人参皂苷CK在制备防治免疫性肝炎的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域技术领域，更具体的说是涉及人参皂苷CK在制备防治免疫性肝炎的药物中的应用。

背景技术

肝脏是人体必需的消化器官，负责多种营养摄入的代谢，是各种化学反应最活跃的地方。然而，近年来由于滥用药物、酗酒和病毒感染等原因，肝损伤的发生率有所上升。自身免疫性肝炎(AIH)是一种病因和发病机制未知的严重免疫介导的肝脏疾病，可发生在儿童和所有年龄段的成人。如果不进行适当的治疗，AIH可能发展为肝硬化甚至肝细胞癌。AIH的临床症状为血清丙氨酸(ALT)或天冬氨酸(AST)转氨酶水平显著升高，肝脏内有异常丰富的炎症细胞浸润及肝坏死等。

目前，自身免疫性肝炎的药物治疗中，免疫抑制剂-激素是使用最为广泛的治疗方式，包括强的松或泼尼松龙联合硫唑嘌呤，临床疗效良好。然而，这些治疗方式所伴随的副作用也较为普遍，如体重增加、情绪不稳定和骨质疏松症，这提醒人们迫切需要开发更安全有效的AIH疗法。

在众多炎症调控信号通路中，NF-κB信号通路对转录因子、炎症细胞因子的产生甚至细胞存活具有调节作用，而Toll样受体(TLRs)的过度表达可激活NF-κB，从而启动免疫应答反应。因此，TLR4/NF-κB通路在免疫相关疾病的发生发展中起着至关重要的作用。

近年来，从天然产物中提取的各种植物化学物质已被探索证明具有抗氧化、抗炎等多种生物活性。其中，人参皂苷作为人参、西洋参、三七等五加科植物中的主要生物活性成分，在过去的几十年里，其生物学活性在实验水平和临床研究中得到了广泛的验证。研究报道人参皂苷CK由于其良好的抗炎和抗氧化活性，因此对肝损伤有较强的保护作用。基于此，本发明的技术方案提出，人参皂苷CK通过调节TLR4/NF-κB通路介导的炎症反应改善自身免疫性肝炎的发生与发展。

中国发明专利CN202010525824.6公开了人参皂苷CK在抗结肠癌药物中的应用，中国发明专利CN 202010525824.6公开了人参皂苷CK在作为降脂减肥药物中的应用，中国发明专利CN 201510493410.9公开了人参皂苷CK与Rh1单体及其组合物在改善非酒精性脂肪性肝纤维化与胰岛素抵抗药物中的应用，中国发明专利CN 201810482539.3则公开一种人参总次苷组合物、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1以及人参皂苷CK可用于制备利尿剂或利尿保健品，解决了现有技术中的利尿剂反应不良以及利尿剂抵抗的技术问题。目前尚未见到人参皂苷CK用于治疗免疫性肝炎的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明公开了一种人参皂苷CK在制备防治免疫性肝炎的药物中的应用。

进一步，所述的人参皂苷CK为所述药物中的主要或唯一有效成分。

进一步，所述免疫性肝炎为伴刀豆蛋白A所诱导的自身免疫性肝炎。

进一步，所述人参皂苷CK为从人参、三七或西洋参中提取的Rb1经过蜗牛酶转化得到，所述人参皂苷CK的纯度≥95％。

进一步，所述药物为人参皂苷CK及药用辅料及其他辅助性成分组成的组合物。

进一步，所述药物为口服制剂，剂型包括片剂、、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、散剂中的一种，其中片剂包括普通片剂、分散片、咀嚼片、及肠溶片。

进一步，所述人参皂苷CK的人单次用量为10-100mg/kg。

进一步，所述药物为通过TLR4/NF-κB信号通路改善免疫性肝炎的药物。

在本发明中，所述预防和/或治疗效果为通过改善肝脏内转氨酸水平、维持肝脏正常结构、降低肝脏炎症因子及炎性细胞浸润、改善肝脏过氧化损伤中的一种或多种来实现。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明首次通过实验证明，人参皂苷CK预处理可以改善ConA诱导的小鼠免疫性肝炎，降低转氨酶水平及炎症因子的表达，并改善肝脏炎性细胞浸润，缓解肝脏过氧化损伤及细胞凋亡，可见人参皂苷用于免疫性肝炎治疗的效果明确，且无不良影响。

2.本发明为人参皂苷的应用提供了更为广泛的选择，也为免疫性肝炎的治疗提供了一种新的、安全有效的预防及治疗方式，具有良好的社会与经济效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为给药期间小鼠体重及实验结束后小鼠肝、脾相对质量；

图2为肝、脾组织形态及H&E染色；

图3为各组小鼠血清中ALT、AST及ALP水平；

图4为人参皂苷CK对肝脏炎症因子水平的影响；

图5为人参皂苷CK对肝脏TLR4 mRNA水平的影响；

图6为人参皂苷CK对IκBα磷酸化的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1人参皂苷CK制剂的制备

