动物源性食品中兽药残留的检测方法

技术领域

本申请涉及兽药残留检测的技术领域，特别涉及一种动物源性食品中兽药残留的检测方法。

背景技术

恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星、环丙沙星属于喹诺酮类抗生素药物是一种广谱抗生素类药物，是人畜通用的最常见抗生素类药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，因此被广泛应用于畜禽、水产等养殖行业中，用于疾病预防和治疗。由于喹诺酮类药物在动物机体组织中的残留，人食用动物组织后喹诺酮类抗生素就在人体内残留蓄积，长期摄入含有喹诺酮类药物残留的动物源食品，对人体有百害而无一利，所以喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的关注。

目前兽药残留的检测方法的前处理过程复杂、耗时较长，且有机试剂用量大，对人员身体及环境危害较大，同时检测成本较高。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种动物源性食品中兽药残留的检测方法，能够提高检测效率，降低检测成本，且能够通过检测确定动物源性食品的安全性。

本申请提供了一种动物源性食品中兽药残留的检测方法，包括：

获取待检测的动物源性食品样品和兽药标准物质集，所述兽药标准物质集包括多种兽药标准物质；

所述对所述动物源性食品样品进行样品前处理包括：向所述动物源性食品样品中加入浓度为1％的第一甲酸-甲醇溶液并进行涡旋浸泡处理后，加入无水硫酸钠并进行涡旋振荡和冷冻离心处理，得到第一上清液，将所述第一上清液进行旋蒸处理并依次加入浓度为0.1％的第二甲酸-甲醇溶液后对所述第一上清液进行复溶处理、加入N-丙基亚乙基二胺固定相吸附剂后对所述第一上清液进行漩涡和离心处理，得到第二上清液，将所述第二上清液作为所述样品溶液；

通过第一甲醇对所述兽药标准物质集进行溶解处理，得到标准储备液；

通过第二甲醇对所述标准储备液中的部分标准储备液进行溶解处理，得到标准中间液；

通过浓度为1％的第三甲酸-甲醇溶液将所述标准中间液制作为标准使用液；

通过空白样品基质将所述标准使用液稀释为多个浓度的标准工作溶液；

基于高效液相色谱-串联质谱仪对所述样品溶液和所述标准工作溶液进行测定，得到以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标的标准曲线；

根据所述标准曲线对待检测的所述动物源性食品样品进行检测，得到目标兽药残留量。

根据本申请实施例的动物源性食品中兽药残留的检测方法，至少具有如下有益效果：本申请通过采用改进的试剂、无水硫酸钠和N-丙基亚乙基二胺固定相吸附剂进行样品前处理，解决了多种兽药标准物质同时提取、净化的难题，简化了样品处理步骤，优化了高效液相色谱-串联质谱仪的检测条件，降低了前处理的耗材成本，缩短了仪器检测时间，具有高效、快速、时间短、成本低、操作简便、环境友好等优点，同时净化效果好，灵敏度高，准确度和精密度均符合多残留分析方法的要求。本申请通过这种检测方法，能够提高检测效率，降低检测成本，且能够通过检测确定动物源性食品的安全性。

根据本申请的一些实施例，所述高效液相色谱-串联质谱仪中的色谱条件如下：

色谱柱：C18(2.1×50mm1.8μm)反向色谱柱；

柱温：40℃；

流速：300uL/分钟；

流动相：流动相A：体积浓度为0.2％的甲酸水溶液，流动相B：体积浓度为0.1％的甲酸甲醇溶液；

所述高效液相色谱-串联质谱仪中的质谱条件如下：

气流量：10.5L/分钟；

压力：35psi；

扫描模式：正离子扫描；

反应模式：MRM。

根据本申请的一些实施例，所述高效液相色谱-串联质谱仪的梯度洗脱程序为：

0分钟，95％流动相A，5％流动相B；

2.0分钟，85％流动相A，15％流动相B；

5.0分钟，60％流动相A，40％流动相B；

7.0分钟，5％流动相A，95％流动相B；

7.1分钟,95％流动相A，5％流动相B；

9.0分钟，95％流动相A，5％流动相B。

根据本申请的一些实施例，所述对所述动物源性食品样品进行样品前处理，得到样品溶液还包括：

向所述动物源性食品样品中加入20mL浓度为1％的第一甲酸-甲醇溶液，将所述动物源性食品样品进行涡旋混匀，并浸泡放置10分钟，得到第一样品处理溶液；

向所述第一样品处理溶液中加入10g的无水硫酸钠，对所述第一样品处理溶液依次进行涡旋混匀、高速振荡提取10分钟、6000转/分钟冷冻离心处理5分钟，得到第一上清液；

