)和野生型Pfu DNA聚合酶(Pfu WT)的长片段PCR持续扩增能力检测电泳图。

图4为本发明Pfu DNA聚合酶突变体(Pfu Mut)和野生型Pfu DNA聚合酶(Pfu WT)的抗抑制能力检测电泳图。

图5为本发明Pfu DNA聚合酶突变体(Pfu Mut)和野生型Pfu DNA聚合酶(Pfu WT)的热稳定性检测电泳图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1 Pfu DNA聚合酶突变体的设计和构建

1、Pfu DNA聚合酶突变体的设计

为提高野生型Pfu DNA聚合酶的聚合活性，本发明通过在其羧基端融合一个dsDNA结合蛋白Sto7以及引入多个点突变来提高Pfu DNA聚合酶延伸速率、长片段PCR持续扩增、抗抑制能力以及热稳定能力。关于点突变，首先对野生型Pfu DNA聚合酶蛋白结构进行分析，247位氨基酸M与模板/引物3’-OH末端倒数第二个碱基有直接相互作用，因此M247突变为R(即M247R)形成氢键来提高底物结合的稳定性，从而提高聚合酶的聚合活性；进一步对B族DNA聚合酶进行序列比对以及sequence logo分析，将不同于保守序列的A408和I478突变为保守氨基酸S408和K478(即A408S、I478K)。

2、Pfu DNA聚合酶突变体重组表达质粒的构建

全基因合成Pfu DNA聚合酶突变体重组表达质粒pET28a-PfuMut，即在pET28a的NdeI和BamHI之间插入了编码Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列，且保持pET28a其他序列不变；所述Pfu DNA聚合酶突变体在野生型Pfu DNA聚合酶(即氨基酸序列SEQ ID NO.3所示)的羧基端融合一个dsDNA结合蛋白Sto7和引入三个点突变M247R、A408S、I478K；具体的，所述Pfu DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码获得。

实施例2 Pfu DNA聚合酶突变体的诱导表达和纯化

一、将实施例1得到的Pfu DNA聚合酶突变体重组表达质粒转化进入宿主感受态细胞，并诱导表达目的蛋白。

具体步骤如下：

1)取BL21(DE3)感受态细胞冰上融化。

2)取1ul重组表达质粒pET28a-PfuMut加入融化的BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min。

