一种新型有核红细胞人造血液的培养方法

技术领域

本发明涉及人造血技术领域，具体是一种新型有核红细胞人造血液的培养方法。

背景技术

人类血型系统中包括ABO血型和Rh等血型有三十多种血型系统。目前，医疗血液需求日益增加，血液供应还是以志愿者捐献为主,常有细菌病毒污染。人类全血是非常复杂的，人造全血几乎是不可能的。人造血的实现方式有两种：第一种是指生物合成具有完全生物学功能的红细胞、白细胞和血小板；另一种是人工合成具有红细胞或血小板主要功能的替代物。人造血因为时程长成本过高还在实验室阶段。研究血液红细胞和血小板形成机制和功能，简化人造血的制备成了当今最紧迫的课题。

针对上述问题，我们提供了一种新型有核红细胞人造血液培养方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型有核红细胞人造血液的培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种新型有核红细胞人造血液的培养方法，具体包括如下步骤：

步骤一：无菌操作下，用10支15mL真空EDTA-K2抗凝采血管均采孕妇(150天)外周血全血10X10mL，摇匀以避免溶血；

步骤二：将步骤一的采血管轻轻装入离心杯，配平后，4℃，2000r/min离心10min，弃上清液，用10mL培养液将每个采血管中的细胞沉淀物分别转入离心管中，充分混匀后，4℃孵育10min，将8mL细胞分离液分别缓缓加入10个离心管底部，将上述血细胞培养液分别转入细胞分离液离心管中，室温1000r/min离心15min，收集红细胞层，用Hank's液5mL将每个采血管中的细胞沉淀物分别转入离心管中，离心操作后，洗涤细胞；分别加入5mLPBS液，轻轻混匀，室温下，500r/min离心10分钟，弃上清液，然后用10mL培养液混匀细胞，4℃孵育10min；

步骤三：将CD71单抗包被的磁珠100μL分别加入步骤二的细胞离心管中，4℃孵育30min，孵育完成后，加入40mL缓冲液，离心弃上清，加入缓冲液5mL重悬红细胞；

步骤四：将分离柱置于磁力架上，先用2mL缓冲液平衡柱子，然后加入细胞悬液，待分离柱中的细胞悬液微量时，再加入2mL缓冲液洗涤分离柱3次；

步骤五：取下分离柱，放置到新的15mL离心管中，加入2mL缓冲液，然后将细胞吹下，然后用10mL培养液混匀细胞，4℃孵育10min；

步骤六：将步骤5所得细胞经CD71单抗包被的磁珠100μL处理，重复纯化步骤3-5，收集的细胞经四重形态学标准鉴定为有核红细胞，得到种子细胞；

步骤七：将种子细胞经悬浮培养体系体外培养扩增得到免脱核的有核人造血红细胞，即完成新型人造血液的制备。

作为本发明进一步的方案：所述步骤二的培养液配方包括：500mL 1×PBS、2.5gBSA、0.5mol/L EDTA(pH值8.0)、5％胎牛血清和0.2％葡萄糖。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中的分离液包括：9％的聚蔗糖20份、质量分数为33.9％的泛影葡胺11份。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中离心温度为4℃，保持2000r/min离心10min。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中离心操作包括室温状态下：500r/min离心10分钟。

作为本发明再进一步的方案：所制备的新型人造血液的有效成分是有核红细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明富集有核红细胞的方法是孕妇血液通过密度梯度离心法和重复免疫磁珠法获得有核红细胞。从细胞增殖情况来看，有核红细胞可以在适当条件下复制扩增，形成更多的有核红细胞，随着培养天数的增加，细胞呈增加趋势，到第5天达高峰，之后趋于平稳；从细胞形态学来看，细胞培养的前几天，细胞保持在有核红细胞的状态。有核红细胞经过适当培养，可以脱核形成无核红细胞，或叫做成熟红细胞，培养至11d时，几乎全部分化为脱核的红细胞，整个培养体系的脱核率达到90％以上，同时生产几乎与去核红细胞等量的血小板。有核红细胞和去核红细胞血红蛋白含量检测表明，红细胞脱核前后，血红蛋白质量和功能没有明显变化，意味着有核红细胞和去核红细胞有同样的输氧功能。同时说明了有核红细胞，去核红细胞和血小板的关系，有核红细胞可以在血液系统复制增生，缓解造血功能，血小板变成了可有可无的成分。尽管红细胞体外扩增和脱核能力以及速度有限，但直接将有核红细胞用于人工输血，保留红细胞核可以保留红细胞在血液系统的复制增生功能，又可以在人造血红细胞培养过程中免除脱核环节，加大造血速度和降低造血成本，解决人造血的困境，成为人造血红细胞方面的重大革新。