将所述第一上清液进行旋蒸处理并依次加入1mL浓度为0.1％的第二甲酸-甲醇溶液后对所述第一上清液进行复溶处理、加入0.2g的N-丙基亚乙基二胺固定相吸附剂后对所述第一上清液进行漩涡和4000转/分钟离心处理5分钟、经过0.22um针式滤头后，得到第二上清液，将所述第二上清液作为所述样品溶液。

根据本申请的一些实施例，将所述标准使用液稀释的所述标准工作溶液的浓度分别为1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、100.0ng/mL。

根据本申请的一些实施例，所述兽药标准物质集为恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星及达氟沙星标准品的至少其中之一。

根据本申请的一些实施例，所述待检测的动物源性食品样品为组织匀浆机匀浆好的牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鱼肉、鸡蛋的其中之一。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

本申请的附加方面和优点结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本申请的实施例提供的动物源性食品中兽药残留的检测方法的流程示意图。

具体实施方式

下面详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，需要理解的是，涉及到方位描述，例如上、下、前、后、左、右等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本申请中的具体含义。

恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星、环丙沙星属于喹诺酮类抗生素药物是一种广谱抗生素类药物，是人畜通用的最常见抗生素类药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，因此被广泛应用于畜禽、水产等养殖行业中，用于疾病预防和治疗。由于喹诺酮类药物在动物机体组织中的残留，人食用动物组织后喹诺酮类抗生素就在人体内残留蓄积，长期摄入含有喹诺酮类药物残留的动物源食品，对人体有百害而无一利，所以喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的关注。

目前兽药残留的检测方法的前处理过程复杂、耗时较长，且有机试剂用量大，对人员身体及环境危害较大，同时检测成本较高。

针对于解决上述问题，本申请提出一种动物源性食品中兽药残留的检测方法，下面结合附图，对本申请实施例作进一步阐述。

参照图1，图1示出本发明实施例提供的一种动物源性食品中兽药残留的检测方法，该方法包括如下步骤：

步骤S110，获取待检测的动物源性食品样品和兽药标准物质集。

兽药标准物质集包括多种兽药标准物质。在一些实施例中，兽药标准物质集包括恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星和环丙沙星。

步骤S120，对动物源性食品样品进行样品前处理，得到样品溶液。

对动物源性食品样品进行样品前处理包括：向动物源性食品样品中加入浓度为1％的第一甲酸-甲醇溶液并进行涡旋浸泡处理后，加入无水硫酸钠并进行涡旋振荡和冷冻离心处理，得到第一上清液，将第一上清液进行旋蒸处理并依次加入浓度为0.1％的第二甲酸-甲醇溶液后对第一上清液进行复溶处理、加入N-丙基亚乙基二胺固定相吸附剂后对第一上清液进行漩涡和离心处理，得到第二上清液，将第二上清液作为样品溶液。

需要说明的是，N-丙基亚乙基二胺，英文名：

N-(N-PROPYL)ETHYLENEDIAMINE，别名：N-丙基乙二胺、N-正丙基乙二胺、N-丙基亚乙基二胺、N-正丁基乙撑二胺。

需要说明的是，本申请采用改进的试剂、无水硫酸钠和N-丙基亚乙基二胺固定相吸附剂进行样品前处理，解决了恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星、环丙沙星同时提取、净化的难题。

步骤S130，通过第一甲醇对兽药标准物质集进行溶解处理，得到标准储备液；

步骤S140，通过第二甲醇对标准储备液中的部分标准储备液进行溶解处理，得到标准中间液；

步骤S150，通过浓度为1％的第三甲酸-甲醇溶液将标准中间液制作为标准使用液；

步骤S160，通过空白样品基质将标准使用液稀释为多个浓度的标准工作溶液；

步骤S170，基于高效液相色谱-串联质谱仪对样品溶液和标准工作溶液进行测定，得到以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标的标准曲线；