3)冰浴后的感受态细胞放入42℃水浴锅中热激45s，然后冰上放置2min。

4)取500ul LB液体培养基加入到步骤3)得到的细胞中，37℃摇床中220rpm孵育45min。

5)取200ul步骤4)孵育后的细胞涂布在卡那霉素平板上，37℃恒温培养箱静置培养过夜。

6)挑取1个过夜培养卡那霉素平板上的单克隆加入到含有50ug/ml卡那霉素的20ml LB培养基中，放入37℃摇床中220rpm培养7hr。

7)将20ml步骤6)得到的培养物加入到含有50ug/ml卡那霉素的1L LB培养基中，放入37℃摇床中220rpm培养2hr，OD

8)将步骤7)诱导表达结束的菌液进行离心收集菌体，8000rpm，15min，4℃，称重菌体重量。

二、通过PEI沉淀、硫酸铵沉淀后，进行Ni柱、Q柱和SP柱等纯化方法，得到纯度较高的Pfu DNA聚合酶突变体。

具体步骤如下：

1、沉淀处理

1)用50ml PBS buffer重悬菌体后离心，12000rpm，10min，4℃，弃上清得到菌体。

2)用80ml lysis buffer重悬菌体，加入终浓度为1mM PMSF。

3)用高压均质机破碎步骤2)加入PMSF的菌体重悬液。

4)将步骤3)破碎液离心，12000rpm，30min，4℃，弃沉淀得上清。

5)上清放入75℃水浴锅中处理30min，之后离心12000rpm，30min，4℃，弃沉淀得上清。

6)上清中加入终浓度为0.3％ PEI进行核酸沉淀，冰浴30min后离心12000rpm，30min，4℃，弃沉淀得上清。

7)上清在搅拌过程中慢慢加入39g硫酸铵粉末，饱和浓度为60％，硫酸铵全部溶解后，4℃冰箱静置2hr进行蛋白沉淀。

8)步骤7)沉淀样品离心，12000rpm，30min，4℃，弃上清得蛋白沉淀。

9)蛋白沉淀用20ml Ni-binding buffer重悬，并用0.45uM滤头过滤，得到过滤后的蛋白样品(粗蛋白液)。

2、Ni柱纯化

1)将5ml Ni预装柱连入AKTA系统，A、B泵分别放入过滤抽气后的Ni-bindingbuffer和Ni-elute buffer，并泵洗AKTA系统。

2)用Ni-binding buffer平衡Ni柱。

3)将过滤后的蛋白样品上样Ni柱。

4)用Ni-elute buffer梯度洗脱目的蛋白(2ml/min流速，30min洗脱时长，0-100％B泵梯度)。

5)收集目标蛋白峰，得到Ni柱洗脱的蛋白样品。

3、Q柱纯化

1)将5ml Q预装柱连入AKTA系统，A、B泵分别放入过滤抽气后的Q-A buffer和Q-Bbuffer，并泵洗AKTA系统。

2)用Q-A buffer平衡Q柱。

3)将Ni柱洗脱的蛋白样品上样Q柱。

4)收集Q柱流穿蛋白峰即为目标蛋白峰，得到Q柱流穿的蛋白样品。

4、SP柱纯化

1)将5ml SP预装柱连入AKTA系统，A、B泵分别放入过滤抽气后的SP-A buffer和SP-B buffer，并泵洗AKTA系统。

2)用SP-A buffer平衡Q柱。

3)将Q柱流穿的蛋白样品上样SP柱。

4)用SP-B buffer梯度洗脱目的蛋白(2ml/min流速，30min洗脱时长，0-100％ B泵梯度)。

5)收集目标蛋白峰，获得蛋白样品。

将蛋白样品透析至Storage Buffer(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM KCl，1mMDTT，0.1mM EDTA，50％ Glycerol)，SDS-PAGE胶检测结果如图1所示。从图中可以看出，本实施例得到的蛋白样品的大小为98.7kDa，与预期Pfu DNA聚合酶突变体的大小一致，表明本实施例最终得到的蛋白样品为Pfu DNA聚合酶突变体。进一步，测序验证正确。

实施例3 Pfu DNA聚合酶突变体快速扩增能力

以HeLa gDNA为模板，使用实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体和野生型Pfu DNA聚合酶蛋白进行PCR扩增，测试其快速扩增能力。设置延伸时间分别为12kb/min和1kb/min，扩增产物为1kb和4.5kb。

其中，PCR扩增的程序如下：

PCR扩增的体系如下：

测试结果如图2所示，与野生型Pfu DNA聚合酶相比，实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体能以12kb/min的速度扩增1kb和4.5kb的PCR产物，具备了快速扩增能力。

实施例4 Pfu DNA聚合酶突变体长片段PCR持续扩增能力

以质粒为模板，使用实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体和野生型Pfu DNA聚合酶蛋白进行PCR扩增，测试其长片段PCR持续扩增能力。设置延伸时间分别为12kb/min和1kb/min，扩增产物为10kb和15kb。

其中，PCR扩增的程序如下：

PCR扩增的体系如下：

测试结果如图3所示，与野生型Pfu DNA聚合酶相比，实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体能以12kb/min的速度扩增10kb和15kb的PCR产物，具备了持续扩增长片段产物的能力。

实施例5 Pfu DNA聚合酶突变体的抗抑制能力

以人血液为模板，使用实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体和野生型Pfu DNA聚合酶蛋白进行PCR直扩，测试其抗抑制能力。设置延伸时间分别为12kb/min和1kb/min，扩增产物为408bp和633bp。

其中，PCR直扩的程序如下：

PCR直扩的体系如下：

测试结果如图4所示，与野生型Pfu DNA聚合酶相比，实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体能以人血液为模板进行直扩，获得408bp和633bp的PCR产物，具备了抗抑制能力。

实施例6 Pfu DNA聚合酶突变体的热稳定性

以HeLa gDNA为模板，使用实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体和野生型Pfu DNA聚合酶蛋白进行PCR热稳定性测试，延伸时间分别为12kb/min和1kb/min。设置98℃孵育0min，30min和240min三个时间，然后进行PCR扩增，扩增产物为600bp。

其中，PCR扩增的程序如下：

PCR扩增的体系如下：

测试结果如图5所示，与野生型Pfu DNA聚合酶相比，实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体在98℃孵育240min后仍然能够扩增出600bp的PCR产物，具备了更强的热稳定性。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。