(1)片剂：取人参皂苷CK 72g,糊精13g，微晶纤维素14g，混合均匀后，用喷壶均匀喷洒乙醇将粉末制成颗粒状，再加入硬脂酸镁1g，混合均匀后进行压制即得。

(2)颗粒剂：取人参皂苷CK 100g,糊精300g，蔗糖400g，混合均匀后用喷壶均匀喷洒酒精将粉末制成颗粒状，分装入包装袋内，每袋2g。

(3)软胶囊剂：取人参皂苷CK 100g,水600mL，卵磷脂100mL，PEG40050mL,聚维酮25mL，抗坏血酸10g,加热搅拌混合均匀，待温度降至常温后，通过滴至法将药液灌注至明胶外壳中，制备得到人参皂苷CK软胶囊。

(4)口服液：取人参皂苷CK 50g，聚山梨酯20g，甜菊糖苷2g，山梨酸盐1g,羧甲基纤维素钠5g，甘油20g，加纯化用水至1L，搅拌使其混合均匀后，灌装至聚酯瓶中，每瓶10mL，即得。

实施例2人参皂苷CK对自身免疫性肝炎的治疗效果

(1)自身免疫性肝炎模型的建立：40只ICR雄性小鼠，4-6周龄，体重18-20g，适应性喂养一周后，按体重将其分为正常组，模型组以及人参皂苷CK低剂量与高剂量组，每组10只动物，正常组及模型组每天灌胃给予生理盐水，人参皂苷CK治疗组分别按20mg/kg、40mg/kg的剂量对小鼠进行灌胃处理，给药一周后，将ConA用生理盐水溶解并过滤除菌后，除正常组外，其余每只小鼠按15mg/kg ConA实施尾静脉注射，正常组则注射等剂量生理盐水。18小时后，将小鼠处死并采血并收集肝脏和脾脏组织保存用于后续检测。

结果：人参皂苷CK给药一周内，小鼠体重未出现明显下降，说明人参皂苷CK对小鼠本身无明显毒性，而在ConA诱导后，模型组小鼠体重下降明显，CK组则相对有所缓解，说明CK可部分抵消ConA的毒性。另外，模型组肝脏颜色深红，体积减小，呈现出损伤状态，而CK组中肝脏形态有所恢复，说明人参皂苷CK对ConA诱导的肝脏损伤有缓解作用。再者，模型组脾脏充血，体积膨胀且颜色暗黑，而CK组脾脏形态较为正常，提示人参皂苷CK对免疫功能的调节作用。结果见图1、2和表1。

表1各组小鼠体重及肝、脾绝对质量

(2)肝脏组织H&E染色：将固定好的肝脏切成10mm×3mm的组织块后进行包埋切片，将切片固定于载玻片上，进行常规H&E染色，光学显微镜下观察并记录肝脏病理变化。

结果：正常组肝脏肝细胞排列紧密有序，而模型组肝脏出现明显的坏死，细胞核固缩，肝索放射状排列消失，而CK低剂量组小鼠的肝脏坏死面积明显减小，高剂量组肝脏组织形态恢复正常，说明CK可抑制ConA诱导的肝脏组织坏死现象。结果见图2。

(3)血清生化指标的检测：将收集的血液离心后分离得到血清，血清样品采用AST、ALT以及ALP试剂盒进行分析，检测血清中酶的水平。

结果：ConA诱导后，血清中转氨酶水平急剧上升，说明ConA对肝脏功能造成了严重的损伤，而CK预处理组中血清转氨酶水平相比模型组有明显下降，说明CK对ConA造成的肝功能损伤有明显的缓解作用。结果见图3。

(4)肝脏炎症因子的表达情况：将收集的肝脏组织经冷冻研磨后，加入生理盐水并离心，得到的上清液经TNFα、IL-6ELISA试剂盒进行检测，分析肝脏中几种炎症因子的表达情况。

结果：数据表明，相比与正常组，ConA单独处理的模型组肝脏炎症因子水平明显上升，说明肝脏出现了严重的炎症反应，CK预处理组肝脏炎症因子表达水平则有所回落，表明CK对肝脏炎症有改善作用。结果见图4。

(5)RT-qPCR检测肝组织中炎症相关基因及TLR4的表达情况：称取冻存的肝脏组织50mg，液氮冷冻研磨后，加入Trizol试剂提取肝脏总RNA，采用反转录试剂盒合成cDNA后，以β-Actin为内参，进行扩增，PCR反应结束后读取CT值，计算2-ΔΔCT分析TLR4基因在各组中的表达情况。

结果：ConA诱导的模型组小鼠肝脏中TLR4的mRNA水平明显升高，CK处理组TLR4的表达水平则有所下降，说明CK可抑制肝脏TLR4信号的活性。结果见图5。

(6)WB检测肝脏组织中IκBα的磷酸化情况：称取冻存的肝脏组织50mg，加入RIPA裂解液进行裂解，离心后取上清即为总蛋白溶液，一部分采用BCA蛋白定量试剂盒进行总蛋白定量，另一部分按照4：1的比例加入上样缓冲液，混合均匀后煮沸5min，进行SDS-PAGE和转膜、抗体孵育、显影并记录结果。

结果：ConA诱导的模型组小鼠肝脏中IκBα的磷酸化水平显著上调，CK处理组p-IκBα的表达水平则相对降低，说明CK可通过抑制IκBα的磷酸化来抑制NF-κB信号通路的活性。结果见图6。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。