步骤S180，根据标准曲线对待检测的动物源性食品样品进行检测，得到目标兽药残留量。

需要说明的是，本申请中，试剂为：除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682-2008中规定的一级水；甲醇(色谱纯)、甲酸(色谱纯)、无水硫酸钠、N-丙基乙二胺固定相吸附剂。试剂配制：浓度为1％的甲酸-甲醇溶液：取1mL甲酸加入到99mL甲醇中，混匀备用；无水硫酸钠：经650℃灼烧4h后，置于干燥器中备用。

本申请通过采用改进的试剂、无水硫酸钠和N-丙基亚乙基二胺固定相吸附剂进行样品前处理，解决了多种兽药标准物质同时提取、净化的难题，简化了样品处理步骤，优化了高效液相色谱-串联质谱仪的检测条件，降低了前处理的耗材成本，缩短了仪器检测时间，具有高效、快速、时间短、成本低、操作简便、环境友好等优点，同时净化效果好，灵敏度高，准确度和精密度均符合多残留分析方法的要求。本申请通过这种检测方法，能够提高检测效率，降低检测成本，且能够通过检测确定动物源性食品的安全性。

可以理解的是，高效液相色谱-串联质谱仪中的色谱条件如下：

色谱柱：C18(2.1×50mm1.8μm)反向色谱柱；

柱温：40℃；

流速：300uL/分钟；

流动相：流动相A：体积浓度为0.2％的甲酸水溶液，流动相B：体积浓度为0.1％的甲酸甲醇溶液；

高效液相色谱-串联质谱仪中的质谱条件如下：

气流量：10.5L/分钟；

压力：35psi；

扫描模式：正离子扫描；

反应模式：MRM。

需要说明的是，试剂制备流程为：流动相A(0.2％甲酸水)：取2mL甲酸加入到适量水中，并定容至1000mL；混匀，经过滤、超声脱气后备用；流动相B(0.1％甲酸甲醇溶液)：取1mL甲酸加入到适量甲醇中，并用甲醇定容至1000mL，混匀，经过滤、超声脱气后备用。

需要说明的是，psi(pounds per square inch)，是一种计量单位。p是指磅力pound，s是指平方square，i是指英寸inch，美国习惯使用psi作单位，意为磅力/平方英寸。把所有的单位换成公制单位就可以算出：1bar≈14.5psi。

需要说明的是，喷雾电压、碰撞能量等质谱参数应优化至最优灵敏度，喷雾电压、碰撞能量等质谱参数的具体优化表格如下：

可以理解的是，高效液相色谱-串联质谱仪的梯度洗脱程序为：

0分钟，95％流动相A，5％流动相B；

2.0分钟，85％流动相A，15％流动相B；

5.0分钟，60％流动相A，40％流动相B；

7.0分钟，5％流动相A，95％流动相B；

7.1分钟,95％流动相A，5％流动相B；

9.0分钟，95％流动相A，5％流动相B。

具体地，梯度洗脱方式洗脱的表格如下：

可以理解的是，对动物源性食品样品进行样品前处理，得到样品溶液还包括：

向动物源性食品样品中加入20mL浓度为1％的第一甲酸-甲醇溶液，将动物源性食品样品进行涡旋混匀，并浸泡放置10分钟，得到第一样品处理溶液；

向第一样品处理溶液中加入10g的无水硫酸钠，对第一样品处理溶液依次进行涡旋混匀、高速振荡提取10分钟、6000转/分钟冷冻离心处理5分钟，得到第一上清液；

将第一上清液进行旋蒸处理并依次加入1mL浓度为0.1％的第二甲酸-甲醇溶液后对第一上清液进行复溶处理、加入0.2g的N-丙基亚乙基二胺固定相吸附剂后对第一上清液进行漩涡和4000转/分钟离心处理5分钟、经过0.22um针式滤头后，得到第二上清液，将第二上清液作为样品溶液。

需要说明的是，材料：一次性针式微孔滤头：0.22μm，有机系。

需要说明的是，本申请所使用到的仪器和设备：高效液相色谱-质谱/质谱仪；分析天平：感量0.001g和0.0001g；多管涡旋振荡提取仪：≥2500r/min；离心机：转速≥8000r/min；旋转蒸发仪。