附图说明

图1为有核红细胞经脱核形成去核红细胞和血小板的示意图。

图2为有核红细胞，无核红细胞和血小板数量示意图。

图3为红细胞培养扩增情况示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1.1材料

实验仪器与试剂：CO

1.2方法：经阿斯克立普药业伦理委员会批准，采用孕妇(150天)外周血为原料(献血者均知情同意)，分离出有核红细胞，以此为种子细胞，经悬浮培养体系体外培养扩增，再进行脱核形成去核红细胞和血小板，有核红细胞和去核红细胞经血红蛋白浓度的检测判断有核和去核红细胞功能的异同。

主要观察指标:1)细胞生长曲线；2)细胞形态学；3)有核红细胞脱核率；4)血红蛋白浓度。

实施例1：孕妇外周血中胎儿有核红细胞的分离方法，包括以下步骤：

(1)无菌操作下，用10支15mL真空EDTA-K2抗凝采血管均采孕妇(150天)外周血全血10X10mL，摇匀以避免溶血。

(2)将上述采血管轻轻装入离心杯，配平后，4℃，2000r/min离心10min，弃上清液，用培养液10mL[培养液配方：500mL1×PBS+2.5gBSA+0.5mol/LEDTA(pH值8.0)+5％胎牛血清和0.2％葡萄糖]将每个采血管中的细胞沉淀物分别转入离心管中，充分混匀后，4℃孵育10min。将细胞分离液(细胞分离液成分：9％的聚蔗糖20份、质量分数为33.9％的泛影葡胺11份)8mL分别缓缓加入10个离心管底部，将上述血细胞培养液分别转入细胞分离液离心管中，室温1000r/min离心15min，收集红细胞层，用Hank's液5mL将每个采血管中的细胞沉淀物分别转入离心管中，室温500r/min离心10分钟，洗涤细胞；分别加入5mLPBS液，轻轻混匀，室温下，500r/min离心10分钟，弃上清液，然后用10mL培养液混匀细胞，4℃孵育10min。

(3)将CD71单抗包被的磁珠(CD71microbeads)100μL分别加入上述细胞离心管中，4℃孵育30min。孵育完成后，加入40mL缓冲液，4℃，2000r/min离心10min，弃上清；加入缓冲液5mL重悬红细胞；

(4)将分离柱置于磁力架上，先用2mL缓冲液平衡柱子，然后加入细胞悬液，待分离柱中的细胞悬液微量时，再加入2mL缓冲液洗涤分离柱3次；

(5)取下分离柱，放置到新的15mL离心管中，加入2mL缓冲液，然后将细胞吹下，然后用10mL培养液混匀细胞，4℃孵育10min。

(6)将步骤5所得细胞经CD71单抗包被的磁珠(CD71microbeads)100μL处理，重复纯化步骤3-5，收集的细胞经四重形态学标准鉴定为有核红细胞。所搜集的有核红细胞继续用于下述研究。

实施例2：上述所得有核红细胞，用于有核红细胞的复制培养和去核培养。

(1)基础培养基是在M-199中加入体积分数为3％胎牛血清、2％人AB血浆、10mg/L胰岛素、1％青链霉素等成分。

将上述步骤(6)中所获有核红细胞，在1000rpm条件下离心3min，弃去上清液，加6mL培养基(基础培养基加3IU/mL肝素、200mg/L人转铁蛋白、3IU/mL红细胞生成素、10μg/L干细胞因子、1μg/L白细胞介素)混合均匀。在1000rpm条件下离心3min，弃去上清液，加10mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中，在37℃，含体积分数为5％CO2的培养箱中培养，每天定时在倒置显微镜下进行细胞计数，绘制细胞生长曲线，了解细胞生长情况。

(2)第四天，在倒置显微镜下进行细胞计数后，将所有细胞悬液1000rpm离心5min，弃去培养上清，用PBS润洗细胞2次。加1mL消化液(0.25％Trypsin-0.02％EDTA)于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，待细胞大部分脱落，加3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，用PBS润洗细胞2次，加PBS至10mL，分取0.150ml用于血红蛋白含量测试(有核红细胞样品)。取样品进行细胞涂片，瑞氏-吉姆萨染色，显微镜下观察并拍照。