样品前处理过程具体为：称取已制备好的动物源性食品样品5.0g(精确到0.001g)，于50mL棕色离心管中，加入20mL1％第一甲酸-甲醇溶液，涡旋混匀，浸泡放置10min；加入10g无水硫酸钠，涡旋混匀，高速震荡提取10min；取出后6000r/min冷冻离心5min，第一上清液于150mL棕色鸡心瓶中，于40℃旋转蒸发至近干，准确加入1mL0.1％的第二甲酸-甲醇溶液进行复溶后，加入0.2g N-丙基亚乙基二胺固定相吸附剂后漩涡，并于4000r/min离心5min，上清液过0.22um针式滤头后，做为样品溶液。

可以理解的是，将标准使用液稀释的标准工作溶液的浓度分别为1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、100.0ng/mL。

可以理解的是，兽药标准物质集为恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星及达氟沙星标准品的至少其中之一。

需要说明的是：标准品具体为：恩诺沙星(ENR)标准品(C

标准品配制：四种喹诺酮类标准储备液：分别称取恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CIP)、沙拉沙星(SAR)、达氟沙星(DAN)标准品10mg(精确到0.0001g)，用甲醇溶解，并定容至10mL棕色容量瓶中，既得1mg/mL的标准储备液，冷冻保存；四种喹诺酮类标准中间液：精密移取0.1mL四种喹诺酮类标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀既得10μg/mL的标准中间液，冷冻保存；四种喹诺酮类标准使用液：精密移取0.1mL四种喹诺酮类标准中间液于10mL容量瓶中，用甲酸-甲醇溶液(1％)稀释并定容至刻度，摇匀既得1μg/mL的标准使用液，冷冻保存；四种喹诺酮类系列标准工作液：分别精密移取一定量的四种喹诺酮类标准使用液于10mL容量瓶中，用空白样品基质稀释并定容至刻度；配成最终浓度为1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、100.0ng/mL的系列标准工作溶液，供高效液相色谱-质谱/质谱仪测定，并制备标准曲线。

可以理解的是，待检测的动物源性食品样品为组织匀浆机匀浆好的牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鱼肉、鸡蛋的其中之一。

需要说明的是，其它他动物源性食品可参照执行，而不局限于本申请实施例。

需要说明的是：标准曲线的制作：系列标准工作溶液由低到高浓度依次进样检测，以峰面积为纵坐标-浓度为横坐标作图，得到标准曲线回归方程；样品溶液的测定：待测溶液中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，浓度超过线性范围的样品则应稀释后重新进行分析；空白试验：不称取试样的情况下，按样品前处理的步骤做空白试验。

需要说明的是，结果计算和表述：按如下计算公式计算试样中4种喹诺酮的含量：X＝C×V/m×1000/1000，其中X表示兽药标准物质集中四种喹诺酮的残留量，单位为μg/Kg；V表示最终定容体积(mL)，m表示样品称样量(g)，C表示标准曲线中查得的四种喹诺酮含量(ng/mL)，1000表示单位换算系数。最终的计算结果需扣除空白值，测定结果保留两位有效数字。精密度：在重复条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过其算数平均值的10％。

验证数据：配制各种浓度的溶液，由高至低依次进样，计算每种浓度的信噪比，以信噪比约为3：1的浓度确定为检测限，记录色谱图。通过试验可知本标准动物源性食品取样量为5.0g时，关于环丙沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、达氟沙星检出限对应的表格如下：

线性和范围：分别配制环丙沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、达氟沙星溶液浓度为定量限浓度至对应对照浓度的120％的一系列溶液，配制6个浓度的溶液，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果如下表格所示：

线性相关性0.99651＞0.995符合要求，精密度：两个不同的实验员，采用本标准分别制备6份试样，测定环丙沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、达氟沙星的含量，统计检测数据，计算精密度结果如下：

含量准确度：分别测定加标不同浓度的环丙沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、达氟沙星含量，不同浓度标准溶液的浓度应包含三个低、中、高浓度，计算含量回收率，结果如下表格所示：

通过低浓度、中浓度和高浓度这三个浓度的加标实验，回收率均在80.0％～120.0％，符合可接受的标准范围。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本申请的保护范围。

尽管已经示出和描述了本申请的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本申请的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由权利要求及其等同物限定。