(3)1000rpm离心5min，弃去PBS上清液后，加10mL培养液(基础培养基加1000mg/L人转铁蛋白)后吹匀细胞，加入新培养瓶中，置于培养箱中培养再8天，每两天定时在倒置显微镜下进行细胞计数，绘制细胞生长曲线，了解细胞生长情况。

(4)第11天，在倒置显微镜下进行细胞计数后，将所有细胞悬液1000rpm离心5min，弃去培养上清，用PBS润洗细胞2次。加1mL消化液(0.25％Trypsin-0.02％EDTA)于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，待细胞大部分脱落，加3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，用PBS润洗细胞2次，加PBS至10mL，分取0.150ml用于血红蛋白含量测试(去核红细胞样品)。取样品进行细胞涂片，瑞氏-吉姆萨染色，显微镜下观察并拍照。所收集的

实施例3：上述所得有核红细胞和去核红细胞，用于血红蛋白的测试和比较。

(1)将上述所取0.15mL样品，加入5mL离心管中。

(2)加入0.1mL红细胞裂解液(Sigma-Aldrich)，轻轻吹打混匀，在冰上裂解4-5min，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。分别加入0.4mLPBS，摇匀备用。

(3)用PBS溶液将血红蛋白标准稀释成不同的浓度：0，5，10，15，20，25，30mg/L，各取0.15mL，分别加入5mL离心管中，并分别加入0.1mL红细胞裂解液和0.4mLPBS，摇匀备用。

(4)将上述步骤2和3的样品，分别加入2.0mL染色剂(微量游离血红蛋白(FHb)测定试剂盒(Sigma-Aldrich，Tracefreehemoglobinassaykit)，混匀，37℃水浴20分钟，用510nm，1cm光径，测定各管OD。计算样品的血红蛋白浓度。

血红蛋白(mg/L)＝126.03X(测定OD值-空白OD值)+3.5041。

2.结果

有核红细胞从孕妇血中经离心分离和双重磁珠分离纯化获得，经悬浮培养体系复制扩增形成大量的有核红细胞，这些有核红细胞经脱核形成去核红细胞和血小板(如图1)。有核红细胞，去核红细胞和血小板经细胞形态学得到确认，细胞复制扩增和脱核情况以及血红蛋白功能检测情况如图所示(图2，图3，表1)。培养至11d时，几乎全部分化为脱核的红细胞。整个培养体系的脱核率达到90％以上。

通常血红蛋白存在于红细胞中，可以用氰化高铁血红蛋白HiCN测定法测定红细胞中血红蛋白含量，但是本专利所制备的红细胞浓度较低，血红蛋白的数量比正常血液要低很多，不适宜用HiCN测血红蛋白浓度。本专利通过微量红细胞裂解释放出血红蛋白，采用游离血红蛋白(plasmafreehemoglobin，FHb)法测定样品中血红蛋白的量。该法回收率是102％，最底检出线是3.6mg/L，检测范围是3.6-200mg/L。

表一：

3.结论：

本发明富集有核红细胞的方法是孕妇血液通过密度梯度离心法和重复免疫磁珠法获得有核红细胞。从细胞增殖情况来看，有核红细胞可以在适当条件下复制扩增，形成更多的有核红细胞，随着培养天数的增加，细胞呈增加趋势，到第5天达高峰，之后趋于平稳；从细胞形态学来看，细胞培养的前几天，细胞保持在有核红细胞的状态。有核红细胞经过适当培养，可以脱核形成无核红细胞，或叫做成熟红细胞，培养至11d时，几乎全部分化为脱核的红细胞，整个培养体系的脱核率达到90％以上，同时生产几乎与去核红细胞等量的血小板。有核红细胞和去核红细胞血红蛋白含量检测表明，红细胞脱核前后，血红蛋白质量和功能没有明显变化，意味着有核红细胞和去核红细胞有同样的输氧功能。同时说明了有核红细胞，去核红细胞和血小板的关系。

本发明研究结果为人造血提供了突破性的进展。血液可以有有核红细胞，而且有核红细胞可以在血液系统复制增生，缓解造血功能，血小板变成了可有可无的成分。尽管红细胞体外扩增和脱核能力以及速度有限，但是避免脱核环节，直接将有核红细胞用于人工输血，保留红细胞核可以保留红细胞在血液系统的复制增生功能，又可以在人造血红细胞培养过程中免除脱核环节，加大造血速度和降低造血成本，解决人造血的困境，成为人造血的重大技术革新。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。